체계적인 채점 분석은 점막 상해를 평가하기 위한 기술입니다, 훈련된 연구원에 의해 수행될 수 있는 조직학 해석을 촉진합니다. 이 방법의 주요 장점은 자유롭고 사용하기 쉽다는 것입니다. 대장염을 가진 마우스의 장으로부터 얻은 조직학적 데이터의 정량적 분석을 허용한다.
이 프로토콜은 다른 유전 배경의 동물에서 질병을 비교하는 데 필요한 전체 결장의 질병 심각도를 해석하는 신속하고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 조직 준비를 위해 모든 시약과 재료를 구성하는 것이 중요합니다. 먼저 잔핀 위치에 해부 패드에 안락사 마우스를 배치하고 20 게이지 1.5 인치 바늘을 사용하여 마우스 사지를 고정합니다.
집게와 가위를 사용하여 복부 피부에 작은 절개를하고 복막을 노출시키기 위해 옆으로 당긴 다음 복막뼈에서 복막의 중간 절개를 하는 복강을 복부의 측면으로 엽니다. 내장이 시각화될 때까지 조직과 장기를 신중하게 제거합니다. 결장의 양쪽에 있는 골반 뼈를 잘라 내어 항문에서 cecum쪽으로 확장된 장기를 완전히 시각화합니다.
조심스럽게 장기를 해부하면서, 조심스럽게 기관을 해부하면서 결장에 부착 된 지방, 작은 정맥, 동맥을 부드럽게 제거하고, 항문과 실산에 단지 근위를 절단. 항문을 통해 삽입된 유연한 플라스틱 게이지 바늘을 사용하여 대변 내용물을 제거하기 위해 PBS로 결장들을 조심스럽게 플러시한다. 결장은 직선으로 배치하고 간질 동맥을 따라 세로로 엽니다.
결장과 근위 결단까지 세로로 결장한다. 조직의 절반을 조직 학적 분석을 위해 사용하고 나머지 절반은 서양 얼룩, PCR, 또는 신선한 냉동 면역 형광 현미경 검사용 두 번째 스위스 롤로 압연하십시오. 전체 결장의 길이를 따라 거의 동일한 폭이 얻어질 때까지 면도날로 근위 결장에서 여분의 조직을 다듬습니다.
결장정렬하여 루멘을 노출시키고 유연한 개비지 바늘을 사용하여 조직을 완전히 평평하게 합니다. 절차 전반에 걸쳐 조직을 촉촉하게 유지하기 위해 필요한 경우 더 많은 PBS를 추가합니다. 종이 닦아 초과 PBS를 제거합니다.
주사기 와 gavage 바늘로, 조직을 고치고 평평하게하기 위해 2 ~ 3 분 동안 10 % 중성 버퍼링 포르말린 용액을 추가 한 다음 직선 집게를 사용하여 탈결결의 끝을 잡고 결장결을 원심 원에서 근위 끝까지 비틀어 냅니다. 27 게이지 바늘을 삽입하여 중간에 결장과 스위스 롤 모양을 고정한 다음 스위스 롤을 카세트와 평행하게 조직을 방향을 그리는 조직학적 표본 용기 안에 포함 된 카세트에 넣습니다. 10% 중성 완충 포어틴 용액을 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 수정합니다.
하룻밤 고정 후, PBS로 조직을 세 번 씻으라. 파라핀 포함 공정 전에 70%에탄올을 추가하고 진행하기 전에 스위스 롤에서 바늘을 제거합니다. 조직은 파라핀 임베디드까지 실온에서 에탄올에 보관할 수 있다.
이미지 처리 소프트웨어에서 스캔된 이미지를 연 후 전체 결장이 표시되고 샘플의 누락된 영역이 없는지 확인합니다. 레이블 이미저를 활성화하고 막대 도구를 조정하여 레이블 이미저를 클릭하여 스캔된 슬라이드를 올바르게 식별합니다. 주석을 클릭하여 주석 도구를 열고 새로운 레이어를 클릭하여 스위스 롤, 염증 또는 부상, 침식 또는 궤양의 총 길이를 정량화하여 세 가지 레이어를 만듭니다.
레이어 색상을 클릭하여 각 레이어에 대해 다른 색상을 선택합니다. 각 층 또는 범주의 길이를 측정하여 펜 도구를 클릭하여 근육점막 다음선을 그리고, 분석을 위해 인접한 영역을 시각화하는 데 필요한 대로 포인터를 이동한다. 400 마이크로미터 줌에서 이미지를 확인하여 근육점막의 적절한 시각화를 용이하게 합니다.
펜이 중지될 때마다 작은 새 레이어 영역이 생성됩니다. 레이어 영역 탭으로 시각화하고 편집할 수 있습니다. 총 길이를 검토, 염증 또는 부상, 침식 또는 궤 양을 참조로 근육 점막을 사용하여 측정.
모든 레이어가 정의되면 내보내기 그리드를 사용하여 데이터를 레이어 영역 옵션 내텍스트 파일 단추로 내보냅니다. 텍스트 파일을 열고 데이터를 스프레드시트 소프트웨어에 복사합니다. 각 지역의 모든 세그먼트를 합산하고 총 길이에 대한 부상 및 궤양의 비율을 계산합니다.
조직학 대장염 점수를 계산하고 질병의 중증도를 평가하기 위해 세 가지 주요 특성을 고려하십시오. 토굴 발광 축에서 조직된 상피 세포, 면역 세포가 거의 없는 라미나 프로프리아, 면역 세포및 서브자센트 근육점막이 특징인 건강한 장 점막을 확인하십시오. 다음으로, 염증 또는 상해를 확인, 이는 감쇠 또는 부분적으로 누락 된 상피 세포와 토굴로 호중구 침투점 염증을 특징으로한다.
마지막으로, 침식 또는 궤양의 존재를 확인, 표면 상피가없는 영역 또는 완전히 관련 백혈구의 유무에 관계없이 상피 지하실이 부족한 영역을 특징으로한다. 점막 손상의 맥락에서 이러한 조직학 대장염 점수 분석의 신뢰성을 설명하기 위해, 2.5%DSS는 5일 동안 8개의 C57BL6 야생형 마우스의 식수에서 투여되었고, 이어서 5일간 일반물로 회복기간을 거쳤다. 체중은 DSS의 급성 투여 기간 동안 일정하게 유지되었지만 쥐가 일반 수돗물을 마시기 시작했을 때 극적으로 감소했습니다.
혈액과 연약한 발판은 DSS 행정의 3 일 후에 나타나고 실험의 8 일까지 계속되었습니다. 이러한 관측에 따르면 DSS에 노출되는 가장 해로운 효과는 5일과 8일 사이의 회복 기간 동안 관찰되었다. 10일째에 결장 길이를 측정하여 실험이 끝날 때 상당한 단축을 확인하였다.
콜론은 파라핀 스위스 롤을 만들기 위해 0일, 2, 5, 7, 8, 10일에 수확되었습니다. 조직은 H&E와 고화질 검사로 염색되어 조직학 대장염 점수와 부상 및 궤양의 비율을 계산하기 위해 분석되었다. 일반 토굴 아키텍처는 처리되지 않은 마우스에서 관찰되었다.
DSS 투여 이틀 후 면역 세포 모집이 관찰되었습니다. 5일째에 상피 세포가 손상된 것처럼 보이며 상피 손상과 관련된 상피를 통해 호중구가 침투했습니다. 5일째부터 8일까지 염증과 궤양을 가진 상피 손실 부위가 관찰되었다.
10일째에 상피 세포는 궤양 부위를 재생하고 재채우기 시작하여 대장 점막을 천천히 복원하기 시작했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 제대로 지향적이고 잘 보존된 스위스 롤을 만들고 점막 염증이나 부상, 궤양 또는 침식을 올바르게 식별하는 것이 중요합니다. 이 방법은 TMS 또는 T 세포 전달 모델과 같은 대장염의 다른 모델에서 대장 점막의 전체 길이를 따라 상해를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있다.
