이 작품은 R21 AI113000 (WSM)와 R01 AI123392 (YF)는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부분적으로 부여 지원되었다.

실험에 사용 된 모든 동물은 앨 건강 네트워크 / 앨 가수 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 검토 및 승인 프로토콜에서 앨-가수 연구소에서 동물 시설에 수용되었다. 1. 콜라게나로 흉선 소화 <ol><li> 수확 흉선 분비. <ol><li> 흉선을 수확 3-5 주령 C57BL6 / J의 이산화탄소에 마우스 (CO 2) 챔버를 안락사. 구체적으로, 3 ~ 5 분 동안 CO 2 유도에서 챔버에 마우스를 배치하고 심장 또는 호흡 정지를 확인하여 죽음을 확인합니다. </li><li> 그 뒷면에있는 시체를 놓고 70 % 에탄올로 몸을 젖은. 피부를 통해 자사의 복부에 날카로운 직선 해부 가위로 작은 수평 절개를합니다. 이 밖에 내부에 켜져 있도록 양쪽 끝 (머리와 다리)에 피부를 당겨. </li><li> 해부 가위 바로 아래에 수평 절단합니다가장 낮은 리브와 옆으로 다이어프램을 잘라. 겸자와 칼 모양의 과정을 잡고 양쪽에 최대 진행 리브의 중간을 잘라. 흉선은 명확하게 볼 수 있도록 갈비 / 흉골을 당깁니다. 참고 : 흉선은 직접 심장의 상단에 놓여 두 엽으로 구성되어 있으며 흰색 반투명​​ 색이다. </li><li> 부드럽게 특종 및 결합 조직 및 세척 용액에 전송 오프 흉선 로브를 당겨, 곡선 집게를 사용하여 (물질의 목록 참조). </li></ol></li><li> 9 ml로 RPMI-1640 (로스웰 파크 메모리얼 연구소 매체-1640) 0.025 ㎎ / ㎖ 정제 된 콜라겐, 10 mM의 HEPES [4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산, 0.2 ㎎ / ㎖을 혼합하여 소화 용액을 준비 50 ㎖의 원심 분리기 튜브의 DNase I. 사용할 때까지 37 ° C의 물을 욕조에서 소화 용액을 유지합니다. 참고 제조 소화 용액의 양이 하나 5 ㎖ 폴리스틸렌 원형 - 함께 배양 할 수 최대 5 성인 마우스 thymi, 충분바닥 튜브. </li><li> 5-6 ml의 RPMI-1640을 함유 한 60mm의 조직 배양 접시에 흉선 전송. </li><li> 림프구가 유출 할 수있는 작은 조각으로 28 G 인슐린 주사기 바늘 (약 1mm 3 사각형)과 흉선을 해부하다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫으로 배양 접시에 RPMI-1640과 흉선 조각을 씻어. 접시를 기울여과 흉선 조각이 바닥에 정착 할 수 있습니다. 천천히 대기음과 유리 피펫을 사용하여 RPMI-1640 상층 액을 버린다. 이 솔루션은 덜 불투명 때까지 유리 피펫으로 4-5 회 5-6 ml의 RPMI-1640이 세척 단계를 반복합니다. 참고 : 유리 피펫은이 단계에서 권장, 흉선 조각이 흉선 조직의 과도한 손실이 발생, 플라스틱에 집착하는 경향이 있기 때문이다. 절차의 나머지, 플라스틱 피펫을 사용합니다. </li><li> 단계 1.5에 기재된 바와 같이 최종 헹굼 후, 상층 액을 제거한다. 3 ㎖ 소화 솔루션을 추가하고 5 ㎖의 둥근 바닥 페이지로 흉선 조각과 솔루션을 전송olystyrene 튜브. </li><li> 튜브의 회전에 튜브를 넣고 12 rpm의 회전 속도로 6 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 배양 후, 흉선 단편은 중력에 의해 상기 튜브의 하단에 정착하자. 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 수집하고 세척 용액 10 ㎖로 50 ml의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 10 mL의 세척 용액으로 세포를 재현 탁. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 반복 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 5 ml의에서 흉선 조각에 두 번 1.6-1.8 단계를 반복합니다. 같은 50 ML 튜브에 뜨는 수영장. 주 : 원심 번째 및 세 번째 세척 필요는 없다. </li><li> 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에 튜브 및 전송에 남아있는 조각을 무너 뜨리는 최종 소화 한 후, 최대 피펫 2 ml의 플라스틱 혈청 학적 피펫 아래. </li><li> 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에서 50 ㎖ 튜브 세척 buffe 10ml에 뜨는, 재현 탁 대기음100 μm의 셀 스트레이너를 통해 연구 및 필터. 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 불연속 밀도 기울기와 TEC는 2. 심화 <ol><li> 2.4 mL의 밀도 구배 배지 (물 iodixanol의 V / w 60 %) 및 ​​9.6 mL의 세척 용액을 혼합하여 21 % 밀도 구배 용액을 제조 하였다. </li><li> 2.5 ml의 세척 버퍼에 5 분,에 resuspend 300 XG에 단계 1.11에서 50 ㎖ 수집 관에서 해리 흉선 세포를 원심 분리기. </li><li> 세포 현탁액에 20 ml의 RPMI-1640 배지를 추가합니다. </li><li> 전자 피펫으로 10 ㎖의 혈청 학적 피펫에서 21 % 밀도 구배 용액 12 ml를 채 웁니다. 50 mL의 원심 분리 튜브 함유 세포 하단의 혈청 피펫의 선단을 배치하고, 밀도 구배 용액이 중력을 통해 상기 튜브의 하단에 배수 할 수있다. <ol><li> 부드럽게 밀도가 다른 두 층을 생성 완료 피펫에서 밀도 구배 용액을 배출. </li></ol></li><li> 600 XG FO에서 원심 분리기R 스윙 버킷 로터에서 실온에서 20 분. 가장 느린 수준에서 감속 속도를 설정합니다. </li><li> 새로운 50 ㎖ 튜브에 상단 층과의 계면을 전송. 참고 : 열팽창 계수의 차이의 대부분은 인터페이스에 유지됩니다. 림프구는 원심 분리 후 튜브의 바닥에 침전됩니다. 이들 세포는 다른 용도로 사용되는 경우, 3 회 20 ㎖ 세척 용액 펠렛을 헹군다. 세척 완충액 10ml에 세포를 재현 탁. </li><li> 4 ° C에서 6 분 동안 400 XG에 단계 2.6 및 원심 분리기 튜브에 40 ml의 세척 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 피펫으로 상층 액, 흡인를 제거합니다. </li><li> 단계 2.7에 기재된 바와 같이 세척하고, 흡인 2 회 더 반복한다. </li><li> 세척 용액 2 ㎖에 재현 탁하고는 혈구 세포 계산. </li></ol> FACS 3. 분리의 열팽창 계수의 차이 <ol><li> 세정액 및 전송로 1 × 106 세포 / 100 ㎕의 농도로 290 단계에서 세포를 조절(유동 분류기의 지침에서 권장하는 폴리 프로필렌 또는 폴리스티렌) 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 세포. </li><li> 1 × 6 셀 당 2 μL 방지 Fc 수용체 IgG를 추가하고 10 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> (150 희석, 샘플 당 10 μl의 1) 및 안티는 EpCAM 항 CD45 추가 (1 : 100 희석, 샘플 당 10 μL) 항체 이상 20 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 4 ° C에서 6 분 동안 400 XG에 2 ml의 세척 용액을 원심 분리로 세포를 씻으십시오. 피펫으로 뜨는을 대기음. </li><li> 1 ㎖의 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 재현 탁. </li><li> 100 μm의 스트레이너를 통해 필터링합니다. </li><li> 정렬 악기의 셀을 적용합니다. 사이드 산란광 (SSC) / 전방 산란 광 (FSC) 패널 (죽은 세포), (13)을 정렬 CD45-는 EpCAM +의 선택 인구에 다음 게이트에서 가장 작은 세포를 제외한 림프구와 TEC 인구를 선택합니다. </li></ol> 4. GTEC / EAK 집계의 eneration 참고 : 시약 준비 및 층류 후드 혼합 셀을 포함하는 단계를 수행합니다. <ol><li> 멸균 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 안티 그의 태그 IgG를 4 μL, 안티는 EpCAM IgG의 8 μL 및 PA / G 2.6 μL를 혼합하여 PA / G 어댑터 착물을 준비하고, 5 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 세척 용액 및 피펫 낮은 증발, 96 웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트 잘 하나에 100 μL와 5 × 4 세포 / ml로 단계 3.7에서 분류 열팽창 계수의 차이를 조정합니다. 세포에 14.6 μl의 PA / G 어댑터 단지를 추가합니다. 4 ℃에서 20 분 동안 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다. </li><li> 200 ㎕를 세척 용액으로 한 번 씻으십시오. 6 분 동안 400 XG에 접시를 원심 분리기. 마이크로 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 200 ㎕의 10 % 자당 용액으로 한 번 씻으십시오. 6 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 마이크로 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 30 μl의 10 %의에서 재현 탁 세포물론 당 terile 자당 솔루션입니다. </li><li> EAKIIH6 10 μL (7.5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 실온에서 5 분 동안 품어. </li><li> 가 TEC 혼합물에 EAK16-II의 20 μL (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 겔화을 시작하는 시스템에 완전 배지 100 μl를 추가합니다. 실온에서 15 ~ 20 분 동안 플랫폼 통에 접시를 놓습니다. </li><li> 37 ° C에서 인큐베이터에있는 접시를 놓고 5 % CO 2. 2-4 시간 후, 전체 매체의 다른 100 μl를 추가합니다. </li><li> 사용할 때까지 매일 매체를 변경합니다. <ol><li> 대기음 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 웰의 벽에 피펫 팁을 배치하여 예열 배지 100 ㎕를 추가 겔을주지 않고 표면으로부터 배지 100 ㎕. </li></ol></li></ol> 가 TEC / EAK 집계 5. 특성 <ol><li> 생체 내에서 TEC / EAK 집계의 기능을 조사하기 위해, 무 흉선 누드의 신장 캡슐에서 O / N 문화와 이식 후 TEC / EAK 하이드로 겔을 수집마우스, 이전 절차 11,14 설명 사용. </li><li> 4~6주 안티 CD4의 칵테일 이식 얼룩을 게시 누드 마우스 -CD8, -CD45에서 EDTA를 함유 혈관으로 50 ~ 100 ㎕의 혈액 샘플을 채취하여 주변의 T 세포의 발달을 모니터링 및 -CD3 (12)는 항체. </li><li> 단일 세포 분석 소프트웨어 (12)를 사용하여 유동 세포 계측법으로 말초 혈액 백혈구 (FCM)에 T 림프구의 백분율을 분석한다. </li></ol>

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Authors declare no conflict of interest.

열팽창 계수의 차이가 흉선 기질의 주된 인구이며 흉선 샘의 구조와 기능에 필수적인 역할을하지만, 이들은 총 흉선 세포 수의 약 0.1 ~ 0.5 %를 차지한다. 그들은 또한 세포 사멸의 높은 비율이 때때로 즉, 치료는 세포 외 기질 (ECM)의 열팽창 계수의 차이를 해리, 콜라게나 제 소화 다음 관찰 깨지기 세포이다. 그들의 희귀 (~ 20 만 마우스의 흉선 당)과 취약성은 그것을 열팽창 계수의 차이를 분리하는 어려운 작업을했다. TEC 분리 고도로 정제 된 콜라겐 최근의 활용은 크게 효소 소화 15-19 다음 생균의 수를 증가하고있다. 항체 다량 세포 표면 라벨링 및 이벤트에 필요한 과도 번호 FACS에 의해 수집 될 필요가있다 그러나 열팽창 계수의 차이를 매우 작은 숫자들이 분석 및 분리를위한 중요한 과제로 남아. 항체 복합체 동안D 자기 비드 기술은 CD45 + 흉선 세포를 고갈하는 데 사용할 수 있습니다, 그들의 큰 수량이 장기적으로는 경제적으로 금지 렌더링합니다. 우리는 효과적으로 간단한 한 단계 밀도 기울기 원심 분리와 열팽창 계수의 차이를 15 ~ 20 시간을 풍요롭게 할 수 있었다. iodixanol 밀도 구배 매질의 삼투압 속성들은 모양, 크기 및 밀도를 20 ~ 22에 기초하여 세포의 분리를 허용한다. 열팽창 계수의 차이의 순도 및 수율은 사용되는 밀도 구배 배지의 비율에 의해 영향을받는 것을 주목해야한다. 밀도 구배 매질의 낮은 비율 (18~20% V를 / V) 인터페이스에서의 TEC는 고순도이지만 낮은 수율을 초래한다. 반대로, 높은 경우 iodixanol 농도 (22 % V / V)를 사용하고, 흉선 세포의 큰 열팽창 계수의 차이가 양의 낮은 비율로 회수 할 수있다. iodixanol의 농도는 실험의 목적에 기초하여 조정되어야한다. TEC는 순도가 크게 밀도 구배 용액의 유용성이 개선되고 있지만, 그것은 shoul상부 층과의 계면에서 수집 한 세포 정지 (도 1) CD45 + 세포의 비교적 높은 비율을 포함하는 것이 강조 될 거라고. 이러한 추가 과정은 세포의 일부가 손실 될 더 많은 시간을 필요로 수 있지만, 이에 만 TEC 인구가이 실험에서와 같이 요구되는 경우, 셀 정렬은 중요 할 것이다. 본능적 장기 안감 단일 또는 다중 층으로 배열 된 상피 세포의 대부분과는 달리, TEC는 그들의 생존 및 기능에 필수적인 흉선 간질, 3-D 구성에서 구성되어있다. PA / G : αEpCAM 어댑터 착체 자기 조립 EAK 하이드로 젤 시스템 트라이 αH6 분자에 의해 매개되는 3 차원 TEC 응집체의 형성을 용이하게한다. 참고로하여 농도와 EAK16-II / EAKIIH6 올리고, 기공률 및 하이드로 겔의 농도의 비를 미세 조정하는 영양소의 유동 및 흉선 세포의 이동을 허용하도록 조정될 수있다. 사실, functiona리터의 T 세포는 TEC / EAK 복합 이식 무 흉선 누드 마우스에서 발생했다. 이 EAK 하이드로 젤 시스템에서의 단점은 이러한 현재의 프로토콜과 함께, 특정 셀 조성물가 지정된 영역에 국부적 수 없다는 것이다. 물리적 환경에서 흉선은 TEC는 특정 유형의가 상주하는 두 가지 구획, 수질의 피질에서 cTECs 및 mTECs로 구성되어 있습니다. 우리의 시스템은 여기에 설명과 함께, cTECs 및 mTECs 모두는 EpCAM, 일반 상피 마커로 표시되어 있습니다. 그러므로, 형성된 겔의 응집체 TEC는 두 아형을 포함하는 것으로 추측된다. cTECs 및 mTECs 일반적인 bipotent의 TEC 전구 세포에서 유래하지만, T 세포의 개발에 자신의 역할을 명확하게 특징이다. 외피는 흉선 미성숙 전구 세포 입력 흉선에서 상기 제 1 영역이고, 양의 선택은 장소 (23) 걸린다. 그런 다음 선택한 셀은 w를 통해 수질 영역으로 이동하고 mTECs와 상호 작용HICH 자기 반응성 세포는 음의 선택 (24)에 의해 제거된다. 또한, 유전자의 25 % 차등 cTECs mTECs과 25 사이에 표현되어 설명되었다. 이러한 연구 결과는 T 세포의 발전 효율을 높이기 위해 TEC 서브셋의 응집을 촉진의 중요성을 강조한다. 한 가지 가능한 방법은 cTECs 안티 사이토 케라틴 8 및 mTECs 안티 사이토 케라틴 5로 cTECs 또는 mTECs 중 특정 표면 분자를 대상으로 서로 다른 항체를 사용하는 것입니다. 미래의 임상 적용의 관점에서, 생분해 성 하이드로 겔에 내장 된 TEC 클러스터는 세 개인의 적응 면역계 젊어 같은 다양한 질환에 대해 중요 할 수있는 적응 면역 시스템을 조절하기 위해 주사 &quot;미니 흉선 단위&quot;기능 수도 또는 고형 기관 이식 공여자의 특정 내성을 유도.

흉선이 획득 면역계의 기능에 필수적인 병원체 반응성 자기 저항성 T 세포의 다양한 집단의 생성을 담당 차 림프 기관이다. 그것은 흉선 기질의 스폰지 상 3 차원 (3-D) 매트릭스를 통해 이주 현상 흉선 세포는 림프구 전구 세포와 골수 이민 동적 인 기관이다 계통 명세서 및 분화를 거쳐, 최종적으로 이주 성숙한 T 세포. 이 아니라 프로그래밍 프로세스의 성공은 주로 이주 흉선 및 신청 흉선 상피 세포 (TEC는) 설정 및 흉선 미세 환경의 무결성을 유지하기위한 필수적인 가슴샘 기질의 주된 집단 간의 크로스 토크에 따라 다르다. 그 해부학 적 위치 및 고유 함수에 기초하여, TEC는 두 개의 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 피질의 열팽창 계수의 차이이다 respon (cTECs)자기 MHC (주요 조직 적합성 복합체)을 선택하기위한 sible은 T 세포 (긍정적 인 선택) 및 자기 반응성 T 세포 (음 선택) 1, 2를 제거하기위한 필수적인 수질의 열팽창 계수의 차이 (mTECs)을 제한. 많은 요인 (예를 들어, 노화, 감염, 방사선 조사, 약물 치료) 손상된 적응 면역의 결과로, 흉선 상피 세포에 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 수많은 시도에도 불구하고, 흉선 기능을 복원하기 때문에 흉선 미세 환경을 재현하는 어려움에 도전하고있다. 2 차원 환경에서 배양 TEC는 빠르게 thymopoiesis 3,4에 중요한 유전자의 발현이 감소하는 반면 특히 흉선 3 차원 (3-D)의 구성은, 열팽창 계수의 차이의 생존과 기능에 중요하다. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK)과 C 말단 histidinylated 아날로그 EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH)은 저 분자량, 탈 물 공급에 가용성 인 양친 매성 올리고 펩타이드이다20 mM의 염화나트륨 (인간 체액 정상 염 농도 154 mM)을보다 높은 이온 강도에 노출되었을 때 R, β-브릴을 형성 겔화하지만 겪는다. 이 환경에 응답 특성은 3 차원 구조를 형성하기 위해 그들에게 다목적 빌딩 블록을 만든다. 단지 단백질 약물과 다른 생체 분자를 고정 할 수있는 어댑터 역할을 할 수 있습니다 (: EAKII-H6에 그의 태그는 도킹 메커니즘을하는 항 그의 IgG를 / 된 Fc 결합 재조합 단백질 A / G (PA / G는 αH6) 제공 예를 들어 하이드로 겔 합성 5-8 항체). 우리는 이전에 하이드로 겔에 고정 형광 표지의 IgG 분자 최대 십삼일 9 주사 부위에 유지 될 수 있음을 증명하고있다. αH6 때 또한 : 안티 - CD4 IgG를 함께 고정 PA / G 어댑터가 EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) 하이드로 겔에 첨가하고, CD4 + T 세포는 특별히 (10)를 체포했다. 유사한 기술을 사용하여, 최근 입증하는 TEC는 (C)의 3-D 통합(: PA / G : αEpCAM αH6) TEC-특정 안티는 EpCAM 항체를 운반하는 어댑터 단지와 EAK 하이드로 겔에 승진 울드. 누드 마우스의 신장 캡슐 밑에 이식하면 EAK 히드로 겔에 포함 된 TEC 클러스터 효과적으로 생체 내에서 기능적 11,12 T 세포의 발달을 지원할 수있다. 여기서 우리는 신속하고 효과적으로 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬과 열팽창 계수의 차이를 정화하고 EAK 하이드로 젤 시스템과 3 차원 TEC 응집체를 생성하기 위해 방법을 도시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">1. TEC Isolation</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701(1 Gallon)</td>
			<td style="width:223px;">Ethanol 200 Proof, deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Dissecting scissors, straight</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>91460-11</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Graefe forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11053-10</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Graefe forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11052-10</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:216px;">Washing solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;">1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:216px;">1x PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">BSA (Bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:216px;">Digestion solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;">9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Liberase TM Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 127 001</td>
			<td style="width:223px;">referred as &#34;purified collagenase&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">1M HEPES</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737E</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 104 159 001</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">50mL Centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">60mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:216px;">1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:216px;">5mL Polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">5ml glass pipet</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>13-678-27E</td>
			<td style="width:223px;">Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">MACSmix tube rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">100um Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Density gradient medium: OptiPrep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">2. Cell sorting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">5mL Polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:223px;">Use as undiluted, 2uL per sample</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Anti-mouse CD45-PercpCy5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-0451-80</td>
			<td style="width:223px;">Use at 1:150, 10uL per sample</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5791-82</td>
			<td style="width:223px;">Use at 1:100, 10uL per sample</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">BD Influx</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Single cell analysis software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">2. EAK gel assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Anti-His-Tag</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>29673</td>
			<td style="width:223px;">&#34;anti-His-Tag IgG&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:216px;">Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118202</td>
			<td style="width:223px;">&#34;anti-EpCAM IgG&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Recombinant protein A/G</td>
			<td>Pierce Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:216px;">1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>05-402-24B</td>
			<td style="width:223px;">referred as &#34;1.5mL microcentrifuge tube&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353917</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rocking platform: Nutator Mixer no.1105</td>
			<td>BD Clay Adams</td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">10% sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td style="width:223px;">Prepare with sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)</td>
			<td>American Peptide Company&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;">custom synthesized, 10mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:216px;">EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)</td>
			<td>American Peptide Company&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;">custom synthesized, 7.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">Complete medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:223px;">RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td style="width:223px;">Heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">L-glutamine 200mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:216px;">NEAA (non-essential amino acid) 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">1M HEPES</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>17-737E</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">2-Mercaptoethanol (100X)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-007-E</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Platform shaker: The Belly Dancer</td>
			<td>Stovall Life Sciences Inc.</td>
			<td>model: USBDbo</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

promoting 3-d aggregation of facs purified thymic epithelial cells with eak 16-ii/eakiih6 self-assembling hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

CD45- 간질 세포를 풍부하게하는 밀도 구배 분리 프로토콜을 사용의 효과를 조사하기 위해, 인터페이스 석출 림프구 펠렛 모두에서 수확 한 세포를 항 CD45, 항는 EpCAM 항체로 염색 하였다. 두 방지 Ulex Europaeus 응집소 1 (UEA1) 및 안티 MHC 클래스 II 항체는 더 CTEC 및 mTEC 하위 집합을 식별하기 위해 염색 칵테일에 포함되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 우리는 일상적 TEC는 15-20 배 농축 가까이 달성 할 수 있었다. EAK 하이드로 겔의 열팽창 계수의 차이의 집계를 검사하려면, 열팽창 계수의 차이는 보편적으로 막 바인딩, 적색 형광 tdTomato 분자를 표현하는 4 주 이전 B6.ROSA 만 T / MG 마우스에서 분리 하였다. 전술 한 바와 같이 제조 TEC 집합체, (시험 관내에서 이틀 동안 배양하고, 공 초점 현미경 검사 <strong&gt; 그림 2). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54062/54062fig1.jpg" /> TEC는도 1의 유세포 분석은 밀도 구배 용액 풍부. 세포 TEC 인구 (CD45-는 EpCAM +)를 구별하는 항 CD45, 항는 EpCAM 항체로 염색 하였다. 왼쪽 패널 : 효소 분해 후 흉선 세포 밀도 구배 절차 전에. 중간 패널 : 상부층 세포와 밀도 구배 용액을 분리 한 후 인터페이스. 오른쪽 패널 :. 밀도 구배 용액을 분리 한 후 펠렛 세포 (림프구 펠렛) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54062/54062fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54062/54062fig2.jpg" /> 그림 2. <st룽&gt; EAK 하이드로 겔에서 TEC는 클러스터의 공 초점 현미경 이미지. B6.ROSA 만 T / MG 마우스에서 수확 빨간 형광 열팽창 계수의 차이는 FACS로 분리 하였다. TEC는 클러스터는 96 웰 플레이트에, EAK 하이드로 겔에서 배양 포함하고, 하루 2, 열팽창 계수의 차이가 IgG 항체로 표지 된 왼쪽 패널에서 수확; 오른쪽 패널, 열팽창 계수의 차이가 안티는 EpCAM 항체로 표지 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54062/54062fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K 조회수.  Allegheny Health Network. This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell repertoire. In vitro models to study T lineage commitment and development have provided valuable insights into this process. However, these systems lack the complete three-dimensional thymic milieu necessary for T cell development and, therefore, are incomplete approximations of in vivo thymic selection. Some of the challenges related to modeling T cell development can be overcome by using in situ models that provide an intact thymic microenvironment that fully supports thymic selection of developing T cells. Thymic slice organotypic cultures complement existing in situ techniques. Thymic slices preserve the integrity of the thymic cortical and medullary regions and provide a platform to study development of overlaid thymocytes of a defined developmental stage or of endogenous T cells within a mature thymic microenvironment. Given the ability to generate ~20 slices per mouse, thymic slices present a unique advantage in terms of scalability for high throughput experiments. Further, the relative ease in generating thymic slices and potential to overlay different thymic subsets or other cell populations from diverse genetic backgrounds enhances the versatility of this method. Here we describe a protocol for the preparation of thymic slices, isolation and overlay of thymocytes, and dissociation of thymic slices for flow cytometric analysis. This system can also be adapted to study non-conventional T cell development as well as visualize thymocyte migration, thymocyte-stromal cell interactions, and TCR signals associated with thymic selection by two-photon microscopy.

We describe the preparation of thymic slices that, in combination with flow cytometry, can be used to model positive and negative selection of developing T cells. Thymic slices can also be adapted for the in situ analysis of thymocyte migration, localization, and signaling via immunofluorescence and two-photon microscopy.

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...