염증성 장 질환, 또는 IBD, 개인과 사회에 상당한 건강 및 재정적 부담을 부과. 이 대장염 모델은 IBD의 메커니즘을 연구하고 IBD에 대한 치료를 평가하는 데 도움이됩니다. 이 면역 지배적 인 Cbir flagellin T 세포 특정 입양 대장염 모델은 장내 박테리아 항원항염이 대장염을 유도하기 위해 T 세포 반응을 유도하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다.
마우스를 안락사한 후, 복부 절개를 거의 1센티미터 남기고 복부 근육 조직에서 피부를 끌어당깁니다. 그런 다음 복부 근육 조직에서 약 3 센티미터 절개를하십시오. 다음으로 멸균 가위와 집게로 비장을 제거합니다.
미리 냉각된 세척 버퍼 5밀리리터가 포함된 문화 접시에 비장을 놓습니다. 두 개의 멸균 유리 슬라이드의 거친 표면으로 비장을 갈아. 세포 현탁액을 100 마이크로미터 세포 여과기를 통과하여 50밀리리터 원심분리기 튜브로 전달합니다.
유리 슬라이드와 문화 접시를 5밀리리터의 미리 냉각된 세척 버퍼로 헹군 다음 세척 버퍼를 튜브로 옮킨다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상체를 버리고, 비장 당 미리 따뜻진 트리스 암모늄 염화 용해 버퍼의 5 밀리리터로 세포를 다시 분리한다. 실온에서 10분 동안 배양하세요.
튜브에 미리 냉각된 세척 버퍼 10밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 세포 현탁액을 원심분리하고, 상체를 버리고, 미리 냉각된 절연 버퍼의 10 밀리리터로 세포를 다시 분리한다. 세포를 계산하려면 각 셀 서스펜션과 Trypan blue 10 마이크로리터를 혼합하고 10 마이크로리터를 슬라이드에 로드합니다.
그런 다음, 슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 삽입하여 실행 가능한 셀 번호를 얻습니다. 나머지 셀 현탁액을 원심분리하고 모든 상피를 폐기합니다. 항 마우스 CD4 자기 입자를 소용돌이, 직접 1,000만 세포 당 입자의 50 마이크로 리터를 추가하고, 철저하게 세포 펠릿과 혼합.
4섭씨에서 30분간 혼합물을 배양합니다. 세포 입자 현탁액을 멸균 수집 튜브로 옮기십시오. 3.5 밀리리터의 미리 냉각된 절연 버퍼를 튜브에 넣습니다.
실온에서 8분간 세포 분리 자석에 튜브를 놓습니다. 그런 다음, 조심스럽게 3 밀리리터 전송 파이펫으로 상체를 흡인. 세포 분리 자석에서 튜브를 제거합니다.
그런 다음, 미리 냉각된 격리 버퍼의 3.5 밀리리터로 세포를 다시 중단하고 실온에서 4 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 3 밀리리터 파이펫으로 슈퍼네티를 조심스럽게 흡인합니다. 마지막으로 미리 냉각된 FACS 버퍼의 1밀리리터에서 셀을 다시 일시 중지합니다.
수용인 마우스로 세포를 전송하기 위해 Cbir1 TCR 형질전환-순진한 CD4 양성 T 세포를 1x PBS에서 밀리리터당 5백만 개의 세포로 재보선한다. 열 램프 아래 마우스를 따뜻하게하고 마우스 억제기를 사용하여 마우스를 억제합니다. 정맥 내 200 마이크로 리터를 쥐의 꼬리 정맥에 주입.
마우스를 안락사한 후 약 1센티미터의 복부 중간선 피부 절개를 합니다. 복부 근육 조직에서 피부를 당깁니다. 그런 다음 복부 근육 조직에서 3 센티미터 절개를하십시오.
다음으로, coecum을 식별하고 멸균 가위와 집게로 전체 결장제거합니다. 문화 접시에 미리 냉각 된 PBS로 결장 젖습니다. 결장을 세로로 절개하고 미리 냉각된 PBS로 헹구십시오.
콜론의 1/3을 세로로 잘라냅니다. 콜론 스트립을 종이 타월에 놓고 루멘탈 측이 위쪽으로 향합니다. 이쑤시개를 사용하여 스위스 롤링을 수행합니다.
결장 스위스를 카세트에 넣고 카세트를 10% 버퍼링한 포르말린에 24시간 동안 넣습니다. 자동 프로세서로 결장탈수및 파라핀을 내장합니다. 그런 다음 마이크로 톤에 5 마이크로 미터 조직 섹션을 잘라냅니다.
슬라이드에 조직을 마운트하고 헤마톡시린과 에신 염색을 수행합니다. 래그 녹아웃 마우스는 세포 전후 3주 전후에 체중을 감량하기 시작했고, 체중은 6주 후 전형후 원래 체중의 약 80~85%에 이르렀습니다. 수신자 마우스는 짧은 결장 길이 6 주 후 세포 전송을 보였다.
수령마우스는 장 내 라미나 프로프리아에서 더 많은 세포 침투를 입증4 주 후 세포 전달. 그(것)들은 결장의 부막에 있는 점막 침식 및 선동적인 세포 침투뿐만 아니라 세포 전후 5주 후 엽상 세포 증식 및 장 상피 세포 증식을 보여주었습니다. 조직 병리학 점수는 4 주에서 6 주까지 크게 증가했습니다.
동시에, 혼자 PBS를 수신하는 래그 녹아웃 마우스에 염증이 없었다. 이 절차를 사용하여, 대장 사이토카인 수준은 ELISA와 qPCR에 의해 결정될 수 있었습니다.
