무기 성포염은 세균성 스트레스 반응의 핵심 요소입니다. 그러나 박테리아에서 폴리P를 추출하고 측정하는 오래된 방법은 복잡하고 노동 집약적입니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 다른 세균성 종에서 폴리P 수준의 빠르고 민감하며 저렴한 정량화를 허용한다는 것입니다.
절차는 아리아 Pokhrel에 의해 입증될 것입니다, 내 실험실에서 학부 학생. 시작하려면, 동요없이 하룻밤 37섭씨에서 cystine없이 영양 효소 유도 매체에서 유산 균 재자궁 을 성장. 원심분리기 1밀리리터는 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에서 이 야간 배양의 밀리리터로, 세포 단백질의 총 50~100마이크로그램을 산출하기에 충분한 세포를 수확합니다.
셀 펠릿에서 상체를 완전히 제거한 다음 250개의 마이크로리터 GITC 리시스 버퍼를 추가하고 소용돌이에 의해 다시 중단합니다. 세포를 lyse 하는 10 분 동안 섭씨 95도에서 배양. lysate를 섭씨 80도에 보관하십시오.
먼저 GITC 리시스 버퍼에서 BSA 밀리리터당 0, 1, 2 및 4 밀리그램을 포함하는 BSA 표준을 준비합니다. Aliquot 5 마이크로 리터의 해동, 잘 혼합 된 세포 lysates 및 BSA 표준의 5 마이크로 리터 는 명확한 96 웰 플레이트에 우물을 분리합니다. 각 웰에 브래드포드 시약 195 마이크로리터를 추가하고 플레이트 리더의 595 나노미터에서 흡광도를 측정합니다.
원고에 설명된 바와 같이 BSA 표준 곡선과 비교하여 각 우물의 단백질 양을 계산합니다. 각 샘플에서 단백질의 총 양을 결정하기 위해 결과 값을 05로 곱합니다. 폴리인산염 추출을 시작하려면 각 GITC 용해 시료에 95%에탄올의 250마이크로리터를 추가하고 소용돌이를 혼합합니다.
파이펫이 혼합물은 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 배치된 실리카 멤브레인 스핀 컬럼에 배치됩니다. 원심분리기 는 16, 30초 동안 100g. 흐름을 버리고 삼염산염, 염화나트륨, EDTA 및 에탄올 혼합물의 750 마이크로리터를 추가합니다.
원심분리기는 16, 100 gs에서 30초 동안. 흐름을 버리고 스핀 컬럼을 16, 100 gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 컬럼을 놓습니다.
50 밀리머 pH 8 개의 트리스 염산염의 150 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. Elute 폴리P는 2 분 동안 8, 000g에서 원심 분리에 의해. 먼저 50 밀리머 pH 8 개의 트리스 염산염에서 0, 5, 50 또는 200 마이크로 몰러 칼륨 칼륨을 포함하는 표준을 준비하여 시작합니다.
각 인산염 표준의 100 마이크로리터와 추출된 폴리P 샘플 100마이크로리터를 투명한 96웰 플레이트의 별도 우물로 추출했습니다. 샘플당 5X ScPPX 반응 버퍼 30마이크로리터, 19마이크로리터 물, 정제된 ScPPX의 마이크로리터 1개를 함유한 마스터 믹스를 준비합니다.
그리고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. 검출 당일, 검출 용액 의 9.12 밀리리터에 1개의 어금니 아스코르브산 88밀리리터를 혼합하여 검출 용액의 신선한 작업 재고를 준비하고 사용하기 전에 실온에 도달할 수 있도록 합니다. 96 웰 플레이트의 각 샘플 및 표준에 50 마이크로리터의 검출 솔루션을 추가합니다.
색상 개발을 허용하려면 실온에서 플레이트를 약 2분 동안 배양합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 882 나노미터에서 흡광도를 측정하고 칼륨 인산염 표준 곡선에 비해 각 시료의 인산염 농도를 계산합니다. 그런 다음 각 세포에서 폴리P 유래 인산염의 나노몰로 인산염 농도를 변환하고 원고에 설명된 바와 같이 세포 폴리P 함량을 총 세포 단백질로 정상화한다.
LB에서 자란 그람 음성 박테리아인 야생형 대장균은 폴리P를 생산하지 않았습니다. 그러나 MOPS에서 재배 될 때, 총 단백질의 밀리그램 당 약 192 나노 몰 폴리P를 생산. 폴리P 키나아제가 부족한 대장균 델타 ppk 돌연변이는 어느 매체에서도 폴리P를 생산하지 않았다.
외후포인파아제가 부족한 델타 ppx 돌연변이체는 야생형과 거의 동일한 양의 폴리P를 생산했습니다. 그리고 인산염 수송에 결함이 있는 델타 포B 돌연변이체는 야생형보다 훨씬 적은 폴리P를 생산했다. 야생형 L.reuteri는 MEIC 배지에서 하룻밤 사이에 재배된 그램 양성 박테리아로, 총 단백질의 밀리그램당 약 51나노몰 폴리P를 축적하였다.
폴리P 키나아제가 부족한 L.reuteri ppk1 null 돌연변이에는 이 금액의 절반 미만이 포함되어 있습니다. ppk1 null 돌연변이체에서 폴리P의 이러한 존재는 아마도 두 번째 폴리P 키나아제를 포함하는 L.reuteri 때문일 것이다. 진균 세균염 균주 SMR 5, 총 단백질의 밀리그램 당 약 141 나노몰폴리P 축적에 에탄올의 부재에 하트만드 본트 배지에서 재배.
에탄올 치료는 세 배 증가를 초래했다. 이 절차에 따라 아크릴아미드 젤 전기포광은 폴리P 사슬 길이의 차이를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 일반적인 실수를 피하십시오.
마이크로티터 플레이트 우물에서 거품이 발생하지 않도록 하고 컬럼에서 미세후포 튜브로 전환할 때 샘플을 적절한 튜브로 옮기는 것을 피하십시오. GITC와 강한 산으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며, 적절한 보호 장비는 항상 이 절차를 수행하는 동안 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
