Name: 3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
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This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium &#8220;Tolerage&#8221;, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-W&#252;rttemberg.

본 연구는 Regierungspräsidium 카를 스루에의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 독일 암 연구 센터 (DKFZ)에서 무균 조건 하에서 보관 하였다. 생후 1~7일 이르는 모든 배양 실험 마우스 새끼 사용 하였다. 흉선에서 mTECs 1. 분리 참고 : 다음과 같은 몇 가지 수정을 무균 상태에서 이전에 한 바와 같이 다음과 같은 소화 단계를 수행 하였다. <ol><li> 마우스 새끼 목을 벨과 흉선을 제거합니다. RPMI 1640 배지를 (5 % FCS를 포함)를 포함하는 페트리 접시에 얼음에 thymi를 놓습니다. </li><li> ~ 5-30 ml의 RPMI 매체와 둥근 바닥 튜브에 좋은, 작은 조각과 장소에 thymi을 절감하고 실온에서 10 분 동안 자석을 사용하여 저어 부드럽게. </li><li> 그 후, 주로 흉선 세포를 포함 뜨는을 가만히 따르다 및 collagena의 한 라운드에 남아있는 조직을 순차적으로 소화37 ℃에서 25 분마다 콜라게나 제 / 디스 파제 (0.2 ㎎ / ㎖ 및 1.2 U / mL의 최종 농도)이어서 37 ° C에서 각각 (0.2 ㎎ / ㎖ 최종 concentartion 57 U / ㎖) 15 분 동안 SE 타입 IV, thymi까지 자기 교반 수욕 C 완전히 분해된다. 세 thymi 두 당 1 ml의 효소를 사용합니다. </li><li> 조직에게 파스퇴르 피펫마다 7-10 분 선동. 콜라게나 / 디스 파제의 분수를 수영장과 70 μm의 거즈를 통해 필터링합니다. </li><li> 자기 세포 분류 (MACS)에 의해 mTECs을 풍부. 앞서 설명한도 11,도 1에 도시 된 바와 같이 자기 정렬 셀 mTECs의 정제를 수행한다. 참고 : 안티 CD80-PE (16-10A1, 1에서 사용 : 100 희석)와 (1에서 G8.8, 사용 : 100 희석) 안티는 EpCAM 바이오 12 mTECs의 자기 정렬을 위해 우리는 다음과 같은 항체를 사용 하였다. 맥을 사용 미숙과 성숙 mTECs은 다음과 같이 정의했다 : CD45 -는 EpCAM + CD80 - 그리고 CD45을 - CD80 + respectiv을엘리. </li><li> 아래 (2.3 절) 한 바와 같이 맥 정화 (미성숙 mTECs의 순도 = 83.1 ± 6.3 %와 성숙한 mTECs = 79.23 ± 3.42 %) 이후의 Organotypic 문화에 mTECs 씨앗. </li><li> 또한, CD45 맥 고갈 후 (100 μm의 노즐을 사용하여) FACS 정렬 mTECs 다음 항체를 사용하여 : 안티 CD45-를 PerCP을 (30-F11, 1에서 사용 : 100 희석), 안티 Ly51-FITC (6C3 1에 사용 : 100 희석), 안티는 EpCAM-Alexa647 (G8.8, 1에서 사용 : 500 희석) 1에서 항 CD80-PE (16-10A1, 사용 : 100 희석). (4 일) : 요오드화 프로피 듐 (5,000 일)를 사용하여 죽은 세포를 제외합니다. 각각는 EpCAM + CD80 + - CD45 - - Ly51 -는 EpCAM + CD80 - 및 PI - CD45 - Ly51 PI : FACS를 이용하여 미성숙과 성숙 mTECs과 같이 정의 하였다. </li></ol> 2. 3D의 Organotypic 공동 문화 (OTCs) 참고 : keratinocyt의의 Organotypic 재배 3D-피부 구조앞서 설명한 바와 같이 ES 9, 13을 제조 하였다. 모든 단계에서, 세포는 CO 2, 37 ° C에서 배양 5 %였다. 다음 mTECs를 사용 OTCs은 약간의 수정을 제조 하였다. <ol><li> 인간 섬유 아세포의 준비 참고 : 이전에 9 바와 같이 인간의 피부 섬유 아세포 드 epidermised 진피 이식편 문화에서 얻었다. <ol><li> 간단히 말해서, 인간의 피부 (~ 5cm 길이)의 스트립을 잘라 써모 4 ° C에서 O / N (10 mM의 헤 페스의 pH 7.4와 생리 식염수 0.5 ㎎ / ㎖)로 처리. </li><li> 그 후, 핀셋을 이용하여 진피로부터 상피를 분리한다. </li><li> 미세 10cm 페트리 접시에 작은 조각, 장소에 진피를 잘라 살균 공기 흐름에 따라 1 ~ 2 시간 동안 건조 할 수 있습니다. DMEM 20 % FBS를 포함하는 정기적으로 외식을 보충합니다. </li><li> 밖으로 성장하는 섬유 아세포를 분할 할 때 합류 외식 더 콘의 판에 부착 계속 확인하고 0.1 % 트립신을 사용 (일반적으로 약 3 주)가지의 secutive 라운드. </li><li> 최대 DMEM의 3 배에 10 % FBS에 대해 동일한 외식에서 섬유 아세포를 확장하고 그들에게 14 냉동은-유지. 각각의 실험 시리즈 섬유 아 세포의 동일한 배치를 사용합니다. 참고 : 섬유 아세포는 피부 등가물의 셋업에 대한 조사되지 않았다. </li></ol></li><li> 비계의 준비 <ol><li> 정확히 12 잘 필터 삽입에 맞게 날카로운 11mm 직경의 금속 주먹을 사용하여 잘 경계가 원에 0.4-0.6 mm 두께의 비스코스, 부직포 섬유 재료 (엑셀 시트를 지원하는 제품 내용을) 잘라. 그런 다음 발판으로 12도 필터 인서트 (폴리 에스테르 모세관 기공 막, 3 μm의 기공 크기)에 배치합니다. 멸균 12 웰 플레이트에 전체 필터 설정을 놓습니다. </li><li> 피브리노겐과 트롬빈의 조합으로 구성된 수술 피브린 글루 키트를 사용하여 피브린 겔을 준비한다. fibrinogen-뿐만 아니라 8 ㎎ / ㎖ 및 10 키트의 트롬빈 성분 사전 희석각각 단위 / ㎖,. 다음과 같이 12 웰 플레이트의 단일 잘 들어갑니다. <ol><li> 칼슘 및 마그네슘 2 + 2 +, pH가 7.0없이 100 μL 피브리노겐 100 μL, 인산 완충 식염수 (PBS)와 (8 ㎎ / ㎖)을 희석. 27 섬유 아 세포를 포함하는 100 μL의 FCS 100 μL 트롬빈 (10 단위 / ml)에 희석. </li><li> 2 ㎎ / ㎖ 및 2.5 단위 / ㎖의 트롬빈의 피브리노겐의 최종 농도를 초래한다 : (1 혼합물 1) 200 μL 피브리노겐을 추가 아세포는 지지체 상에 세포 믹스 함유 트롬빈 200 μL에 디스펜스. 잘 혼합 부드러운 피펫 팅 (1 일)에 의해 발판의 전체 영역에 걸쳐 균등하게 배포 할 수 있습니다. 참고 : 37 ° C에서 30 분 후, 섬유 아세포를 둘러싸는 완전히 응고 지지체의 내부 공간을 채우고 매끄러운 상면을 형성 형성한다. </li></ol></li></ol></li><li> mTECs와 공동 문화 <ol><li> 사전 문화에서 기관 배양을 덮어서 가리다매체 변화에 10 % FBS, 50 μg의 / ml의 L- 아스코르브 산 1 NG / ml의 TGF-β1과 DMEM 4-5일 대한 매일. </li><li> mTEC 시딩 당일 rFAD 배지로 배지를 대체 (1 : 1 DMEM + DMEM / F12), 10 % FBS와 10 -10 M 콜레라 독소, 0.4 ㎎ / ㎖의 하이드로 코르티손,를 50㎍ / ㎖ L - 아스코르브 산, RANK 리간드 따라서 섬유 아세포에서 분비되는 세린 프로테아제에 의해 조숙 섬유소 용해를 방지 (는 0.1㎍ / ml) 및 500 단위 / ml의 아프로 티닌. </li><li> 7 ~ 8 시간 후, 25 mTECs 시드에 의해 공동 문화를-설정 (전체 mTECs를, 또는 CD80 LO와 CD80 안녕 부분 집합), 섬유 아세포의 발판 위에 잘 당 100 μL의 볼륨. 노이 바 우어 실 (주 4)를 사용하여 세포를 카운트. 참고 : 흉선 3D의 Organotypic 문화가 공기 해제되어 피부 OTCs 달리 미디어에 잠겨 모든 시간에. </li><li> 24 시간 배양 한 후, 지금 containi (단계 2.3.2) 위에서 언급 한 바와 같이 매체와 문화 (총 매체 교환) 공급NG는 아프로 티닌의 양, 250 단위 / ㎖ (5 일)을 감소시켰다. </li><li> mTECs의 증식 활동을 평가하기 위해, 문화의 종료 전에 4 시간 동안 OTCs에 (즉, 6.7 μM / ㎖, / 웰 10 μm의) EDU를 추가합니다. 각 문화 시편의 또는 흐름에 의해 두 개의 섹션에 하나 카운트 K14 + EDU + 세포에 의해, mTECs의 증식 지수를 결정 각질 (14)의 공동 염색과 결합 된 에듀 이미징 키트에 설명 된대로 장외 냉동 섹션의 염색을 수행 세포 계측법 (EDU 유동 세포 계측법, 제 1.7 대신 Ly51-FITC의는 1 CDR1-PB 15을 사용 : 100 희석 및 2.3.6.4). </li><li> 공동 문화의 4-7일 다음, RNA 분리, 극저온 절편 또는 FACS 분석 (8 ~ 11 일)에 대한 OTCs 및 프로세스를 종료합니다. <ol><li> , 집게를 사용 웰 인서트의 필터에서, 골격 / 진피 동등한 분리 배양을 종료한다. </li><li> 극저온 절편의 경우, 10월 화합물에 전체 OTC를 포함하고 리에서 동결극저온 절편 전에 파운드 질소 증기. 사용할 때까지 -20 ℃에서 저온 유지 및 저장소를 사용하여 5-7 μm의 두께 장외 섹션을 준비합니다. 항체 : (100 희석 1 GP53, 사용), 및 안티 멘틴 : 극저온 구분 OTCs의 면역 조직 화학 안티 - 케라틴 14 (1,000 희석 AF64, 사용 1에서)를 사용합니다. 각각의 이차 항체를 사용하여 간접 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. </li><li> RNA 분리를 들어, 용액 2 ㎖의의 RNase 무료 튜브의 나사 캡 (페놀 및 구 아니 디늄 티오 시아 네이트를 포함하는)를 열 변성 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 메스와 조각으로 전체 장외을 잘라 변성 솔루션을 포함하는 튜브에 추가 할 수 있습니다. 기계적으로 6.0의 속도로 30 초 동안 두 번 FastPrep 악기와 OTCs 분쇄기, 2 분 (샘플이이 시점 이후 -80 ° C에서 저장 될 수 있습니다) 얼음에 사이에 배치합니다. -80 ° C에서 냉동하면 얼음 위에서 해동. 4 ℃에서 10 분 동안 11,500-13,000 rpm으로 튜브를 원심 분리기. 신선한 튜브에 뜨는을 전송 RT와 F에서 5 분 동안 품어제조자에 의해 설명 된 바와 같이 산성 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 이용 ollow RNA 분리 프로토콜. </li><li> FACS 분석의 경우, 지지체를 제거하고, 피브린 / 섬유 아세포 / mTEC 겔로부터 막 분리. 미세 메스 겔을 잘라 ~ 대한 FACS 튜브에 20 분을 소화 또는 완전히 자기 교반 수조에서 37 ° C에서 콜라게나 제 / 디스 파제 2 ㎖로 분해 할 때까지. 일단 파스퇴르 피펫 5 분마다와 효소 용액을 교반한다. 완전 분해 후, 70 ㎛의 필터를 통해 세포 현탁액을 필터; 1.7에 설명하고 유동 세포 계측법으로 분석하여 항체를 사용하여 단일 세포 현탁액을 염색. </li></ol></li></ol></li></ol>

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저자는 관심의 재정적 또는 상업적 갈등을 선언하지 않습니다.

RTOCs 외에도, 3D OTCs는 TEC 차별화와 PGE 유지 보수 / 유도 다른 (I)에 비해 (표 1) &#39;단순화 된 3D 문화&#39;는 사용의 측면에서 훨씬 우수하여왔다 - 섬유 아세포를 혼자 발판없이; (II) 2D 시스템을 사용하여 -, (ⅲ) 3T3-J2 세포 TEC 클론 개발에있어서, 열팽창 계수의 차이 (10)와 공동 배양 된 섬유 아세포 / 피더 세포,하지만 PGE가 손실 (IV) 마트 리겔 또는 (V) ECM 구성 요소 (게시되지 않은 ...

나머지 2 %는 공동으로 흉선 기질을 구성하는 다양한 세포로 구성되어있는 동안 개발 흉선 세포는 흉선의 약 98 %를 차지 (즉, 상피 세포, 수지상 세포, 대 식세포, B 세포, 섬유 아세포, 내피 세포). 외부 대뇌 피질 상피 세포 (cTECs)는 다 능성 사전 T 세포 및 자기 MHC의 긍정적 인 선택의 골수, T 세포 계보 유도에서 프로 T 세포의 이민을 조달 미성숙 흉선 세포를 제한했다. 내부 수질 흉선 상피 세포 (mTECs)을 유도 부정적인 선택 또는 T 조절 세포 계보에 자신의 편차 중 하나에 의해 자기 펩타이드 / MHC 복합체에 대한 높은 선호도 TCR과 그 흉선 세포의 내성 유도에 참여하고 있습니다. 중앙 관용 유도의 맥락에서, mTECs은 따라서 주변 자체 미러링 조직 제한자가 항원 (TRAS)의 다양한 스펙트럼을 표현하는 점에서 독특합니다. 이 현상은 무차별 유전자 발현이라고 (PGE)1,2. 다양한 단기 2D 문화 시스템은 변함없이 처음 이일 3-6 내에서 MHC 클래스 II, FoxN1과 에르 같은 PGE의 손실과 키 조절 분자의 결과로이 매혹적인 세포 유형에 현재 대부분의 연구는 생체 분리 된 세포에 의존 . 그것은 특정 구성 요소와 흉선의 그대로 3 차원 그물 세공의 기능은 2D 모델에서 누락 된, 그러나 불분명 남아 있었다. 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC)는 그대로 흉선 미세 7에서 원경 한편 만 3D 한편, T 세포 발달의 연구를 허용 시스템, 및 간질 세포 생물학,이었다. 그러나 RTOCs들은 이미 태아 간질 세포의 입력을 필요로 5-10 일 최대 배양 기간을 견딜 세포 복합체를 포함하는, 즉, 특정 제한을 갖는다. 체외 배양 시스템의 환원의 부족의 연구를 방해하고있다T 세포 개발 및 흉선 기관 형성의 여러 측면하지 적어도 분자 PGE의 규제와 mTECs의 발달 생물학의 관계. 피부와 흉선의 상피 세포의 구조 조직의 확대 연관성으로 인해, 우리는 체외에서 각질 세포의 분화를 에뮬레이트함으로써 피부 동등한를 만들 원래 개발되었던 3D의 Organotypic 문화 (OTC) 시스템을 선택했다. OTC 시스템은 각질 세포가 8,9를 접종하는에 섬유소 젤에 갇혀있다 진피 섬유 아세포와 겹쳐 불활성 지지체 매트릭스로 구성되어 있습니다. 여기, 우리는 정제 mTECs와 각질 세포를 대체했다. 이 모델의 기본 기능을 유지하면서, 우리는 특정 매개 변수를 최적화. mTECs가 증식 채택 장외 모델에 따라서 밀접하게 생체 mTECs 개발 모방, 단말 차별화를 시행하고 mTEC ID 및 PGE을 유지 <sup&gt; 10. 이 기술 노트는 흉선 OTCs의 단계적 설정을 허용하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Pregnant C57BL/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Microbeads, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)</td><td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific Blue</td><td>Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin 14 antibody</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab&#039;)2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12-well filter inserts (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657631</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;szlig;1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV&amp;nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.</td></tr><tr><td>Neutrale Protease (Dispase)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.</td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 &amp;micro;g/ml final conc.</td></tr></tbody></table>

3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression

인트라 흉선 T 세포의 발달은 각종 간질 세포, 즉, 비 - T 세포로 구성된 복잡한 삼차원 메쉬 작업을 필요로한다. 순차적으로 즉, T 세포 수용체 레퍼토리 생성 및 선택에 따라 T 세포 계보 헌신 전에 주변에 자신의 수출에 필수 체크 포인트를 통과하면서 흉선 세포는 매우 조정 공간적 위해이 발판을 통과. 이 골격을 형성하는 두 가지 주요 상주 세포 유형은 (cTECs) 피질과 수질 흉선 상피 세포 (mTECs에게)입니다. mTECs의 주요 기능은 수많은 조직 제한 항원의 소위 무차별 표현이다. 이 조직 제한 항원은 각각 자기 허용 오차의 결과로, mTECs 또는 흉선 수지상 세포에 의해 직접 또는 간접적으로 흉선 세포를 미숙하기 위해 제공됩니다. cTECs과 mTECs의 발달 경로와 기능을 모방 시험관에 적합한 모델은 현재 락입니다왕. 적절한 실험 모델의 부족은 예를 들면 아직 저조한 세포 및 분자 수준의 이해 난잡한 유전자 발현의 분석을 방해했다. 우리는 생체 고립 mTECs 문화 차원의 Organotypic 공동 문화 모델을 적용. 이 모델은 원래 생체 외 피부 동등 물을 생성하는 방식으로 케 라티노 사이트를 배양하기 위해 고안되었다. , CD80 안녕, 에르 양성 mTECs, RANKL에 (II) 응답 및 FoxN1의 (III) 지속 식으로 (I)의 증식과 CD80 보라, 에르 음성 단자 차별화 : 3D 모델은 mTEC 생물학의 주요 기능 기능을 보존 에르와 CD80 안녕 mTECs에서 조직 제한 유전자.

우리는 원래 각화 세포 9 시험관 장기 배양을 위해 개발되었던 3D의 Organotypic 공동 배양 모델 (3D OTC)를 채택 하였다. 맥 풍부한 mTECs은 (맥 농축 방식의 그림 1 참조) 섬유소 젤 포획 된 섬유 아세포의 포함 발판에 접종 하였다. 섬유 아세포는 시험 관내에서 mTECs지지 필수적인 세포 외 기질 (ECM)을 제공한다. MTECs 공기에 노출 된 자신의 생체 내 환경 (장외 셋업 ...

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K 조회수.  German Cancer Research Center (DKFZ). Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression. 

비디오: 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

연구

암 연구학

Reaggregate Thymus Cultures

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

In this video the preparation of 2-dGuo-treated reaggregate thymus cultures is demonstrated.

Thymus 문화 Reaggregate

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

생물학

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

생체공학

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

발생학

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell repertoire. In vitro models to study T lineage commitment and development have provided valuable insights into this process. However, these systems lack the complete three-dimensional thymic milieu necessary for T cell development and, therefore, are incomplete approximations of in vivo thymic selection. Some of the challenges related to modeling T cell development can be overcome by using in situ models that provide an intact thymic microenvironment that fully supports thymic selection of developing T cells. Thymic slice organotypic cultures complement existing in situ techniques. Thymic slices preserve the integrity of the thymic cortical and medullary regions and provide a platform to study development of overlaid thymocytes of a defined developmental stage or of endogenous T cells within a mature thymic microenvironment. Given the ability to generate ~20 slices per mouse, thymic slices present a unique advantage in terms of scalability for high throughput experiments. Further, the relative ease in generating thymic slices and potential to overlay different thymic subsets or other cell populations from diverse genetic backgrounds enhances the versatility of this method. Here we describe a protocol for the preparation of thymic slices, isolation and overlay of thymocytes, and dissociation of thymic slices for flow cytometric analysis. This system can also be adapted to study non-conventional T cell development as well as visualize thymocyte migration, thymocyte-stromal cell interactions, and TCR signals associated with thymic selection by two-photon microscopy.

We describe the preparation of thymic slices that, in combination with flow cytometry, can be used to model positive and negative selection of developing T cells. Thymic slices can also be adapted for the in situ analysis of thymocyte migration, localization, and signaling via immunofluorescence and two-photon microscopy.

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

면역학 및 감염병학

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPSC 유래 오가노이드를 이용한 흉선 미세환경 재현

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 인간 흉선 오가노이드를 활용한 흉선 상피세포 및 T세포 연구의 발전

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

요약

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뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

Thymus 문화 Reaggregate

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성