Name: in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model
Uploaded: 2020-10-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81970265, 81900281,81700288), 중국 박사 후 과학 재단(2019M651904)에 의해 부분적으로 지원되었다. 중국의 국가 주요 연구 개발 프로그램 (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

상업용 시약 및 계측기에 관한 정보는 재료 표에기재되어 있습니다.
AC16 인간 심근세포 세포주는 BLUEFBIO(상하이, 중국)에서 구입한 SV40 변형 인간 섬유아세포17을가진 성인 심실 심장 조직에서 1차 세포의 융합에서 유래되었다. 세포주심근세포의 특징적인 많은 생화학적 및 형태학적 특징을 개발합니다. 또한, 세포주는 시험관 내 심근 손상 및 심근 기능을 평가하는 데 널리 사용된다18,19.
1. 세포 배양
참고: 기저 배양 배지는 혈청이 없는 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM), 10% 태아소 혈청(FBS), 1% 심장 심근세포 성장 보충제, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액으로 구성되어 있습니다. 배지를 4°C로 저장하고 사용하기 전에 37°C로 예성합니다.
<ol><li>액체 질소에서 냉동 보존 된 인간 심근 세포 (HCM) 세포를 제거하고 37 °C의 수조에서 해동하십시오.</li>
	<li>유리병에 작은 얼음 조각만 남을 때까지 37°C 수조에서 바이알(&1분)을 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>바이알을 멸균 라미나르 플로우 후드로 옮킨다. 70% 알코올에 담근 면공으로 바이알의 바깥쪽을 닦아냅니다.</li>
	<li>예동된 완전한 성장 배지의 4mL를 해동 된 세포를 포함하는 원심분리기 튜브로 드롭와이즈로 옮기다.</li>
	<li>10 분 동안 200 × g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 버리고 완전한 배지의 5mL에서 펠릿을 다시 중단한다.</li>
	<li>95%의 공기와 5%CO2로대기 하에서 가습된 인큐베이터에서 세포를 37°C로 유지한다. 참고: 실험을 위해 세포를 수확하기 전에 세포는 약 60-70%의 합류에 도달할 때까지 자랄 수 있습니다.</li>
</ol>2. 산소 포도당 박탈 (OGD) 모델의 설립
참고: 연구 기간 2시간 전에, 성장 배지를 혈청 이없는 배지로 대체하고, 세포는 5%CO2로대기 하에서 37°C에서 2시간 동안 가습된 인큐베이터로 재배양하였다.
<ol><li>6웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 인산염 완충식식염수(PBS)로 셀을 세 번 부드럽게 세척합니다.</li>
	<li>2mL의 신선한 무설탕 DMEM을 잘 넣으세요.</li>
	<li>1,2,4, 8, 12 또는 16h에 대해 37°C에서 95% N 2, 5% CO2및 0.1%O2의 혼합물을 가진 대기 하에서 3가스 인큐베이터에서 일정한 온도로 세포를 배양한다.</li>
	<li>저산소증 처리 후, 6웰 플레이트로부터 배지를 흡인시키고 PBS(pH 7.4)로 세포를 세 번 세척한다.</li>
	<li>잘 당 완전한 DMEM의 2 mL을 추가합니다.</li>
	<li>95%의 공기와 5%CO2로대기 하에서 가습된 인큐베이터에서 세포를 37°C로 유지한다.</li>
</ol>3. 시간 온도 프로토콜
참고: 다른 사람에 의해 이전에 설명 된 바와 같이, 심장 수술 중에 표준 시간 온도 프로토콜이 사용된다20,21. 다음 프로토콜에 따라 HCM처리(도 1):시간점 1(T1)은 유도의 끝을 나타내고, 시간점 2(T2)는 유지 보수 및 시간점 3(T3)의 끝을 나타내며 재열의 끝을 나타낸다. 연속 규범 조건(37°C)에서 유지되는 제어 셀을 분석합니다. 온도 조건은 정밀한 온도 조절을 허용하는 트라이 가스 인큐베이터를 사용하여 생성됩니다.
<ol><li>실험 2시간 전에 6웰 플레이트에서 배양 배지를 흡인하고 2mL의 신선한 세럼 프리 DMEM을 잘 넣습니다.</li>
	<li>5%CO2를가진 대기 하에서 37°C에서 2시간 동안 가습된 인큐베이터에서 세포를 재배양한다.</li>
	<li>2 시간 후, 6 웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 PBS (pH 7.4)로 세포를 세 번 세척한다.</li>
	<li>잘 당 신선한 세럼이없는 DMEM2 mL을 추가합니다.</li>
	<li>삼가스 인큐베이터에서 세포를 재큐베이션한다. 참고: 배지를 교체하여 부착되지 않은 셀과 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>문화 접시를 트라이 가스 인큐베이터로 배치하여 온도를 즉시 변경합니다.</li>
	<li>냉각 1시간 후, 6웰 플레이트에서 배지를 빠르게 흡인하고 2mL의 신선한 무설탕 DMEM을 잘 넣습니다.</li>
	<li>저산소증을 확립하기 위해 37°C에서 95%N2,5%CO2,및 0.1%O2를 포함하는 대기 하에서 삼가스 인큐베이터에서 세포를 배양한다.</li>
	<li>아래에 설명된 대로 온도를 설정합니다. 참고: 프로토콜은 저온 처리의 10 h로 시작하고, 37°C까지 2h에 대한 재온난화 단계, 그리고 24 h의 normothermia (37°C)로 시작합니다. 매 번 분석을 위해 3개의 페트리 요리가 제거됩니다.</li>
	<li>저온 처리 후, 6웰 플레이트로부터 배지를 흡인하고 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한다.</li>
	<li>잘 당 완전한 DMEM의 2 mL을 추가합니다.</li>
	<li>95%의 공기와 5%CO2로대기 하에서 가습된 인큐베이터에서 세포를 37°C로 유지한다.</li>
</ol>4. CCK-8 생존 가능성 분석
<ol><li>사용하기 전에 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세산(EDTA) 용액및 PBS를 37°C로 데우십시오.</li>
	<li>배지를 흡인시키고, PBS의 1mL로 세포를 헹구고 우물의 벽을 따라 0.25% 트립신의 0.5mL를 추가한다. 거의 모든 HMC가 분리 될 때까지 37 °C에서 배양 (약 1 분).</li>
	<li>트립신을 중화시키기 위해 우물에 DMEM 전체 매체 1mL을 추가합니다.</li>
	<li>셀 서스펜션을 15mL 원심분리관으로 옮기고 HMC를 원심분리로 3분 동안 500g×. 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네티드를 흡인시합니다.</li>
	<li>세포 현탁액의 100 μL 알리쿼트(5000세포/웰)를 96웰 플레이트에 분배한다. 가습 된 인큐베이터에서 24 시간 동안 플레이트를 미리 배양하십시오 (37 °C.에서)</li>
	<li>96웰 플레이트에서 배양된 세포를 사용하여 다른 치료 군을 생성한다.</li>
	<li>인큐베이터에서 적절한 시간(16h)을 위해 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>플레이트의 각 웰에 CCK-8 용액 10 μL을 추가합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정합니다. 주의: 그들은 OD 판독 측정을 방해로, 우물에 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.</li>
</ol>5. 세포분석용 유동 세포측정
<ol><li>4.2-4.4 단계를 수행하여 트립시화 및 원심 분리 단계를 수행합니다. 참고 : 세포는 EDTA없이 트립신으로 수확됩니다. 세포멸을 평가하기 위해 부동 세포와 부착 세포가 모두 수집됩니다.</li>
	<li>1000 × g에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.</li>
	<li>혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 파이펫을 사용하여 트라이판 블루 처리 셀 서스펜션의 100 μL을 혈류계로 옮기십시오. 핸드 탈리 카운터를 사용하여, 16 제곱의 한 세트에서 살아있는, 스테인드 되지 않은 세포를 계산한 다음 PBS를 사용하여 1×107 셀/ml에서 세포 현탁액을 생성합니다.</li>
	<li>셀 서스펜션의 200 μL을 얻습니다 (5 × 105 -1 × 106 셀).</li>
	<li>원심분리기는 1000 × g에서 5분 동안 원심분리기를 × 부속서 V-FITC 결합 용액의 펠릿을 재연한다.</li>
	<li>부속서 V-FITC의 5 μL을 추가하여 세포를 염색합니다.</li>
	<li>세포 현탁액에 프로피듐 요오드 10 μL을 추가합니다.</li>
	<li>부드럽게 세포를 혼합하고 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. 참고: 세포는 얼룩을 개선하기 위해 인큐베이션 중에 2-3회 다시 중단됩니다.</li>
	<li>흐름 사이토미터를 시작하고 소프트웨어가 적절하게 작동하는지 확인합니다.</li>
	<li>유동 세포 측정 소프트웨어에서 두 개의 점 플롯 창을 엽니다.</li>
	<li>Y축의 X축 및 측면 산란광(SSC)에서 전방 산란라이트(FSC)를 선택하여 각각 크기와 세분성 측면에서 셀 이물질 및/또는 덩어리를 제외합니다.</li>
	<li>세포의 형광 강도를 측정하는 데 사용되는 PE(590mm) 검출 채널 및 FITC(530mm)를 선택한다.</li>
	<li>유동 세포계에 빈(염색되지 않은 HCM) 샘플 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>기록을 클릭하여 빈 샘플 튜브의 서스펜션에서 입자를 수집한 다음 세포 집단을 게이트하여 첫 번째 점 플롯에서 추가 분석을 합니다.</li>
	<li>튜브 지지대 암에 단 하나 얼룩진 샘플을 놓습니다. 기록을 클릭하여 현탁액에서 파티클을 수집한 다음 셀 모집단을 게이트하여 첫 번째 점 플롯에서 추가 분석을 합니다.</li>
	<li>다른 샘플 튜브에서 HCM을 수집하고 형광 채널의 전압을 조정하여 측정을 최적화합니다. 참고: 스테인드 및 단일 스테인드 샘플은 실험 중에 보정 컨트롤로 사용됩니다.</li>
	<li>각 샘플 튜브의 통계를 표시하고 각 샘플의 자멸률을 계산합니다.</li>
</ol>6. 미토콘드리아 탈극성 평가
<ol><li>4.2-4.4 단계를 수행하여 트립시화 및 원심 분리를 수행합니다.</li>
	<li>완전한 배지의 500 μL에서 세포를 다시 일시 중지한 다음 1× 105 - 6 × 106 세포로 조정된 세포 밀도를 조정합니다.</li>
	<li>각 튜브에 0.5mL의 JC-1 작업 솔루션을 추가합니다.</li>
	<li>세포 인큐베이터에서 세포를 37°C에서 20분 동안 배양한다. 참고: 인큐베이션 기간 동안, 5× JC-1 염색 버퍼1mL을 증류수 4mL에 추가하여 JC-1 염색 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>인큐베이션 후, 4°C에서 3분 동안 600 × g에서 세포를 원심분리합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 JC-1 염색 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.</li>
	<li>6.5 ~ 6.6 단계를 세 번 반복합니다.</li>
	<li>1.5mL 원심분리기 튜브에서 1mL의 얼음-차가운 염색 완충제에서 HCM을 다시 중단하고 30분 이내에 분석을 위해 세포를 사용합니다.</li>
	<li>세포내 JC-1 염료의 형광 강도를 측정하기 위해 PE(590 nm) 검출 채널 및 FITC(530 nm)를 선택한다. 참고: 5.10-5.17 단계를 따라 유동 사이토미터를 설정합니다.</li>
</ol>7. 반응성 산소 종 분석
<ol><li>4.2-4.4 단계를 수행하여 트립시화 및 원심 분리를 수행합니다.</li>
	<li>10 μM DCFDA로 배양 배지에 세포를 얼룩시키고 세포 밀도를 1 × 106 -1 × 10 7 세포로조절합니다.</li>
	<li>37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>3-5분마다 셀을 부드럽게 피펫으로 바릅니다.</li>
	<li>인큐베이션 후 혈청이 없는 세포 배양 배지로 세포를 세 번 씻는다.</li>
	<li>5.10-5.17 단계를 수행하여 유동 세포계의 세포를 분석합니다. 참고: DCF는 488nm에서 흥분하고 530 nm에서 측정된 방출 강도입니다.</li>
</ol>8. 카스파제 3/ 카스파스 8 활동 측정
<ol><li>4.2-4.4 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>4°C에서 600g× g에서 원심분리로 세포를 5분간 수집합니다.</li>
	<li>2 × 106 셀 당 100 μL의 lysate 버퍼를 추가합니다.</li>
	<li>얼음에 15 분 동안 세포를 lyse.</li>
	<li>얼음 욕조에서 15 분 동안 배양 한 후 샘플을 1.6 × 104 x g에서 15 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>상체를 얼음차가운 원심분리기 튜브로 옮겨 사용하십시오. 참고: 샘플의 단백질 농도는 적어도 1-3 mg/mL이어야 합니다.</li>
	<li>Ac-DEVD-pNA(2mM)를 제거하고 얼음 욕조에 놓아 사용하십시오.</li>
	<li>효소 라벨 플레이트에 40 μL의 완충액을 정확하게 추가하고, 시료의 80 μL을 추가하고, 마지막으로 Ac-DEVD-pNA(2mM)의 10μL을 추가합니다.</li>
	<li>샘플을 37°C에서 120분 동안 배양합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 마이크로 플레이트 판독기에서 A405 값을 측정했습니다. 참고: caspase-3/caspase-8에 의해 생성된 pNA에 의해 생성된 흡광도는 샘플의 빈 컨트롤의 A405 값을 빼서 계산됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+hypothermia+protect+cardiomyocytes+during+cardioplegic+ischemia.">How does hypothermia protect cardiomyocytes during cardioplegic ischemia.</a> European journal of cardiothoracic surgery. 40 (2), 352-359 (2011).</li><li>Diestel, A., Drescher, C., Miera, O., Berger, F., Schmitt, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+protects+H9c2+cardiomyocytes+from+H2O2+induced+apoptosis.">Hypothermia protects H9c2 cardiomyocytes from H2O2 induced apoptosis.</a> Cryobiology. 62 (1), 53-61 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha/BNIP3+signaling+pathway-induced-autophagy+plays+protective+role+during+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">HIF-1alpha/BNIP3 signaling pathway-induced-autophagy plays protective role during myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> BIOMEDICINE &amp; PHARMACOTHERAPY. 120, 109464 (2019).</li><li>An, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+IL-19+attenuates+acute+ischaemic+injury+and+improves+survival+in+male+mice+with+myocardial+infarction.">Exogenous IL-19 attenuates acute ischaemic injury and improves survival in male mice with myocardial infarction.</a> BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY. 176 (5), 699-710 (2019).</li><li>Han, Y. S., Schaible, N., Tveita, T., Sieck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinued+stimulation+of+cardiomyocytes+provides+protection+against+hypothermia-rewarming-induced+disruption+of+excitation-contraction+coupling.">Discontinued stimulation of cardiomyocytes provides protection against hypothermia-rewarming-induced disruption of excitation-contraction coupling.</a> EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY. 103 (6), 819-826 (2018).</li><li>Yarbrough, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibition+attenuates+contractile+dysfunction+following+cardioplegic+arrest+and+rewarming+in+the+setting+of+left+ventricular+failure.">Caspase inhibition attenuates contractile dysfunction following cardioplegic arrest and rewarming in the setting of left ventricular failure.</a> Journal of cardiovascular pharmacology. 44 (6), 645-650 (2004).</li><li>Egorov, Y. V., Glukhov, A. V., Efimov, I. R., Rosenshtraukh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+spatially+discordant+action+potential+duration+alternans+and+arrhythmogenesis+in+nonhibernating+versus+hibernating+mammals.">Hypothermia-induced spatially discordant action potential duration alternans and arrhythmogenesis in nonhibernating versus hibernating mammals.</a> AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-HEART AND CIRCULATORY PHYSIOLOGY. 303 (8), 1035-1046 (2012).</li><li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+Hypothermia+Modifies+Coronary+Hemodynamics+and+Endothelium-Dependent+Vasodilation+in+a+Porcine+Model+of+Temperature+Management.">Moderate Hypothermia Modifies Coronary Hemodynamics and Endothelium-Dependent Vasodilation in a Porcine Model of Temperature Management.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (3), 014035 (2020).</li><li>Dietrichs, E. S., Tveita, T., Myles, R., Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ECG-biomarker+for+cardiac+arrest+during+hypothermia.">A novel ECG-biomarker for cardiac arrest during hypothermia.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation &amp; Emergency Medicine. 28 (1), 27 (2020).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

세포의 다른 모형 사이 상호 작용을 포함하여 온전한 동물의 복잡성은 수시로 I/R 상해의 특정 분대의 상세한 연구 결과를 방지합니다. 따라서 생체 내에서 허혈 후 분자 변화를 정확하게 반영할 수 있는 체외 세포 모델을 확립할 필요가 있다. OGD 모델에 대한 연구는 이전에13,22,많은 정교한 방법이 설립되었습니다23,<sup class="xre...

허혈/재관류 유래 심근 기능 장애는 심장 수술 후 환자에서 일반적인 임상시나리오1,2. 비박식 낮은 유류 관류 및 총 순환 체포 기간 동안 모든 유형의 심장 세포와 관련된 손상은 여전히 발생합니다. 특히, 허혈성 상해에 심근세포의 감도는 그밖 세포 집단의 그것 보다는 더 높습니다. 현재, 치료 저체온증 (TH)은 심장 수술을 받은 환자에서 예상되는 허혈성 모욕에 대하여 상당한 보호를 제공합니다3,4. TH는 심장 수술중냉각의 정의에 관하여 아무 합의도 존재하지 않더라도 14-34°C의 코어 체온으로 정의됩니다5,6,7. 2013년, 국제 전문가 패널은 체계적인 저체온 순환 순환 정지8의다양한 온도 범위를 분류하기 위해 표준화된 보고 시스템을 제안했습니다. 뇌의 뇌전도 및 신진 대사 연구에 기초하여 저체온증을 4가지 수준으로 나누었습니다: 심오한 저체온증 (≤ 14°C), 깊은 저체온증 (14.1-20 °C), 중간 저체온증 (20.1-28 °C), 및 온화한 저체온증 (28.1-34 °C). 전문가 합의는 명확하고 균일한 분류를 제공, 연구가 더 비교하고 더 임상적으로 관련 된 결과를 제공 할 수 있도록. TH에 의해 제공되는 이 보호는 세포의 신진 대사 활동을 감소시키는 그것의 능력에 근거를 두고, 고에너지 인산염 소비의 그들의 비율을 더 제한하는9,10. 그러나, 심근 보호에서 TH의 역할은 논란의 여지가 있으며 저체온증의 정도에 따라 여러 가지 효과가있을 수 있습니다.
심근 I/R은 세포아포티코(11)를증가시켜 동반하는 것으로 잘 알려져 있다. 최근 보고는 개시 심장 수술 도중 프로그램된 심근세포 죽음이 증가하고, 괴사와 일치할 수 있다는 것을 관찰하고, 이로 인해 죽은 심근 세포의 수를증가시키는 12. 따라서 심근세포 세포증을 감소시키는 것은 임상 실습에서 유용한 치료 접근법이다. 마우스 심방 HL-1 심근세포 모델에서, 치료 저체온증은재퍼퓨전동안 시토크롬 c 및 세포증 유도 인자(AIF)의 미토콘드리아 방출을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, 아포토시스 조절에 있는 온도의 효력은 논쟁의 여지가 있고 저체온증의 정도에 의존하는 것처럼 보입니다. 쿠퍼와 동료들은 규범성 심폐 우회 대조군에 비해 깊은 저체온 순환정지를 가진 돼지로부터 심근조직의 자멸율이14로증가했다고 관찰했다. 또한, 일부 연구의 결과는 깊은 저체온증이 자멸 통로를 활성화할 수 있다는 것을 건의하고, 덜 공격적인 저체온증은 통로를 억제하는 것처럼 보이지만12,15,16. 이 결과에 대 한 이유는 허 혈 성 손상과 관련 된 혼란 효과 및 온도 심근 조직에 영향을 미치는 메커니즘의 이해의 부족 때문일 수 있습니다. 따라서, 자멸이 향상되거나 감쇠되는 온도 한계를 정확하게 정의해야 한다.
저체온증의 효능과 관련된 메커니즘을 더 잘 이해하고 인간에서의 구현을 위한 합리적인 기초를 제공하기 위해서는 재현 가능한 방식으로 임상 상태를 관찰한 것과 유사한 손상을 생성할 수 있는 생체 내 조건과 유사한 배양 상태를 식별하는 것이 필수적입니다. 이 목표를 달성하기 위한 필수적인 단계는 심근세포 세포증을 유도하기위한 최적의 조건을 확립하는 것입니다. 따라서, 본 연구에서는 허혈-재퍼퓨전의 시험관내 모델인 배양된 세포를 이용한 산소-포도당 박탈 실험에 관한 방법론적 세부 사항을 탐구하였다. 더욱이, 우리는 심근 세포사멸에 대한 상이한 저산소 허혈시간의 효과를 평가하고, 체외에서 세포 세포 세포 에 대한 다른 온도 조건의 효과에 관한 우리의 가설을 확인했습니다.

<table><tbody><tr><td>Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1062M</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac myocyte growth supplement</td><td>Sciencell,USA</td><td>6252</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 3 activity assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1115</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 8 activity assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C1151</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Gibco,USA</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium</td><td>Gibco,USA</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco,USA</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>CytoFLEX,USA</td><td>B49007AF</td><td></td></tr><tr><td>Human myocardial cells</td><td>BLUEFBIO,China</td><td>BFN60808678</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td><td>Bio-Technology,China</td><td>C2006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution</td><td>Gibco,USA</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Reactive oxygen species assay kit</td><td>Bio-Technology,China</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>Three-gas incubator</td><td>Memmert,Germany</td><td>ICO50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco,USA</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assessment of myocardial protection following hypothermia-preconditioning in a human cardiac myocytes model

허혈/재관류 유래 심근 장애는 심장 수술 후 환자에서 일반적인 임상 시나리오입니다. 특히, 허혈성 상해에 심근세포의 감도는 그밖 세포 집단의 그것 보다는 더 높습니다. 현재 저체온증은 예상되는 허혈성 모욕에 대해 상당한 보호를 받고 있습니다. 그러나, 복잡한 저체온증 유도 분자 변화에 대한 조사는 여전히 제한적입니다. 따라서, 재현 가능한 방식으로 임상 조건에서 관찰되는 것과 유사한 손상을 유도할 수 있는 생체 내 조건과 유사한 배양 상태를 식별하는 것이 필수적이다. 시험관 내의 허혈과 같은 조건을 모방하기 위해, 이 모형에 있는 세포는 산소/포도당 박탈에 의해 취급되었습니다 (OGD). 또한, 심장 수술 중에 사용되는 표준 시간 온도 프로토콜을 적용했습니다. 또한 심근 손상의 정량적 분석을 위해 간단하지만 포괄적인 방법을 사용하는 방법을 제안합니다. 세포세포증 및 세포증 관련 단백질의 발현 수준은 유동 세포측정및 ELISA 키트를 사용하여 평가되었다. 이 모델에서는 체외에서 심근세포 세포에 대한 다른 온도 조건의 영향에 관한 가설을 테스트했습니다. 이 모델의 신뢰성은 엄격한 온도 제어, 제어 가능한 실험 절차 및 안정적인 실험 결과에 따라 달라집니다. 추가적으로, 이 모형은 저체온증과 사용하기 위한 보완적인 치료의 발달을 위한 중요한 연루가 있을 수 있는 저체온심 심장 보호의 분자 기계장치를 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

HCM의 생존가능성에 대한 OGD 노출의 효과는 CCK-8 분석에 의해 결정되었다. 대조군에서 관찰된 것과 비교하여, 세포 생존가능성은 시간 의존적방식(도 2A)에서현저히 감소하였다. 재퍼퓨전 후 HMC의 세포사멸율은 0~16h, 세포사증 속도가 점차 증가하고 16h시간(그림 2B)에서최대 속도에 도달하는 특정 추세를 보였다. OGD가 12시간 감소세포 활성을 ~50%, 12h OGD로 ...

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

심근 보호에 저체온증의 다른 정도의 뚜렷한 영향은 철저하게 평가되지 않았습니다. 본 연구의 목표는 인간 심근세포 기반 모델에서 다른 저체온증 치료에 따른 세포 사멸 의 수준을 정량화하여 미래의 심층 분자 연구의 토대를 마련하는 것이었습니다.

인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

in-vitro-assessment-myocardial-protection-following-hypothermia

Research

JoVE Journal

Medicine

3.0K 조회수.  Children's Hospital of Nanjing Medical University. 심근 보호에 저체온증의 다른 정도의 뚜렷한 영향은 철저하게 평가되지 않았습니다. 본 연구의 목표는 인간 심근세포 기반 모델에서 다른 저체온증 치료에 따른 세포 사멸 의 수준을 정량화하여 미래의 심층 분자 연구의 토대를 마련하는 것이었습니다.

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A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

심근 국소 빈혈 및 Reperfusion의 Murine 폐쇄 가슴 모델

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

연구

의학

Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful for modeling ischemic injury associated with numerous clinically relevant phenomenon including cardiac surgery with cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass, off-pump CABG, transplant, angina, brief ischemia, etc. The protocol presents a general method to model hypothermic hyperkalemic cardioplegic arrest and reperfusion in rodent hearts focusing on measurement of myocardial contractile function. In brief, a mouse heart is perfused in langendorff mode, instrumented with an intraventricular balloon, and baseline cardiac functional parameters are recorded. Following stabilization, the heart is then subject to brief infusion of a cardioprotective hypothermic cardioplegia solution to initiate diastolic arrest. Cardioplegia is delivered intermittently over 2 hr. The heart is then reperfused and warmed to normothermic temperatures and recovery of myocardial function is monitored. Use of this protocol results in reliable depressed cardiac contractile function free from gross myocardial tissue damage in rodents.

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

심정지 체포와 심근 놀라운 연합의 쥐 절연 심장 모델

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Recovery Cardiopulmonary Bypass Model Without Transfusion or Inotropic Agents in Rats

Cardiopulmonary bypass (CPB) is indispensable in cardiovascular surgery. Despite the dramatic refinement of CPB technique and devices, multi-organ complications related to prolonged CPB still compromise the outcome of cardiovascular surgeries, and may worsen postoperative morbidity and mortality. Animal models recapitulating the clinical usage of CPB enable the clarification of the pathophysiological processes that occur during CPB, and facilitate pre-clinical studies to develop strategies protecting against these complications. Rat CPB models are advantageous because of their greater cost-effectiveness, convenient experimental processes, abundant testing methods at the genetic or protein levels, and genetic consistency. They can be used for investigating the immune system activation and synthesis of proinflammatory cytokines, compliment activation, and production of oxygen free radicals. The rat models have been refined and have gradually taken the place of large-animal models. Here, we describe a simple CPB model without transfusion and/or inotropic agents in a rat. This recovery model allows the study of the long-term multiple organ sequelae of CPB.

Here, we present a protocol to describe a simple recovery cardiopulmonary bypass model without transfusion or inotropic agents in a rat. This model allows the study of the long-term multiple organ sequelae of cardiopulmonary bypass.

수혈 또는 쥐 Inotropic 에이전트 없이 복구 심폐 바이패스 모델

Cardiopulmonary bypass (CPB) is indispensable in cardiovascular surgery. Despite the dramatic refinement of CPB technique and devices, multi-organ ...

면역학 및 감염병학

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering is crucial for basic science cardiac research; in vitro human cell culture eliminates the interspecies differences of animal models, while a more tissue-like 3D environment (e.g., with extracellular matrix and heterocellular coupling) simulates in vivo conditions to a greater extent than traditional two-dimensional culture on plastic Petri dishes. However, each model system requires specialized equipment, for example, custom-designed bioreactors and functional assessment devices. Additionally, these protocols are often complicated, labor-intensive, and plagued by the failure of the small, delicate tissues.
This paper describes a process for generating a robust human engineered cardiac tissue (hECT) model system using induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes for the longitudinal measurement of tissue function. Six hECTs with linear strip geometry are cultured in parallel, with each hECT&#160;suspended from a pair of force-sensing polydimethylsiloxane (PDMS) posts attached to PDMS racks. Each post is capped with a black PDMS stable post tracker (SPoT), a new feature that improves the ease of use, throughput, tissue retention, and data quality. The shape allows for the reliable optical tracking of post deflections, yielding improved twitch force tracings with absolute active and passive tension. The cap geometry eliminates tissue failure due to hECTs slipping off the posts, and as they involve a second step after PDMS rack fabrication, the SPoTs can be added to existing PDMS post-based designs without major changes to the bioreactor fabrication process.
The system is used to demonstrate the importance of measuring hECT function at physiological temperatures and shows stable tissue function during data acquisition. In summary, we describe a state-of-the-art model system that reproduces key physiological conditions to advance the biofidelity, efficiency, and rigor of engineered cardiac tissues for in vitro applications.

Three-dimensional cardiac tissues bioengineered using stem-cell-derived cardiomyocytes have emerged as promising models for studying healthy and diseased human myocardium in vitro while recapitulating key aspects of the native cardiac niche. This manuscript describes a protocol for fabricating and analyzing high-content engineered cardiac tissues generated from human induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes.

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

생체공학

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

순환사망 후 심장 기증 전 임상 모델

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

마우스에서 심근 경색을 연구하는 극저온 손상 모델

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation is an important risk factor for PGD, and reliable evaluation of cardiac function is essential to study the functional responses of the donor heart after cold preservation. The accompanying video describes a technique to assess murine right and left ventricular function using ex vivo perfusion based in a Langendorff model after cold preservation for different durations. In brief, the heart is isolated and stored in a cold histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solution. Then, the heart is perfused with a Kreb buffer in a Langendorff model for 60 min. A silicone balloon is inserted into the left and right ventricle, and cardiac functional parameters are recorded (dP/dt, pressure-volume relationships). This protocol allows the reliable evaluation of cardiac function after different heart preservation protocols. Importantly, this technique allows the study of cardiac preservation responses specifically in native cardiac cells. The use of very small murine hearts allows access to an enormous array of transgenic mice to investigate the mechanisms of PGD.

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Presented here is a protocol to reliably quantify the right and left ventricular function of donor hearts after cold preservation using an ex vivo perfusion system.

Langendorff 모델에서 생체 외 쥐 뇌실 기능 평가

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...