We would like to thank the American Cancer Society, Illinois Division (282802) and the National Science Foundation CBET (1512598) for funding support. We also would like to thank Dr. Dianwen Zhang from the University of Illinois Beckman Institute for microscopy training. Finally, we would like to thank Jared Weddell, Stacie Chen, and Spencer Mamer for insightful discussions.

1. 유리 표면 청소 및 준비 시약 <ol><li> 청소 50 % 전력에서 5 분 동안 산소 플라즈마 시스템에서 유리 표면을 놓는다. </li><li> APTES 50 μL 및 원뿔형 튜브에 2.45 mL의 에탄올을 첨가하여, 2.5 mL의 2 % 재구성 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (APTES) 용액을 제조 하였다. </li></ol> 2. APTES와 DSB의 기능화 <ol><li> 표면에 APTES 솔루션을 추가합니다. 8 웰 플레이트에 잘 당 피펫 150 μL. 24 웰 플레이트에 잘 당 피펫 100 μL. 60 X 15mm의 유리 접시 1.1 ml를 피펫. 증발 APTES 용액의 치우침을 방지하기 위해 표면을 커버한다. APTES 층의 고른 분포를 만들어 실온에서 50 분을위한 플랫폼 통의 표면을 놓습니다. 주 : APTES 표면의 제 1 층을 형성하는 아미노 실란이다. 다른면을 사용하는 경우에는 경험적으로 표면을 커버하는 데 필요한 용액의 부피를 결정한다. </li><li> 표면이 통에있는 동안, 오븐의 온도를 선택 : 열을 55 ° C로 8 웰 플레이트 2 시간 24 웰 플레이트에 대해. 열 유리 1 시간 동안 90 ° C 만 요리. </li><li> 에탄올로 표면을 씻어. <ol><li> 사용되는 표면에 기초한 참조하여 요구되는 에탄올의 양을 관리. 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 각 웰 24 웰 플레이트에 125 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 유리 접시 1.1 ml의 에탄올을 추가합니다. </li><li> 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 두 번 더 사용하여 에탄올을 씻어. 참고 : 유리 바닥 웰 플레이트의 그들에 어떤 플라스틱이있는 경우 플라스틱이 녹아 워프하기 시작으로, 65 ° C 이상을 가열하지 않습니다. </li></ol></li><li> 탱크로부터 분배 100 %의 질소 가스로 건조. 오의 표면을 배치VEN. </li><li> 2462.5에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 37.5 ㎕의 1.5 ㎎ / ㎖ DSB 결합하여 D-desthiobiotin (DSB) 용액 2.5 ml를 준비하고, 5 ㎎ / ㎖ 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 (EDC) 0.1 M 4 morpholinoethanesulfonic 산 수화물 (MES) (산도 6) 버퍼의 μL. 그런 다음 두 솔루션을 결합한다. </li><li> DSB 및 EDC의 반응을 해소하기 위해 용액에, 15 분 후, 2-β 머 캅토 에탄올의 1 μl를 추가합니다. 오븐에서 유리 표면을 기능화 뜨거운 APTES를 제거합니다. 냉각 유리 표면에 대해 5 ~ 10 분을 기다립니다. </li><li> MES 표면에 기초한 양을 사용하여 세척 할 표면 버퍼에 추가. 150 μL의 MES 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 125 μL의 MES 24 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 유리 접시 1.1 ML의 MES 버퍼를 추가합니다. </li><li> 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁 직접 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡고표면에. MES 버퍼와 두 번 더 씻어. </li><li> 그들이 부화 할 수 있도록 표면에 DSB 솔루션을 적용합니다. 8 웰 플레이트 잘 당 150 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 24 웰 플레이트 잘 당 100 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 유리 접시의 DSB 솔루션 1.1 ML을 추가합니다. </li><li> 페트리 접시 내부에 젖은 종이 타월에 DSB 덮여 유리 표면을 놓습니다. 덮고 18 ~ 24 시간 동안 4 ° C 냉장고에 품어. </li></ol> 3. 스트렙 타비 딘 작용 화 <ol><li> 1.0 배 인산염 완충액 (PBS) 1 ml를 각각 유리 표면을 세 번 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 0.4 밀리그램에 스트렙 타비 딘 (SAV) 원액을 희석 / ㎖ (권장). 주 : 희석 및 세척을위한 매체로서 이용 될 수 있도록 PBS가 등장한다. PBS는 SA를위한 용매로서 사용되는V, 따라서 표면에 결합하는 SAV의 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. </li><li> 유리의 아래쪽 형태의 얇은 층이 표면에 기반 용액의 양을 선택할 수 있도록 표면에 균일 SAV 용액 0.4 ㎎ / ㎖을 적용한다. 8 웰 플레이트를 들어, 웰 당 150 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 24 웰 플레이트를 들어, 웰 당 100 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 유리 접시를 들어, 1.1 ml의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 커버와 수분을 유지하기 위해 14cm 페트리 접시에 접시를 이동합니다. 18 ~ 24 시간 동안 냉장고에 페트리 접시를 품어. 참고 : 각면에 APTES, DSB 및 SAV의 일관된 볼륨을 사용하는 것이 필수적이다. </li><li> SAV을 제거하기 위해 각각의 유리 표면을 PBS 150 ㎕를 3 회 헹군다. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. </li><li> 종이 타월 w 젖은i 번째 탈 이온수와 우물에 수분을 유지하기 위해 판을 주변 14cm 페트리 접시에 평평한 종이 타월을 배치합니다. 웰을 함유하는 페트리 접시 커버. 필요할 때까지 4 ° C 바이오 안전성 레벨 1 (BSL-1) 냉장고에 페트리 접시를 품어. </li></ol> 4. 셀 캡처 및 릴리스 <ol><li> 실험을위한 세포의 T175 플라스크 (들)로 시작합니다. 플라스크 (들)에서 미디어를 대기음. 실온 PBS 5 ㎖로 나머지 용지를 세척 할 것. 플라스크 (들)에서 대기음 PBS. </li><li> 세포의 T-175 플라스크에, 이러한 세포 해리 솔루션 등의 비 효소 리​​프팅 제 10 ㎖를 추가합니다. 플라스크에서 세포의 리프팅 수 있도록 6 분 동안 인큐베이터에서 플라스크를 넣습니다. </li><li> 6 분 후, 차가운 행크의 균형 소금 용액 10ml를 추가 (HBSS를, 재료의 목록 참조) 리프팅 에이전트를 비활성화 할 수 있습니다. hemacytometer를 사용하여 솔루션에서 세포의 수를 계산하는 세포의 20 μl를 꺼냅니다. 주 : FUNC에 따라캡처 실험에 사용 된 표면 tionalized 필요한 세포의 수는 변한다. 작용 8 웰 플레이트를 들어, 잘 당 30 만 셀을 사용합니다. 작용 유리 접시를 들어, 110 만 셀을 사용합니다. 기능화 된 24 웰 플레이트를 들어, 125,000 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 계수에 대한 자세한 내용은 부록에서 발견된다. </li><li> 단계를 반복 4.1- 4.3 세포의 또 다른 플라스크를 들어, 적은 세포 실험에 필요한 것보다있는 경우. 솔루션에서 세포의 총 수를 얻기 위해 세포 현탁액 및 재계 세포를 결합합니다. </li><li> 집중 세포의 펠렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기에 세포 현탁액을 스핀. 다음 ml의 당 1 × 10 6 세포의 농도를 얻을 스핀 다운 세포에서 뜨는을 대기음하고, 계산 된 볼륨을 추가하기 위해 세포 현탁액에 추가 할 HBSS의 적절한 양을 찾습니다. 이 볼륨은 부록의 방정식을 사용하여 계산 될 수있다. </li><li> 피펫 상하 (씹다) 일을 재현 탁하기솔루션 전자 세포와 항체 결합을 감소시킬 수있다 용액에 세포 응집을 줄일 수 있습니다. 별도의 제어 및 실험 솔루션에 셀룰러 솔루션을 분할합니다. 구성 요소와 계산을위한 보충 파일을 볼 수 있습니다. </li><li> 보조 파일에 기술 된 바와 같이, 각 세포 용액을 비 오티 닐화 된 항체를 추가한다. 엔드 오버 엔드 믹서에 4 ° C에서 30 분 동안 품어. 참고 : MCF7GFP 세포, 0.5 ㎎ / ㎖ hIgG 0.5 ㎎ / ㎖ HLA-ABC 항체를 들어 권장합니다. RAW 대 식세포를 들어, 1 ㎎ / ㎖ mCD11b은 희석 차이를 설명하기 위해 절반 볼륨을 권장합니다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) 0.5 mg을 들어 / ㎖ hCD31 권장합니다. </li><li> HBSS로 작용 유리 표면을 세척 할 것. 이 실험을 위해, 8 웰 플레이트를 권장합니다. <ol><li> 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 추가합니다. HBSS를 사용하여 두 번 더 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어.팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 4 ℃에서 저온 보관하십시오. </li></ol></li><li> 우물에 셀 솔루션을 추가하고 세포가 셰이커에 얼음에 부화를 위해 45 분을 기다립니다. 는 Supplement에 설명 된대로 계산 볼륨을 사용하여 무균 HBSS에 비오틴의 솔루션을합니다. </li><li> HBSS를 사용하여 유리 웰의 세포 용액을 제거한다. <ol><li> 조심스럽게 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 피펫. 그런 다음 HBSS을 피펫. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. </li><li> 두 번 더 반복합니다. 세안 후 젖은 세포를 유지하기 위해 우물에 HBSS를 추가합니다. </li></ol></li><li> 또한 각각의 릴리스에 20 mM의 비오틴 용액 150 μl를 추가 한 다음 반응을 허용하는 20 분을 기다립니다. </li><li> 비특이적으로 결합 된 세포를 채취HBSS로 세척하여 (S)는 전술 한 바와 후 형광 표지 된 세포를 사용하는 경우, 화상을 세포를 형광으로 진행. 또한, 플라스크 내의 화상 생균 (a 대조군으로는 웰의 세포와 비교). 녹색 형광 단백질 (GFP) 형질 감염된 세포를 사용하는 경우, 470 nm의 여기 것이고, 방출 515 nm 인 것이다. </li></ol> 5. 항체 최적화 : 항체 적정 <ol><li> 단계 4.1- 4.3에 설명 된대로 T75 또는 T175 플라스크에서 세포를 올려 시작합니다. 참고 :이 볼륨을 24 웰 플레이트에 대한 교정되어 있지만, 경험적 테스트를 통해 모든 유리 작용 표면에 맞게 변경할 수 있습니다. 대표적인 항체 적정는 그림 1과 같다. </li><li> hemacytometer를 이용하여 세포 수를 계산하고, 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 튜브에 세포 용액을 스핀. 는 Supplement에 설명 된 계산을 이용하여, 용액 100 만 세포에 세포를 재구성한다. </li><li> 1 미터 분할항체 (AB) 솔루션에 대한 다른 원심 분리기 튜브에 500 ㎕의 6 가지 솔루션으로 ㎖의 용액 당 illion 세포. <ol><li> 10 ㎍ / ㎖, 1 μg의 / ㎖, 100 ng를 / ㎖, 10 ng를 / ㎖, 1 NG / ㎖의 항체 원액을 희석. 얼룩 완충액 (PBS + 1 % 아 지드 화 나트륨 + 1 % BSA) 100 ㎕ 및 가지지과 AB 컨트롤 세포 500 μl를 사용하여 제어를 만든다. 빈 제어를 위해 (없음 순이없이 세포), 300 ㎕의 PBS 용액을 사용하지 않습니다. 참고 :주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이 폭발하고, 그것을 사용하는 경우 극도의주의를 기울여야합니다. 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하여 적절한 안전 장비를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 결합하고 30 분 동안 4 ℃에서 엔드 오버 엔드 혼합기 셀 솔루션 구간 솔루션을 배양한다. HBSS로 3 회 기능화 된 24 웰 플레이트를 씻어. 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 파이를 잡고pette 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도. </li><li> 적절한 APTES에 각 시료 용액의 분취 량 125 ㎕를가 DSB 및 SAV 잘 관능. 39 ° C에서 또는 유리 표면에 45 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 비특이적으로 부착 된 세포를 제거하는 HBSS로 3 회 표면을 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 그 컨트롤과 마찬가지로, 맨 아래 행을 씻어하지 마십시오. </li><li> 잘 세척 각 HBSS 150 μl를 추가 얼음에 24 잘 접시를 넣어, 다음 GFP 세포 (여진 485 nm의 / 방출 528 ㎚)의 형광을 측정하는 플레이트 리더를 사용합니다. </li></ol> 6. 셀 최적화 : 셀의 적정 <ol><li> 단계 4.1 -4.3에서 언급 한 바와 같이 세포를 올립니다. </li><li> hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 그래서 세포를 스핀 다운4 ° C에서 5 분 500 XG에 원뿔 튜브에 lution. ml의 당 1,000,000 세포에 세포를 복원합니다. 참고 : hemacytometer의 사용에 대한 자세한 내용은 부록에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 피펫 원뿔 튜브에 160 만 셀 재고 및 장소 셀 솔루션에서 1.6 ml의. 원뿔 관에서 80 만 셀 재고 및 장소에 대한 세포 용액으로부터 세포를 800 μl를 피펫. 피펫 원뿔 관에서 80,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 80 μL. 피펫 원뿔 관에서 8,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 8 μL. 참고 : 농도는 필요에 따라 복제, 8 웰 플레이트 측정에 따라 제공됩니다. 플레이트 출력의 예는도 2에 도시되어있다. </li><li> 네 원액을 가지고 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기의 회전. HBSS 400 μL의 모든 재고 솔루션을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 는 160 만 셀 재고로 100 NG / ㎖ 항체의 1.6 μl를 추가 0.8 μ800,000 셀 재고에 리터, 그리고 다른 모든 주식 0.5 μL. 4 ℃에서 30 분 동안 엔드 오버 엔드 혼합기에서 30 분 동안 인큐베이션 항체. HBSS로 3 회 작용 유리 표면을 세척 할 것. 주 : 기능화 된 24 웰 플레이트는 플레이트 리더 정량화하는 것이 좋습니다 동안 작용 8 웰 플레이트, 현미경 정량화하는 것이 좋습니다. 8000 세포 주식에 대한 항체 농도는 용액 중의 항체의 부족하지 않다고 포집 표면의 제한 요소를 허용하도록 감소하지만되지 않고 표면의 촬상 특성. </li><li> 각 웰에 샘플 솔루션의 150 μl를 적용합니다. 왼쪽에있는 우물의 첫 번째 열에에 160 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 두 번째 컬럼에 80 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 세 번째 열에에 80,000 세포 주식을 적용합니다. 마지막으로 마지막 열까지 8,000 셀 주식을 적용합니다. 진탕 기에서 4 ° C에서 45 분 동안 품어. 참고 : 160 만세포 스톡 시험 될 최고의 농도로 제공하며, (600,000 셀 웰 당) 세포 분리 실험에 통상적으로 사용되는 것이 일반적인 셀룰러 농도 그대로 800,000 세포 스톡 실험을위한 대조군으로 제공되는 세포의 두 배이며 즉 (웰당 300 세포) 세포 분리 실험에 사용된다. 80,000 세포 주식은 휴대 캡처 낮은 농도 (물론 당 30,000 세포)를 테스트 할 수있는 10 배 희석 역할을한다. 백 배 희석 세포 분리의 하한 (물론 3,000 세포)를 확인하는 테스트로 사용할으로 8000 셀 주가는 역할을한다. </li><li> HBSS로 3 회 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 모든 세척를 수집합니다. </li><li> 이미지는 형광 현미경에 세포를 8 웰 플레이트를 사용하는 경우, 각 SUR를 촬영할얼굴과 진탕 기에서 4 ° C에서 1 시간 동안 각면에 150 μL 비오틴을 적용합니다. 일시간 후, 이전과 HBSS 3 회와 비오틴 릴리스 우물을 씻어. 혈구와 이미지 릴리스 우물에 카​​운트 우물에서 모든 세척를 수집합니다. </li><li> 24 웰 플레이트를 사용하는 경우, 1 시간 동안 비오틴 릴리스 우물을 적절한 다음 HBSS로 그 우물 3 번 씻어 20 밀리미터를 초과하는 비오틴 용액 150 μl를 적용합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 24 웰 플레이트를 정량. 수집 된 모든 잘 세척에서 세포를 계산하기 위해 hemacytometer를 사용합니다. </li></ol> 7. 이미지 분석 참고 : 피지 소프트웨어 패키지 (http://fiji.sc/Fiji) 이미지 분석을 권장합니다. 초기에, 이미지를 그레이 스케일 이미지로 변환 한 후, 휘도 / 콘트라스트 셀을 가지고 변경 하였다. <ol><li> 이미지를로드하고, &quot;유형&quot;아래로 스크롤 한 다음 이미지 탭을 클릭 한 다음 클릭하여 그레이 스케일로 변환4 8 비트 &quot;. </li><li> 이미지 탭을 클릭 한 다음 &quot;조정&quot;으로 스크롤하여 이미지의 대비를 높입니다. &quot;밝기와 대비&quot;를 클릭 한 다음 세포가 눈에 띄는 수 있도록 스크롤 막대를 사용합니다. 형광 이미지를 사용하는 경우,보다 한정된 세포를 확인하기 위해 이미지를 반전한다. </li><li> ImageJ에이 이미지를 분석하는 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) ITCN 전화에 플러그인을로드합니다. </li><li> 열기 ITCN. 대화 상자는 해당 셀의 크기를 추정하기 위해 여러 매개 변수를 사용자에게 프롬프트를 표시 할 때, 제 관심 셀의 최소 폭을 설정한다. 이미지가 형광 및 세포를 어둡게하는 경우 &quot;감지 다크 봉우리&quot;옵션을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;개수&quot;버튼을 클릭 한 후 처음 2의 임계 값을 설정합니다. 사진의 새로 계산 버전은 세포가 계산 된 위치를 서술 빨간 점으로 표시됩니다. </li><li> defini보다 정확한 셀룰러 데이터를 얻을 수있는 임계 값과 폭 매개 변수를 조정는 &quot;셀&quot;의 크기 겨. 참고 : 오른쪽의 대화 상자에있을 것입니다 계산 세포의 수입니다. 매개 변수 변경 카운트 세포의 다른 수를 줄 것이다. </li><li> 좋은 추정치는 세포의 수에 도달 할 때까지 임계 값 및 폭 매개 변수를 통해 반복을 계속합니다. </li></ol>

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S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-performance+microsystem+for+isolating+circulating+tumor+cells.">A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells.</a> Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).</li><li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+cell-to-cell+variation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptors.">Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors.</a> Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).</li><li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+VEGF+receptors+on+endothelial+cells+in+mouse+skeletal+muscle.">Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).</li><li>Ludwig, A., Kretzmer, G., Sch&#252;gerl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+&amp;#34;critical+shear+stress+level&amp;#34;+applied+to+adherent+mammalian+cells.">Determination of a &amp;#34;critical shear stress level&amp;#34; applied to adherent mammalian cells.</a> Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).</li><li>Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-by-cell+profiling+reveals+temporal+dynamics+of+VEGFR1+and+VEGFR2+membrane-localization+following+murine+hindlimb+ischemia.">Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia.</a> Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li><li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+profiling+of+VEGFRs+reveals+tumor+cell+and+endothelial+cell+heterogeneity+in+breast+cancer+xenografts.">Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts.</a> Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).</li><li>BD Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CD Marker Handbook: Human and Mouse. , (2010).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Processing Blood. , (2014).</li><li>Fukuda, S., Schmid-Sch&#246;nbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+attenuates+the+fluid+shear+response+of+circulating+leukocytes.">Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).</li><li>dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+shear-stress-induced+VEGF+expression+in+endothelial+cell+survival.">Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival.</a> J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).</li><li>Allard, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+Diseases+Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+diseases.&amp;#34.">Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.&amp;#34.</a> Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).</li><li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology.">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li><li>Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QFlow+Cytometer-Based+Receptoromic+Screening:+A+High-throughput+Quantification+Approach+Informing+Biomarker+Selection+and+Nanosensor.">QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor.</a> Submiss. , (2016).</li><li>Vasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+migratory+activity+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+inversely+correlate+with+risk+factors+for+coronary+artery+disease.">Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease.</a> Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).</li><li>Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Avidin-Biotin+Technology:+Literature+Survey.">Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey.</a> Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+labeling+of+cancer+marker+Her2+and+other+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dots.">Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots.</a> Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).</li><li>Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+quantum+dot+calibration+standards+for+quantitative+fluorescent+profiling.">Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).</li><li>Hornes, E., Korsnes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , (1996).</li><li>Naranbhai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+blood+processing+variations+on+natural+killer+cell+frequency,+activation,+chemokine+receptor+expression+and+function.">Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function.</a> J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).</li><li>Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+solution-phase+and+vapor-phase+deposition+of+aminosilanes+on+silicon+dioxide+surfaces.">Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces.</a> Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

세포 분리 기술의 향상은 혈관 생물학 (19)의 세포 재생 생물학 프로그래밍 및 혈관 신생 신호 줄기, 신경 과학 (18)의 구조 - 기능 관계의 과학적 연구를 발전한다. 실제로, 일차 세포 배양 물 (20)은 (예 된 HUVEC), 혈관 생물학 주로 세포 분리 기술의 사용을 통해 수행된다. 세포 격리는 최근 세포막 수용체 3,14,15,19,21 정량적 흐름 (qFlow) 계측법 분석에 사용 하였?...

현재 벤치 탑 세포 분리 방법 (예, 형광 활성화 셀이 1 정렬, 레이저 캡처 마이크로 해부 (2), 면역 자기 비드 분리 1) 준비 및 정렬의 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 큰 시간 규모는 생리적 반응 (3)의 대표하지 분석 결과, 생리적 반응과 표현 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 시스템은 신속하고 효율적으로 생체 의학 애플리케이션에 세포 분리 및 농축을 향상시키기 위해 세포 표면 수용체 수준을 중단없이 특정 세포 유형을 분리 할 수​​있는 요구된다. 따라서, 우리의 접근 방식에 대한 이론적 근거는 세포 분리를위한 부드러운 접근 방식을 개발하는 것입니다. 은 &quot;칩에 연구소는&quot;개념은 크기 빨리 (시간 - 투 - 분) 세포 분리의 주문 약속을 제공하며, 가장 자주 표면에 세포를 캡처하고 세포 또는 세포 내 콩트를 방출 포함물리 4,5를 통해 국세청 또는 화학적 방법 6. 이러한 방법은 체외 배양 (12, 13)에 대한 세포를 제공하는 경우에도 RNA 발현 9-11, 식별, 단백질 7,8 식을 식별하거나 몇 가지 장점을 제공하지만, 이러한 기술의 대부분은 이러한 세포 수용체 프로파일로 인해에게로 진단로 번역 할 수 없습니다 자신의 비 생리 학적 환경. 이러한 정확한 생리 학적 데이터를 생성하지 않습니다이 해제 에이전트를 사용하여 세포 수용체의 정량화 기법을 의미 이러한 수용체 수량 14, 15에 영향을 미칠 수있는 콜라게나, 같은 효소 리프팅 에이전트. 세포 용해는 기본 표면 수용체 사이의 분화를 방지하고 이전 16 내재화 된 것과. 이 프로토콜은 세포 분리를위한 빠르고 부드러운 접근 방식을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>919-30-2</td>
			<td>Used to make 2% APTES solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner Pico</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Model 1</td>
			<td>Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Desthiobiotin (DSB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D20655</td>
			<td>Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>British Drug Houses (BDH)</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td>Dissolves the DSB into solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>5g: 22980 
			25g: 22981</td>
			<td>Activates Carboxylic Acids and allows binding of proteins to glass surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uncoated 8-well culture slide</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>Case of 24: 354118 
			Case of 96: 354108</td>
			<td>Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 24-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G-0-13-F</td>
			<td>Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>Used to quench reaction between EDC and DSB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate 
			(MES Hydrate 99%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC172590250</td>
			<td>Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11-475-153</td>
			<td>Used in curing of PDMS and APTES layer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titramax 1000 Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>13-889-420</td>
			<td>Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Streptavidin 5mg 
			[e7105-5mg]</td>
			<td>Proteo Chem</td>
			<td>9013-20-1</td>
			<td>Biotin-binding protein 
			May cause irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm Glass Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08748A</td>
			<td>Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm Petri Dish with Cover</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z717231</td>
			<td>Used to hold samples being functionalized and transport them.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7-GFP cells</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>AKR211</td>
			<td>Stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 
			mouse macrophages</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Stored in 100mL at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC</td>
			<td>50003PC</td>
			<td>Supplier: Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>Already added into DMEM by facility. 
			Supplier: Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>Stored in 500mL at &#60; -10&#8304;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td>Life Sciences Storeroom at UIUC</td>
			<td>17602e</td>
			<td>Supplier: VWR 
			Stored in 100 ml at 4&#8304;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-58</td>
			<td>Small 23cm 50 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-056CI</td>
			<td>Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td>Used to release cells from surface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Created from Recipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. (Adapted from Cold Spring Harbor Protocols): In 500 mL, use 4 g NaCl, .2 g KCl, .0402 g Na2PO4*7H2O, .03 g KH2PO4 and .5 g Glucose. Add DI water to get to 500 mL, filter, and then refrigerate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-ABC Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>311402</td>
			<td>Antibody used to capture MCF7gfp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hIgG Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>HP6017</td>
			<td>Antibody used to capture MCF7gfp cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7 GFP cells</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>AKR-211</td>
			<td>Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted Conicals</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>15mL: 12-565-268</td>
			<td>50/15 mL plastic conicals for storing solutions and aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td>Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Desalting columns</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>PI-87770</td>
			<td>Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo- Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HTX Multimode Reader</td>
			<td>Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of targeted cell isolation via glass surface functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

우리는 세포 포착 (도 3A) 및 MCF7GFP 세포의 세포 분리 (도 3C)뿐만 아니라, 생균 제어 (도 4)이 표시 프로토콜 사용. 60 % 및 80 % (그림 3C) 발표 된 바와 같이 우리는 세포 캡처를 정량화. 우리는 RAW 264.7 대식 세포 및 MCF7GFP 세포의 혼합물에이 방법을 확장하면, RAW 식세포의 50 %를 점령 하였다 (도. 3D) 및 RAW 식세포의 8...

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A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.3K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process. 

비디오: A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

연구

암 연구학

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light.
To increase the therapeutic effect of PDT, we developed both photosensitizer- and anticancer agent-loaded lung cancer-targeted nanoparticles. Both enhanced permeability and retention (EPR) effect-based passive targeting and hyaluronic-acid-CD44 interaction-based active targeting were applied. CD44 is a well-known hyaluronic acid receptor that is often introduced as a biomarker of non-small cell lung cancer. 
In addition, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may increase anticancer therapeutic effects and reduce adverse reactions. 
We chose hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in this study. It has been reported that HB causes higher anticancer efficacy of PDT compared to hematoporphyrin derivatives1. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for lung cancer2. 
The antitumor efficacies of photosensitizer (HB) solution, photosensitizer encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT were compared both in vitro and in vivo. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.
The HB-P-NP treatment group showed the most effective anticancer effect after PDT. In conclusion, the HB-P-NPs prepared in the present study represent a potential and novel photosensitizer delivery system in treating lung cancer with PDT.

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative choice for lung cancer treatment. To increase the therapeutic effect of PDT, lung cancer-targeted nanoparticles combined with chemotherapy were developed. Both in vitro and in vivo anticancer efficacies of PDT with prepared nanoparticles were evaluated.

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly indicate that aneuploidy triggers genome instability, ultimately generating cells with complex karyotypes that arrest their proliferation. Isolation and characterization of cells harboring complex karyotypes are crucial to study the impact of an imbalanced chromosome number on cell physiology. To date, no methods have been established to reliably isolate such aneuploid cells. This paper provides a protocol for the enrichment and analysis of aneuploid cells with complex karyotypes utilizing standard, inexpensive tissue culture techniques. This protocol can be used to analyze several features of aneuploid cells with complex karyotypes including their induced senescence-associated secretory phenotype, pro-inflammatory properties, and ability to interact with immune cells. Because cancer cells often harbor imbalances in chromosome number, it is crucial to decipher how aneuploidy impacts cell physiology in normal cells, with the ultimate goal of uncovering both its pro- and anti-tumorigenic effects.

Aneuploidy leads to genome instability, which eventually produces cell cycle-arrested cells with complex karyotypes. This paper provides a simple and convenient method to isolate aneuploid cells with complex karyotypes that cease to divide.

생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic spread has already occurred. However, ovarian cancer has a unique pattern of metastatic spread, in that tumor implants are initially contained within the peritoneal cavity. This feature could enable, in principle, the complete resection of tumor implants with curative intent. Many of these metastatic lesions are microscopic, making them hard to identify and treat. Neutralizing such micrometastases is believed to be a major goal towards eliminating tumor recurrence and achieving long-term survival. Raman imaging with surface enhanced resonance Raman scattering nanoprobes can be used to delineate microscopic tumors with high sensitivity, due to their bright and bioorthogonal spectral signatures. Here, we describe the synthesis of two &#39;flavors&#39; of such nanoprobes: an antibody-functionalized one that targets the folate receptor &#8212; overexpressed in many ovarian cancers &#8212; and a non-targeted control nanoprobe, with&#160;distinct spectra. The nanoprobes are co-administered intraperitoneally to mouse models of metastatic human ovarian adenocarcinoma. All animal studies were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The peritoneal cavity of the animals is surgically exposed, washed, and scanned with a Raman microphotospectrometer. Subsequently, the Raman signatures of the two nanoprobes are decoupled using a Classical Least Squares fitting algorithm, and their respective scores divided to provide a ratiometric signal of folate-targeted over untargeted probes. In this way, microscopic metastases are visualized with high specificity. The main benefit of this approach is that the local application into the peritoneal cavity &#8212; which can be done conveniently during the surgical procedure &#8212; can tag tumors without subjecting the patient to systemic nanoparticle exposure. False positive signals stemming from non-specific binding of the nanoprobes onto visceral surfaces can be eliminated by following a ratiometric approach where targeted and non-targeted nanoprobes with distinct Raman signatures are applied as a mixture. The procedure is currently still limited by the lack of a commercial wide-field Raman imaging camera system, which once available will allow for the application of this technique in the operating theater.

Ovarian cancer forms metastases throughout the peritoneal cavity. Here, we present a protocol to make and use folate-receptor targeted surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobes that reveal these lesions with high specificity via ratiometric imaging. The nanoprobes are administered intraperitoneally to living mice, and the derived images correlate well with histology.

표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 Folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 Nanoprobe Ratiometry 대상

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for safe and effective therapies tailored to individual tumor immune profiles. Oncolytic viruses enable the induction of anti-tumor immune responses as well as tumor-restricted gene expression. This protocol describes the generation and ex vivo analysis of immunomodulatory oncolytic vectors. Focusing on measles vaccine viruses encoding bispecific T cell engagers as an example, the general methodology can be adapted to other virus species and transgenes. The presented workflow includes the design, cloning, rescue, and propagation of recombinant viruses. Assays to analyze replication kinetics and lytic activity of the vector as well as functionality of the isolated immunomodulator ex vivo are included, thus facilitating the generation of novel agents for further development in preclinical models and ultimately clinical translation.

This protocol describes a detailed workflow for the generation and ex vivo characterization of oncolytic viruses for expression of immunomodulators, using measles viruses encoding bispecific T cell engagers as an example. Application and adaptation to other vector platforms and transgenes will accelerate the development of novel immunovirotherapeutics for clinical translation.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small molecule drug discovery. This class of compounds induces protein degradation by bringing into proximity the target protein and the E3 ligase machinery proteins required to ubiquitinate and ultimately degrade the target protein through the ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profiling of target protein degradation in a high-throughput fashion, however, remains highly challenging given the complexity of cellular pathways required to achieve degradation. Here we present a protocol and screening strategy based on the use of CRISPR/Cas9 endogenous tagging of target proteins with the 11 amino acid HiBiT tag which complements with high affinity to the LgBiT protein, to produce a luminescent protein. These CRISPR targeted cell lines with endogenous tags can be used to measure compound induced degradation in either real-time, kinetic live cell or endpoint lytic modes by monitoring luminescent signal using a luminescent plate-based reader. Here we outline the recommended screening protocols for the different formats, and&#160;also describe the calculation of key degradation parameters of rate, Dmax, DC50, Dmax50, as well as multiplexing with cell viability assays. These approaches enable rapid discovery and triaging of early stage compounds while maintaining endogenous expression and regulation of target proteins in relevant cellular backgrounds, allowing for efficient optimization of lead therapeutic compounds.

This protocol describes the quantitative luminescent detection of protein degradation kinetics in living cells that have been engineered using CRISPR/Cas9 to express antibody free endogenous protein detection tag fused to a target protein. Detailed instructions for calculating and obtaining quantitative degradation parameters, rate, Dmax, DC50, and Dmax50 are included.

HiBiT CRISPR 세포주를 사용한 표적 단백질 분해 화합물의 고처리량 세포 프로파일링

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers that cause LMD are breast and lung cancers and melanoma. Patients diagnosed with LMD have a very poor prognosis and generally survive for only a few weeks or months. One possible reason for the lack of efficacy of systemic therapy against LMD is the failure to achieve therapeutically effective concentrations of drug in the CSF because of an intact and relatively impermeable blood-brain barrier (BBB) or blood-CSF barrier across the choroid plexus. Therefore, directly administering drugs intrathecally or intraventricularly may overcome these barriers. This group has developed a model that allows for the effective delivery of therapeutics (i.e., drugs, antibodies, and cellular therapies) chronically and the repeated sampling of CSF to determine drug concentrations and target modulation in the CSF (when the tumor microenvironment is targeted in mice). The model is the murine equivalent of a magnetic resonance imaging-compatible Ommaya reservoir, which is used clinically. This model, which is affixed to the skull, has been designated as the &#34;Murine Ommaya.&#34; As a therapeutic proof of concept, human epidermal growth factor receptor 2 antibodies (clone 7.16.4) were delivered into the CSF via the Murine Ommaya to treat mice with LMD from human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. The Murine Ommaya increases the efficiency of drug delivery using a miniature access port and prevents the wastage of excess drug; it does not interfere with CSF sampling for molecular and immunological studies. The Murine Ommaya is useful for testing novel therapeutics in experimental models of LMD.

Here, we describe a murine xenograft model that functionally resembles an Ommaya reservoir in patients. We developed the Murine Ommaya to study novel therapeutics for the universally fatal leptomeningeal disease.

렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...