이 작품은 국립 연구소의 건강 그랜트 (CA206157-22와 GM118066) 커트 대리석 암 연구 기금 Angelika 아 몬에 의해 코흐 연구소 지원 (코어) 부여 P30-CA 14051 국립 암 연구소에서 의해 부분에서 지원 되었다. Angelika 아 몬 하 워드 휴즈 의학 연구소와 생물 의학 연구에 대 한 글렌 재단의 조사 이기도합니다. S. S. 여는 미국 이탈리아 암 재단 (AICF), 마리 퀴리 작업 및 이탈리아 협회 대 한 암 연구 (AIRC), 암 연구에 협력 하 여 그리고 기 사도좌 암 연구 장학금에 의해 지원 되었다. 전자기장 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 장학금에 의해 지원 되었다.

문화 조건
RPE 1 hTERT 셀 라인은 매체에 있는 Dulbecco의 수정이 글 (자료 테이블) 10% 보충 교양 소 태아 혈 청, 2 m L-글루타민, m 그리고 100 U/ml 페니실린/스. 셀 5% CO2 습도 환경에서 37 ° C에서 incubated 했다. 10 cm 요리를 사용 하 여 개발 되었습니다 아래에 설명 된 프로토콜을 모든 기술적인 세부 사항 보고 그 요리를 합니다. 다른 요리를 사용 하는 경우 확장 또는 그에 따라 아래로.
1입니다. RPE-1 셀의 동기화
<ol><li>모든 실험에 대 한 15 개 이상의 구절 하지 받은 갓 해 동된 셀을 사용 합니다. 1 일에 해 동 하 고 분배 ~2.5-10 cm 조직 문화 접시에 105 RPE 1 hTERT 셀 x 5.0. 표준 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 밤새 품 어. (예: hemocytometer) 표준 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다. 참고: 셀 밀도 RPE-1 세포의 성장 상태를 말합니다. 성장 조건이 다른 셀 라인; 사이에서 다를 수 있습니다. 그에 따라 그들을 조정 하십시오.</li>
	<li>하루에 2, g 1/S 테두리에서 셀 일반 성장 매체를 발음 5mm 티 미 딘을 포함 하는 8 mL 매체를 추가 하 여 동기화 합니다. 참고: 티 미 딘 농도 치료의 길이 다른 세포 라인에 걸쳐 달라질 수 있습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최상의 조건을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>당일 3, 티 미 딘 매체 (1.2 단계)를 추가한 후 24 h, 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS로 세포 세척 하 여 티 미 딘 블록에서 놓습니다. 일반 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
</ol>2.이 세대 Mitotic 키 Mps1의 활동을 방해 하 여 세포
<ol><li>에 티 미 딘 블록에서 하루 3, 출시 후 6 h (1.3; 단계 세포 유사 분열을 입력 하기 전에이 약 3-6 h는), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 500 nM reversine (Mps1 억제제)를 포함 하는 매체를 바꿉니다. 참고: RPE-1 세포는 유사 분열 9-12 h를 입력 후에 티 미 딘 워시 아웃10,11. 그러나, 세포 주기 론 다른 셀 라인 마다 다릅니다. 따라서, 그것은 (예를 들어, 콘텐츠를 통해 FACS DNA 분석 측정 하 여) 설립된 방법으로 세포 주기 분석을 수행 하 여 파일럿 실험에서 그 속도 결정 하는 중요 한. 또한, Mps1 억제제의 최적의 작업 농도 세포 사이 달라질 수 있습니다. 이전 실험 RPE1 셀을 사용 하 여 reversine를 사용 하 여 500 nM10,,1112의 작업 집중에 성공 했습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최적의 농도 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>하루에 4, reversine 처리 (후 세포 유사 분열에 약 6 h) 후 12 h, reversine 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS 가진 세포를 씻어. 접시에 8 mL 일반 성장 매체를 추가 하 고 인큐베이터에 셀을 반환 합니다.</li>
</ol>3. Aneuploid 자전거 셀 및 ArCK 인구의 농축 제거
<ol><li>하루 6, 셀 입력 첫 번째 유사 분열 후 약 72 h에 (2.2; 단계 약 66 h reversine 워시 아웃 후, 해당 약 하는 이것이 2-3 세포 주기), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 300 nM nocodazole를 포함 하는 매체를 바꿉니다. 참고: 최근 작품 aneuploid karyotypes를 은닉 하는 RPE-1 셀 genomically 불안정 하 고 그들의 확산에 대 한 체포를 보이고 있다 2-3 세포 주기 후 첫 번째 잘못 된 유사 분열10. 그러나,이 활동은 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 aneuploid 순환 세포의 제거를 위한 적절 한 타이밍을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 중요 한입니다.</li>
	<li>하루 7, nocodazole 처리 후 12 h 매체를 발음 하 고 플레이트 1 x PBS의 3 개 mL를 추가 합니다. 접시의 측면을 눌러 mitotic 세포를 흔들어. Mitotic 세포도 제거를 허용 하도록 각 탭 사이의 접시를 회전 합니다.</li>
	<li>Mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해, 여러 라운드 (3-5 회 권장), 발음 및 각 라운드 사이 1 x PBS의 3 mL를 추가 쉐이크-오프 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>쉐이크-오프, 부드럽게 액체는 뚜껑이 나 접시의 가장자리에 고착 하는 발음. 간단히, 10 배 확대에 현미경 플레이트를 확인 하십시오. 몇 mitotic 세포 관찰 된다 확인 합니다. 5 개 이상의 mitotic 세포 10 X 목표 아래 볼 수 있습니다, 쉐이크-오프의 또 다른 라운드를 반복 합니다. 참고: Mitotic 세포는 둥근 나타나고 쉐이크-오프 후 부분적으로 분리 될 수 있습니다. 그것은 nocodazole 치료의 다음 라운드에 세포를 노출 하기 전에 mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 중요 합니다. 이렇게 하지 않으면 mitotic 세포 죽음으로 이어질 및 tetraploid 세포의 생성 될 수 있습니다.</li>
	<li>마지막 악수-오프 후, 셀 1 x PBS의 5 mL로 한 번 씻는 다. 8 mL 매체 330 nM nocodazole를 포함 하는 접시에 추가 하 고 12 h에 품 어.</li>
	<li>아니 mitotic 세포 배양 후 관찰 하는 때까지 모든 12 h nocodazole 치료/동요-오프 (3.1-3.5 단계) 반복 합니다. 일반적으로, 치료/동요-오프의 4-5 라운드는 것이 좋습니다. 참고: 여기에 제공 된 정보는 RPE-1 셀에 참조 하십시오. 치료/동요-오프 라운드의 수는 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. Nocodazole 연장 하 고 불필요 한 노출을 피하기 위해 신중 하 게 결정, 파일럿 실험에서 aneuploid 자전거 셀의 효율적이 고 완전 한 제거에 필요한 라운드 수에 결정적 이다.</li>
	<li>4-5 라운드 후의 nocodazole 치료/쉐이크-(3.1-3.6 단계), 일반 성장 매체의 10 mL을 추가 하 고 품 어. 세포 조작 또는 분석 결과 장차 전에 12-24 h 동안 휴식을 하실 수 있습니다. 참고: 마지막 악수-오프 후, 접시에 남은 세포 세포 주기 검거 그리고, 같이 최근10, 항구의 복잡 한 karyotypes. 이 세포를 ArCK (복잡 한 Karyotype와 체포) 세포 라고 합니다. 그것은 격리 1 주일 이내 ArCK 인구에 분석 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>필요에 따라 복잡 한 karyotypes 체포 셀의 비율을 평가 하기 위해 수집 하 고 각 쉐이크-오프 표준 셀 카운터를 사용 하 여에서 셀 키를 누릅니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> 그림 1: 생성 하 고 복잡 한 karyotype (ArCK)와 대표 이미지 aneuploid 세포를 분리 하는 데 사용 하는 방법의 전체 회로도. (A) 회로도의 ArCK 세포 생성 및 격리 프로토콜. (B) RPE 1 hTERT 세포 치료의 각 단계에서의 대표 이미지. 마지막 패널 (빨간색으로 설명 된) 격리 ArCK 셀을 나타냅니다. 눈금 막대 100 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
4입니다. ArCK 인구의 특성
<ol><li>다음 분석을 수행 하 여 ArCK 인구의 성공적인 분리를 확인 합니다.<ol>
<li>엉덩이 베타-galactosidase 얼룩 (노화의 마커)를 상업적으로 사용할 수를 사용 하 여 키트 (재료의 표 참조).</li>
		<li>상용 장비 (재료의 표 참조)를 채용 하 여 CCL2, 같은 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 측정 합니다.</li>
		<li>세포 주기 억제제 p53, p21, 서쪽 오 점, p16의 증가 수준을 확인 합니다. 참고: 이러한 분석을 제대로 제어 하려면 ArCK 인구는 euploid와 aneuploid 자전거 셀에 비교할 수 한다. 전자는 낮은 통로, 야생-타입 RPE 1 hTERT 기 하 급수적으로 성장 하는 세포. 후자의 RPE 1 hTERT에 염색체 미 분리를 유도 하 고 수확 하는 첫 번째 탈 선 유사 분열 후 세포 72 h에 의해 얻어질 수 있다. 이렇게 하려면 단계 1.1 수확 셀 및 첫 번째 nocodazole 치료 (3.1 단계) 앞에서 설명한 프로토콜을 따릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>체포 셀의 karyotype를 평가 하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 수행 합니다. 참고: 단일 셀 연속13단일 셀 수준 셀 인구에서 염색체 및 하위 염색체 변화를 확인 하려면 잘 설립 방법 이다. 단일 셀 시퀀싱을 수행 하는 방법에 대 한 자세한 절차 다른10을찾을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

생성 하 고 복잡 한 karyotypes (ArCK) 체포 된 셀에 대 한 풍부이 소설 메서드는 여러 염색체 이익 또는 손실이 있고 분할 중단 셀의 연구에 대 한 수 있습니다. 방법은 설치는 신속 하 고 안정적인 방식으로 ArCK 셀의 분리를 촉진 하기 위하여 설계 되었습니다.
이 분석 결과에서 가장 중요 한 단계는 약물 치료의 타임 라인 및, 가장 중요 한 것은, aneuploid 자전거 세포의 제거를 엄격 하 게 통제 하 고. 최적의 결과 얻으려면 nocodazole 치료와 쉐이크-오프 타이밍은 특정 중요 그들은 여전히 둥근 mitotic, g 1에 mitotic 세포 죽음 또는 지연의 가능성을 방지 하는 동안 자전거 셀 접시에서 제거 되도록 잠재적으로 만드는 tetraploid 인구. 동요-오프 타이밍 권장된 12 h nocodazole 외피에서 2 시간 이상 일탈 하지는 것이 좋습니다.
세포는 어떻게 복잡 한 karyotypes의 깊은 이해를 촉진 가능성이 ArCK 미래 연구 세포 생리학을 영향을 줍니다. 특히, 최근 연구는 면역 체계의 세포와 상호 작용 수 있습니다 및 ArCK의 트리거 면역 클리어런스 셀10설명 했다. 여기 설명 하는 방법을 기본 현상은 세포와 어떻게 종양 변화의 연구에서 면역 클리어런스 분자 메커니즘의 정화를 포함 하 여 ArCK 셀의 추가 특성에 대 한 훌륭한 출발점을 제공 이 감시 메커니즘, 필드14,15에서 중요 한 질문을 무시할 수 있습니다.

이수성, 단일 보완1,2,,34의 배수가 염색체 수에 의해 특징 조건이 염색체 분리 과정에서 오류가 발생할. 이 게놈 불안정성5,를 추가 생성 하는 트리거 복제 스트레스 karyotypes6,7,8,,910증가 karyotype 복잡도 및 궁극적으로 리드 셀10의 부분 모집단의 세포 주기 검거를. 여기에 제시 된 방법의 목적은 생성 및 세포 사이클 같은 부분 모집단을 별도 것입니다. 저렴 한 조직 배양 기법을 채용 하 여이 프로토콜 격리 및 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀 세포 주기 검거의 특성화를 촉진 한다. 이러한 셀 ArCK (복잡 한 Karyotype와 체포) 세포와 컨트롤로 euploid 자전거 들을 이라고 합니다.
이 프로토콜은이 목적을 위해 설립 하는 첫 번째를 격리 허용 하 고 포함, 그들의 유도 노화 및 노화 관련 분 비 형 (SASP), 하 되이 국한 되지 않고 그들의 프로-염증 성 ArCK 라인의 진학 기능과 면역 세포와 함께 참여 하는 능력. 여기에 제시 된 방법 보내지고, 불멸 하 게 인간의 세포에서 개발 되었습니다 하지만 암 라인에서 아직 테스트 되지 않았습니다. 일부 변환 된 셀 하나 또는 여러 개의 경로;의 억제로 인해 세포 주기 검거에 민감한 있을 수 있습니다. 따라서, 추가 유효성 검사 다른 셀 라인에서 수행 되어야 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="953">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:319px;">11995-073</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reversine</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10004412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p53 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p21 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-6246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p16 antibody</td>
			<td style="width:311px;">BD</td>
			<td style="width:319px;">554079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td style="width:311px;">Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td style="width:319px;">9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&#160;</td>
			<td style="width:311px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:319px;">ARY005B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

염색체 미 분리 이수성, 조건이 있는 셀 항구 불균형 염색체 수를 이끌어 낸다. 여러 줄의 증거는 강하게 그 이수성 게놈 불안정성, 궁극적으로 그들의 확산을 체포 하는 복잡 한 karyotypes와 세포 생성을 유발 나타냅니다. 격리 및 복잡 한 karyotypes를 은닉 하는 세포의 세포 생리학에 불균형 염색체 수의 영향을 연구 하는 중요 한 있습니다. 날짜 하려면, 아무 방법 같은 aneuploid 셀을 안정적으로 설립 되었습니다. 이 문서 표준, 저렴 한 조직 배양 기법을 활용 하 여 복잡 한 karyotypes 농축 및 aneuploid 세포의 분석을 위한 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜 등 그들의 유도 노화 관련 분 비 형, 프로-염증 성 속성, 능력을 면역 세포와 상호 작용 하는 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀의 여러 가지 기능을 분석을 사용할 수 있습니다. 때문에 암 세포는 종종 불균형 염색체 수에 항구, 이수성 두는 pro 및 안티 tumorigenic 효과 잠복의 궁극적인 목표와 정상 세포에서 세포 생리학에 미치는 해독 결정적 이다.

이 메서드는 생체 외에서 조직 문화 시스템 그들의 확산을 체포 하는 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 사용 합니다. 이 인구 (복잡 한 Karyotypes와 체포) ArCK 셀 이라고 합니다. 그림 1A 는 실험의 계획을 보여 줍니다. 야생-타입 자전거 RPE 1 hTERT 셀 티 미 딘 G1/S 국경에 동기화 되며 염색체 미 분리를 유도 하는 Mps1 억제제로 치료. 스핀 들 독 nocodazole 염색체 미 분리의 유도 후 72 h에 있는 셀에 추가 됩니다. nocodazole 치료, 증식 수 aneuploid 셀 후 12 h 유사 분열을 입력 하 고이 세포 주기 단계 microtubule 합 방해 때문에 갇혀 있다. 갇혀 이러한 셀은 다음 부드러운 쉐이크-오프에 의해 쉽게 제거. 동요-오프 과정이 반복된 3-5 회 순환 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해입니다. 그림 1B 는 처리의 각 단계에서 RPE-1 셀의 대표 이미지를 보여 줍니다.
ArCK 셀 세포 주기 억제제, p53, p21, p16 그림 2A와 같이 euploid와이 셀, 자전거에 비해 등의 증가 수준을 표시 합니다. 또한, 그림 2B 긍정적인 β-galactosidase ArCK euploid 제어 세포에 비해 세포에서 세포 노화에 대 한 확고 마커 얼룩을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> 그림 2: ArCK 셀을 활용 하는 대표적인 결과. ((A)) 서쪽 오 점 euploid,이 순환, 및 ArCK 세포에서 세포 주기 억제제 수준 평가. P53, p21, p16의 레벨은 서쪽 오 점 분석에 의해 결정 되었다. 말라 로드 제어로 제공. (B) β-galactosidase ArCK 세포에서 노화의 수준 평가 얼룩. 노화 관련 된 β-galactosidase (β-Gal) 활동 euploid 셀과 ArCK 셀에서 결정 되었다. 눈금 막대 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 세포 주기 검거 대표 karyotype 분석 단일 셀 임의의 염색체 이득과 손실을 그림 3ArCK 셀 표시 여러, 시퀀싱에서 같이 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀의 눈에 띄는 기능입니다. 이 발견 이전 보고서10완전 한 합의에 있다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> 그림 3: ArCK 셀의 대표 단일 셀 시퀀싱. 세그먼트화 6 대표 ArCK 셀의 karyotype를 보여주는 플롯 합니다. 세그먼트화 플롯 (야생 유형 RPE-1은 여성 근원의 2 중 셀 라인) 로그2 규모로 euploid 참조를 기준으로 x 1에서 모든 염색체의 복사본 수를 표시 합니다. 염색체 이득 녹색에서 빨간색, 염색체 손실에 강조 표시 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

이수성 게놈 불안정성, 결국 복잡 한 karyotypes 셀 세포 주기 검거를 이끌어 낸다. 이 문서 분할 중단 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 간단 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.4K 조회수.  Massachusetts Institute of Technology. 이수성 게놈 불안정성, 결국 복잡 한 karyotypes 셀 세포 주기 검거를 이끌어 낸다. 이 문서 분할 중단 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 간단 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

비디오: Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a common mechanism of disease progression and a prognostic-determinant feature of malignant tumors. In prostate cancer (PC), resistance to MTAs such as the taxane Docetaxel dictates treatment failure as well as progression towards lethal stages of disease that are defined by a poor prognosis and high mortality rates. Though studied for decades, the array of mechanisms contributing to acquired resistance are not completely understood, and thus pose a significant limitation to the development of new therapeutic strategies that could benefit patients in these advanced stages of disease. In this protocol, we describe the generation of Docetaxel-resistant prostate cancer cell lines that mimic lethal features of late-stage prostate cancer, and therefore can be used to study the mechanisms by which acquired chemoresistance arises. Despite potential limitations intrinsic to a cell based model, such as the loss of resistance properties over time, the Docetaxel-resistant cell lines produced by this method have been successfully used in recent studies and offer&#160;the opportunity to advance our molecular understanding of acquired chemoresistance in lethal prostate cancer.

Resistance to cancer therapies contributes to disease progression and death. Determining the mechanistic underpinnings of resistance is crucial for improving therapeutic response. This manuscript details the protocol to generate taxane-resistant cell models of prostate cancer (PC) to help dissecting the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in PC patients.

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

연구

암 연구학

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor environment and cell-cell interactions. Identification of cancer and stem cell interactions, including changes in extracellular environment, physical interactions, and secreted factors, might enable the discovery of new therapy options. We combine known co-culture techniques to create a model system for mesenchymal stem cells (MSCs) and cancer cell interactions. In the current study, dental pulp stem cells (DPSCs) and PC-3 prostate cancer cell interactions were examined by direct and indirect co-culture techniques. Condition medium (CM) obtained from DPSCs and 0.4 &#181;m pore sized trans-well membranes were used to study paracrine activity. Co-culture of different cell types together was performed to study direct cell-cell interaction. The results revealed that CM increased cell proliferation and decreased apoptosis in prostate cancer cell cultures. Both CM and trans-well system increased cell migration capacity of PC-3 cells. Cells stained with different membrane dyes were seeded into the same culture vessels, and DPSCs participated in a self-organized structure with PC-3 cells under this direct co-culture condition. Overall, the results indicated that co-culture techniques could be useful for cancer and MSC interactions as a model system.

We provide protocols for evaluation of mesenchymal stem cells isolated from dental pulp and prostate cancer cell interactions based on direct and indirect co-culture methods. Condition medium and trans-well membranes are suitable to analyze indirect paracrine activity. Seeding differentially stained cells together is an appropriate model for direct cell-cell interaction.

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced killer (CIK) T cell therapy has been reported to exert significant cytotoxic effects against cancer cells and to reduce the adverse effects of surgery, radiation, and chemotherapy in cancer treatments. CIK can be derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), bone marrow, and umbilical cord blood. CIK cells are a heterogeneous subpopulation of T cells with CD3+CD56+ and natural killer (NK) phenotypic characteristics that include major histocompatibility complex (MHC)-unrestricted antitumor activity. This study describes a qualified, clinically applicable, flow cytometry-based method for the quantification of the cytolytic capability of PBMC-derived CIK cells against hematological and solid cancer cells. In the cytolytic assay, CIK cells are co-incubated at different ratios with prestained target tumor cells. After the incubation period, the number of target cells are determined by a nucleic acid-binding stain to detect dead cells. This method is applicable to both research and diagnostic applications. CIK cells possess potent cytotoxicity that could be explored as an alternative strategy for cancer treatment upon its preclinical evaluation by a cytometer setup and tracking (CS &#38; T)-based flow cytometry system.

Here, we present a protocol to perform the isolation and expansion of peripheral blood mononuclear cells-derived cytokine-induced CD3+CD56+ killer cells and illustrate their cytotoxicity effect against hematological and solid cancer cells by using an in vitro diagnosis flow cytometry system.

암 치료를 위한 사이토카인 유발 킬러 T 세포의 격리 및 확장

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and composition. It is based on a microsurgical procedure designed to catheterize the trachea and aorta of a euthanized mouse to perfuse the heart and lungs with decellularizing agents. The decellularized cardiopulmonary complex can subsequently be immunostained to reveal the location of structural ECM proteins. The whole procedure can be completed in 4 days.
The ECM scaffolds resulting from this protocol are free of dimensional distortions. The absence of cells enables structural examination of ECM structures down to submicron resolution in 3D. This protocol can be applied to healthy and diseased tissue from mice as young as 4-weeks old, including mouse models of fibrosis and cancer, opening the way to determine ECM remodeling associated with cardiopulmonary disease.

This protocol aims to decellularize the heart and lungs of mice. The resulting extracellular matrix (ECM) scaffolds can be immunostained and imaged to map the location and topology of their components.

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...