일반 기금 기금, 국가 -이 작품은, 국립 다발성 경화증 SocietyRG 4587-A-1 Civitan 국제 학술 진흥 재단, 마이크 L. Jezdimir 횡단 성 척수염 재단, 알라바마 보건 서비스 재단의 대학 NINDS P30-NS069324에 의해 투자되었다 국립 알레르기 연구소 감염증, 건강의 국립 연구소에서 과학 재단 1,355,183 및 T32 AI007051.

<ol>
	<li>Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+a+synthetic+polypeptide.">Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide.</a> Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).</li><li>Yednock, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+antibodies+against+alpha+4+beta+1+integrin.">Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin.</a> Nature. 356, 63-66 (1992).</li><li>Ridge, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+depletion+with+rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis.">B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).</li><li>Bar-Or, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis:+a+72-week,+open-label,+phase+I+trial.">Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial.</a> Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).</li><li>Kappos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis:+a+phase+2,+randomised,+placebo-controlled,+multicentre+trial.">Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial.</a> Lancet. 378, 1779-1787 (2011).</li><li>Berer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+microbiota+and+myelin+autoantigen+cooperate+to+trigger+autoimmune+demyelination.">Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination.</a> Nature. 479, 538-541 (2011).</li><li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system:+host-virus+stand-off.">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li><li>Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+for+virus-specific+CD4+T+cells+in+mice+with+coronavirus-induced+acute+encephalitis.">Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis.</a> The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

MS 환자는 CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠 약물 복용 직접 CNS 보호 치료법의 개발을 정당화하는 동안 질병의 재발을 경험하는 것을 계속한다. EAE는 고전 MS의 현상을 모델링하기 위해 사용되었고, 생체 내에서의 면역 시스템 및 CNS의 상호 작용의 특성을 연구 할 때 강력한 도구가 될 수있다. 주변부에서 면역 세포 상기 CNS의 침투 및 확산 및 활성화를 검사와 함께 전 또는 질병의 개시 후 치료 EAE의 고려, 예를 들어, 타이밍을 사용하여, 면역 체계 모두에서 치료 효과를 서술 할 수있다 중추 신경계. C57BL / 6 마​​우스에 EAE이 널리 이용되고 있지만 이러한 마우스는 실질의 재발 송금 표현형 및 면역 세포의 침윤이 같이 SJL 마우스에 EAE는 MS의 대부분의 경우 더 많은 대표 될 수있다뇌 10. SJL 마우스는 질병이 제시 한 후에는 가능한 치료를 시작하고 있지만 감소 염증의 시간 동안,뿐만 아니라 사함을하는 동안 분명 복구가 있습니다. SJL 마우스는 항상 재발 및 결과를 풀링 할 때 잠재적으로 큰 변화의 결과로, 동시성에 송금하지 않도록 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 일부 연구자들은 질병의 진행에 개별 지점에서 FACS 분석 및 조직학을 위해 마우스를 복용하는 동안 한 동물에서 임상 점수에 대한 대표적인 결과를 표시하도록 선택할 수 있습니다. 조작이 치료는 면역 시스템 또는 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 결정에 도움을 줄 수 EAE 마우스에 대한 때 고려. 처리가 시작되면 많은 옵션 자체의 면역 세포가 CNS에 진입했는지에 대한 내포 방법 각각은은 CNS와 상호 작용 될 수있다. 증상의 발병하기 전에 치료는 면역 세포가 아직 입력 또는 중추 신경계에 손상을 발생하지 않은 것을 의미한다.증상의 발병 후 치료는 면역 세포가 중추 신경계를 입력 한 일부 손상의 원인이 있다는 것을 의미한다. SJL 마우스를 사용, 치료는 면역 세포가 활발하게 침투 및 염증을 유발하거나 면역 세포가 적은 염증으로 CNS에 널리 보급 될 수 사함, 동안되는 재발 동안 시작할 수 있습니다. 면역 세포 치료시 병적 과정에서 어디 고려할 때 치료법은 CNS 및 면역계에 미치는 영향에 관한 초기 가정이 이루어질 수있다. 치료는 면역 세포 및 CNS, EAE 증상의 중증도를 감소시키는 최종 결과 각각 영향을 미칠 수있는 여러 가지 방법이있다. 그러므로, 면역 세포가 CNS 입력 여부 외주와 CNS에 영향을 받는지 면역 세포 보는 유세포 분석 및 면역 조직 화학 법을 사용하는 것이 필요하며, 중추 신경계 치료에 반응하는 방법. 척수의 유세포 분석은 얼마나 많은 셀 HA를 결정할 수 있지만주어진 시간에 CNS를 입력했습니다, 하나는 면역 세포의 증식이 비장에 영향을받지 않는 한이 효과가 감소 된 면역 세포 인신 매매에 의한 것을 확인할 수 없습니다. 이는 말초 및 CNS 조직을 분석하여 양쪽 조직을 비교할 때 기계적으로 의미하는 결과를 결정하는 것이 필요하다. 면역 세포 활성 프로파일이 조절 T 세포 무거운 프로필 병원성 헬퍼 T 세포 무거운 프로필 스위치를 갖는, 예를 들면, 처리에 의해 변경되는 것이 또한 가능하다. 다른 세포 유형의 마커를 찾고 치료 및 치료 동물 사이 %의 발현을 비교하는 따라서도 중요한 고려 사항이다. MS 연구 신흥 개념은 B 세포가자가 면역 탈수 초에서 중요한 역할을한다는 것을 암시한다. 이것은 B 세포는 T 세포 (20)의 활성화에 필요한 것을 보여주는 연구에 기초한다. 이 개념은 예 리툭시 맵, CD20의 예에 대한 항체와 같은 치료의 성공에 의해지지된다B 세포 (21, 22)의 표면에 가압. 임상 시험에 모노클로 날 항체 ocrelizumab의 성공에 의해 입증 된 바와 같이, CD20의 다른 에피토프를 표적 약물은 B 세포 치료제 타겟 (23)의 효과를 향상시킬 수있다. 여기에 제시된 기술의 한 가지 제한은 면역 세포가 CNS를 입력하지만 실질 여행 할 수 없게하는 것이 가능하다는 것이다. 면역 취급과 미처리 동물 사이에서 실질 이동 거리를 면역 세포의 혈관 주위있는 절삭을 검출하고 평가하기 위해 사용될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 EAE 병인의 마이크로 바이의 효과를 포함한다. 공생 장내 미생물은 크게 질병 발병 (24)에 영향을 미칠 수있다; 따라서, 마우스는 다른 식민지에 보관, 심지어 다른 우리에서 질환의 중증도에 광대 한 차이가있을 수 있습니다. 동일한 케이스에서 발생 한배 새끼 컨트롤을 사용 가능한 따라서, 항상 바람직EAE를 포함하는 실험. 마지막 주는 주변의 면역 세포 증식의 변화의 영향을 제거하기 위해 실험적으로 바람직한 경우, 패시브 전사 유도하기보다는,이 프로토콜에 기재된 활성 유도를 이용하여이를 수행 할 수있을 수 있다는 것이다. 신경에 대한 확인은 또한 세포 사멸 또는 선택적 세포 유형에 단백질의 결실을 허용 조건부 녹아웃 마우스의 사용을 통해 특정 메커니즘을 테스트하기 위해 공존 배양 시스템 (11)을 사용하여 달성 될 수있다. 또한, 신경 있습니다 약리 에이전트의 탐사를 확장, 축삭 절개 및 신경 세포의 죽음의 표식이 포함되어야한다. 중요성의 또 다른 영역은 재유 수화입니다. 부상 축삭은 신경 치료가 재유 수화 치료의 중요한 부분이되어야 추가 지원 대출 remyelinate 할 수 없습니다. 또한, 수초 축삭은 myelina보다 부상에 더 취약테드의 축삭. 이것은 축삭이 축삭 손상을 방지 할 적절한 재유 수화를 촉진 탈수 초 치료 적 개입이되면 제안합니다. 이 도로를 탐색하려면, 탈수 초화 및 재유 수화 다른 생체 내 모델 (즉, cuprizone 및 리소 레시틴)을 사용할 수있다. 이 방법은 본원에서 미엘린 손실을 정량함으로써 신경 평가에 초점을 설명한다. 재유 수화 평가 선조 세포의 수뿐만 아니라, 증식과 같은 조사하는 것이 중요 할 것이다 성숙 그들의 능력. 이러한 대안 모델의 언급으로, 사람은 급속도로 매개되는 뇌염의 다른 모델을 고려해야합니다. 미엘린 손실을 생성 두 잘 특성화 RNA 바이러스 모델이있다 : 하나는 Theiler의 쥐 뇌척수염 비 포위 Picornaviridae 바이러스이고, 다른 하나는 마우스 간염 바이러스의 Coronaviridae 바이러스 군 (25, 26)의 일원이다. EAE는 일을위한 유용한 도구입니다조작 또는 치료가 면역 체계와 생체 내에서 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 udies. 치료는 질병 과정에 영향을 미치는 곳은 혈액 - 뇌 장벽에서 또는 CNS에서 주위에 있는지 여부를 결정하는 데 도움 여기에 설명 된 프로토콜. MS에 대한 현재의 치료는 질환 및 환자의 시간에 종종 경험 하락을 치료하지 않습니다. 마찬가지로, 급성 파종 성 뇌척수염, 횡단 성 척수염 및 시신경 척수염,이 면역 세포에 침투하여 공격 바로 아래로 CNS를 보호 부족​​ 치료를 포함하는 면역 세포의 중추 신경계에 침투와 수초의 분해를 포함하는 다른 질병. 고려 처리의 타이밍을 촬영 및 치료에 대하여 이루어져야 기계적 결정을 허용한다 염증 손상을 평가하기 위해 CNS의 면역과 관련하여 유세포 분석 비장 및 척수를 사용.

다발성 경화증 (MS)는 주로 초기에 질병에있는 뇌의 백질 지역에서 염증성 병변을 특징으로한다. 장기간의 진행 후, 회백질 위축은 MRI 영상 검출 및 신경 퇴행성 질환의 위상을 표시한다. 반응성 신경교 증, 탈수 초화 및 백질의 축삭 손상은 CNS-침투 면역 세포에 기인한다. 현재 CNS의 신경 퇴행을 예방 직접 역방향 또는 MS에서 사용되는 치료 없음 - 대신, CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠하여 염증을 감소하지 않는다. 이 MS에 대한 치료는없고 현재 치료를 사용하여 환자가 질병의 진행을 계속 발생하기 때문에, 탈수 초화 및 신경 세포 손실을 방지 약물의 발견은 매우 중요하다. 즉, CNS에 감소 손상이 - -의 S 보이는 그러나, 면역 세포에 작용 및 CNS에 그 구별하는 결과로, 실험적으로 어려울 수 있습니다에 관계없이 발생되는 메커니즘의 AME. 따라서, CNS 보호의 평가는 질병 메커니즘에 미치는 영향 약리 에이전트를 결정하기 위해 주변에 면역 세포와 면역 세포의 증식을 CNS는-침투의 평가와 협력해야합니다. 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 현재 MS 1-4 치료 용 약물의 발견에 대한 직접 책임 염증성자가 면역 질환의 잘 확립 된 동물 모델이다. 마우스는 종종 C57BL / 6 마​​우스는 유전자 변이체의 가용성에 따라 인기 균주 인 상태 EAE 사용된다. EAE로 유도 C57BL / 6 마​​우스는 10 일 후 유도 주위에 발병 만성 질병의 진행을 나타낸다. 척수 실질 및 소뇌 피질 침투 실질 5 침윤의 유무,이 동물의 조직 병리학 적 특성이다. ㄴ에서 또한 대뇌 피질의 병변 및 탈수 초화비는 C57BL / 6 마우스에서 상대적으로 결석 질환 6-9의 특징이다. 재발 완화 성 질환 및 MS (10)에서 나타나는 것과 유사한 뇌와 척수 모두에서 발견되는 병소가 SJL 마우스를 사용할 때 가능 따라서 바람직하다. 면역 세포는 CNS에 도달하지 않을 경우, 치료는 신경 세포로 분류 될 수 없다. 따라서,이 프로토콜은 이전에 11 있듯이 뇌, 척수 및 EAE 마우스에서 비장의 유세포 분석의 사용은, 면역 세포 상기 CNS에 침입하여 주변의 면역 세포의 증식에 대한 치료 효과를 확인 할 수있다. 범위와 신경의 성격을 결정하는 CNS 조직의 면역 조직 화학적 분석도 설명한다. 이들 방법을 조합하면 CNS 였는지 PR 면역 세포가 활성화 된 면역 세포가 CNS 입력 여부를 주변에 확산되었는지 여부의 판정이 가능하고,염증이나 손상 otected. 신경 보호 효과가 면역 체계에 영향에도 불구하고 의심되는 경우, 실험자는 CNS가 발생한으로 치료가 면역 세포의 침윤 후 시작 시간을 변경할 수 있습니다. 여기서는 활성 EAE, MS의 T 세포 매개 된 동물 모델의 서로 다른 모델들을 사용하는 프로토콜을 제공하고, 다른 측면에 실험 요법의 효능을 결정하는 질병 중 다양한 시간 점에서 면역 조직 화학 결합 분석 유동 세포 계측법 MS의 발병 기전. 이 방법은 면역 세포 증식 및 CNS 보호 대 침투에 영향을 구별 약물이 질병의 발병 기전에 작용하는 방법을 쉽게 좁힐 만드는 연구를 도움이 될 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>22 x 22 x 20 mm embedding mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9719245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 30 x 20 mm embedding mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9531194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 22 x 20 mm embedding mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552775</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Foxp3-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-5773-82</td>
			<td>0.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFAP (Cocktail)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>835301</td>
			<td>1-3 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>0.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFN-&#947; APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-7177-82</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ki-67 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5698-82</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MBP (D-18)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-13912</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR&#946; FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-5961-85</td>
			<td>0.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR&#946; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5961-83</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000&#160;</td>
			<td>1.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid, Anhydrous, 99.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC42356-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC446085000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>&#8203;Foxp3 transcription factor staining reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgi Plug</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555029</td>
			<td>protein transport inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immedge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9545623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>407952-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near IR Live/Dead Staining Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10119</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 96%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC416785000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td>resinous mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>808401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9206402</td>
			<td>avidin-biotin-peroxidase&#160;complex (ABC) in immunoperoxidase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9276270</td>
			<td>DAB solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining immune system suppression versus cns protection for pharmacological interventions in autoimmune demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

여기, 우리는 약리 에이전트에 의해 CNS 보호를 제공하는 경우 이해 EAE의 두 가지 모델을 사용하거나 CNS-침투 T 세포를 약화 또는 염증 면역 세포의 침윤의 공격 동안 수초와 축삭 손상을 방지 할 수있다. 면역 세포의 침윤과 질병의 병리는 주로 척수 (그림 1A)에서의 위치 치료제가 척수에 면역 세포 침투를 방지 있는지 확인하려면, 만성 EAE의 C57BL / 6 마우스 모델을 사용한다. 치료 약물이 CNS, 뇌와 척수 (그림 1B) 모두에서 질병의 병리를 보여줍니다 사용되는 재발 - 완화 성 EAE의 SJL 동물 모델에 면역 세포의 침입 동안 CNS 보호 기능을 제공하는지 확인합니다. 임상 평가 관련 임상 평가는 일반적인 내용은 다음 루 브릭 (그림 1 항에 만들어진C) 또는 비정형 (그림 1D) EAE. 전형적인 임상 질환의 경우, 0의 점수는 더 이상 동작하지 않습니다. 꼬리의 기지에 의해 선택하면, 꼬리는 (많이 로터 등) 빠르게 회전 할 수 있으며, 뒷다리는 벌리됩니다. 하나의 임상 점수는 꼬리의 기부에서 마우스를 해제함으로써 결정될 수있다 부분적 림프 테일이다. 정상 헬리콥터와 같은 회전 약화 또는 부재, 및 꼬리의 부분을 완전히 림프 일 수있다. 꼬리 마비의 정도를 결정하기위한 유용한 방법은 부분적으로 마비 꼬리 그렇게 할 수없는 것 중에 unparalyzed 꼬리는 일반적으로 손가락의 주위에 말려있는 바와 같이, 꼬리의 길이를 하나의 손가락을 실행하는 것이다. (2)의 임상 점수는 완전히 마비 꼬리를 나타냅니다. 꼬리의 기지에서 마우스를 위로 따기 때 꼬리의 어떤 움직임이 전혀 발생하지 않는다. (3)의 임상 점수는 부분 뒷다리 마비를 나타냅니다. 이 점수의 결정은 마​​우스가 FLA에 자유롭게 이동할 수 있어야합니다t면. 하나 뒷다리 드래그하면 마우스가 전진으로, 또는 하나 또는 두 개의 뒷다리 일부가 마비 된 것으로 나타나면 (3)의 점을들 수있다. (4)의 임상 점수는 완전한 뒷다리 마비를 나타냅니다. 이 점수로, 마우스는 뒷다리를 이동 할 수 없습니다 및 전면 사지를 사용하여 자신을 앞으로 끌어 것입니다. (5)의 임상 점수는 죽어가는 마우스를, 또는 어려움 마우스는 케이지이나 호흡을 통해 자신을 이동. 마우스가 케이지의 하단 또는 호흡이 곤란하면 자체를 드래그 할 수없는 경우, 마우스는 인도적 안락사되어야한다. (6)의 임상 점수는 새장에서 죽은 마우스를 나타냅니다. 6의 점수는 특이하고 EAE 이외의 사망 원인을 조사해야한다. 비정형 임상 질환 수도 있고 마비를 동반 할 수 없습니다. 마우스는 전형적인 질병 플러스 전형적인 증상을 제시하는 경우는 두 개의 분리 된 채점 시스템을 포함 할 필요가있다. 0의 점수는 더 이상 행동하는 없다전형적인 채점 시스템들. 마우스는 산책하는 동안 하나의 임상 점수는 약간의 머리 회전 또는 기울기를 나타냅니다. 이것은 마우스가 앞으로 걸어 있도록 그 움직임에 일정한 좌우 방향성을 관찰함으로써 결정될 수있다. (2)의 임상 점수는 더 두드러 머리 회전과 가난한 복원력 능력을 나타냅니다. (1)의 전형적인 점수와 마찬가지로, 마우스의 움직임에 방향성을 가지고 있으며, 균형 약간의 어려움이있을 수 있습니다. (3)의 임상 점수는 직선으로 걷는 무능력을 나타냅니다. 마우스 어려움 균형을 가질 것이다하고 산책으로 오른쪽 자체 있도록 카의 측면을 사용할 수있다. (4)의 임상 점수로 인해 균형 문제로 걸을 수없는 옆에 누워 마우스를 나타냅니다. 마우스는 케이지의 하단에 자신을 드래그 할 수 있습니다 만, 그 움직임에 방향성을 가질 수있다. 지원하지 않는 5의 임상 점수는 연속 압연을 나타냅니다. 이 점수에 도달 마우스는 인도적 안락사되어야한다. 병원6의 알 점수는 새장에서 죽은 마우스를 나타냅니다. 6의 점수는 특이하고 EAE 이외의 사망 원인을 조사해야한다. 이 마우스의 상태 변화 약간 경우 또는 두 점수 사이에 선택하는 것이 어려운 경우 점수에 0.5을 추가, 예를 들어, 점수, &quot;사이 -&quot;를 허용 할 필요가있다. 예를 들어, 시작하는 마우스는 정상 대응보다 느리게 이동하지만 마비, 0.5의 점수를받을 수 있습니다 꼬리에 의해 획득시 그 다리를 플레잉하는 대신 앞과 뒷 발을​​ 걸쇠 마우스를 표시 없습니다 . 단지 케이지의 하단에 자신을 끌어 3.5의 점수를받을 수 있습니다 주기적으로 또는 때 감동의 뒷다리를 트 할 수 있습니다 마우스. 면역 세포의 침윤의 감소를 평가 C57BL / 6 마우스 모델에서의 EAE (도 1A, 0 일), 항원의 유도 후 presentati비장 T 세포의 증식에 발생할 일 1 - 약 3 ~ 5 일 임상 점수 본 초기 면역 세포 침윤 마우스 후 7 일 주위 CNS로 면역 세포 침윤 하였다 5. 치료제가 척수로 면역 세포 침투를 차단하고 있는지를 평가하기 위해, 약물 또는 비히클은 비장에서 항원 제시 및 증식 후 7 일째에 도입하지만, 면역 세포를 척수로 침투하기 전에된다. 면역 세포 침윤이 약화 된 경우 임상 적 질병 과정 일에서 질병의 상승 단계 10 ~ 15 (도 2) 동안의 개선 된 임상 점수를 반영해야한다. 면역 세포 침윤의 감소는 감소 된 신경 염증이 발생할 것이다. 반응성 astrocytosis 및 microgliosis는 신경 염증 주요 특징으로 간주됩니다. 이바-1 GFAP 및 미세 아교 세포와 성상 세포 염색을하는 것은 다음 장을 평가하는데 사용될 수있다평균 면적 분율 염색의 ES는 신경 염증 (그림 3)를 정량화한다. 면역 세포의 침윤이 감소되어 있는지 확인하기 위해 척수를 제거하고 질병의 피크 (그림 1A, 약 하루 18)에서 유동 세포 계측법 분석을 위해 처리됩니다. 이 면역 세포의 가장 큰 수는 척수을 체결했다고 보장합니다. 중추 신경계에 대한 T 세포의 입구 개시 염증성 이벤트 간주 모두와 Th17받은 Th1 세포가 EAE의 동물 모델뿐만 아니라 MS 환자에서 발견된다. 종합적 유세포 분석은 병원성 T 세포의 두 가지 유형의 평가를 포함한다. 또한, Tregs는 질병을 저해 잘 특성화 억제 T 세포이다. 따라서, 총 CD4 + 집단에서 Tregs의 비율은 이펙터 T 세포 개체군의 백분율과 비교하여 평가한다. 이 경우 THER T 세포 침윤의 전반적인 감소가 발생했는지 여부를 나타내거나 것E는 CNS에서 T 세포 표현형의 스큐이다. 대표 점 플롯 (도 4a) 비히클 - 처리 된 마우스 (오른쪽 사분면 번호)로부터 척수 비해 약물 처리 된 마우스에서 척수에서 T 세포 침윤 CD4 +의 전체 개수의 감소를 보여준다. 각각 IFN-γ +, IL-17 + 및 Foxp3의 +, 및 (그림 4A)을 감소해야합니다받은 Th1, Th17, 그리고 TREG 세포 다음 서명 단백질이 평가를 알아보고자 하였다. 통계 분석은 현저한 감소 (도 4b)를 보여주기 위해 CD4 +, IFN-γ +, IL-17 + 및 Foxp3의 + 세포 수에 수행되어야한다. (및 Foxp3의 + 세포가 수행된다 -, IL-17 + IFN-γ - T 세포 하위 집합의 기울이기, IFN-γ + IL-17 +, IFN-γ + IL-17의 비율의 통계적 평가를 배제하려면 인터넷gure 4C). T 세포 CNS가 침윤 감소가 주변부에서 증식,​​ 활성화 및 분화를 억제하는 결과이다 가능성을 제거하기 위해, 적극적으로 T 세포 아형의 비율에 부가하여 T 세포 증식의 개수가 평가 될 필요가있다. 활성화 및 분화는 영향을받지 (그림 5A) 경우 어떤 CD4 +, IFN-γ +의 비율의 변화, IL-17 +, 또는 Foxp3의 +를 찾을 수 없습니다해야합니다. 확산 (그림 5B) 영향을받지 않는 경우 또한, 사료된다 + CD4 + 세포의 변화를 찾을 수 없습니다해야합니다. 약물 치료법은 7 일째에 도입 된 이후 주변에 초기 항원 제시 및 T 세포 활성화를 피하기 위해 변경. 그러나, 유전 적 모델 단백질은 종종 배아 동안 구조적으로 삭제 또는 비장 ASSE을 EAE의 유도 전 유도높은 중요성 ssment. CNS 보호 평가 특정 치료제는 면역 세포의 침윤 후 CNS 질병의 병리를 변조하는 경우 설명하기 위해, 약물 개입은 임상 질병 득점의 첫 번째 피크 기간 동안 투여해야한다. 이 마우스는 재발 완화 성 표현형을 나타내는 때문에 EAE의 SJL 모델이 실험 유리하다. 약물 치료가 수초 - 축삭 변성을 방지하는 경우, 임상 점수 향상 (그림 6)를 관찰한다. 수초의 병리학 적 평가는 개선 된 임상 점수와 일치 수초 손상의 감소를 확증해야합니다. 정량적으로 수초의 무결성, 미엘린 염기성 단백질의 DAB 염색을 평가하기 위해 (MBP)이 염색의 광학 밀도의 통계 분석 (그림 7) 다음에 수행된다. 또한 그 신경 염증을 입증하기 위해 지속 또는 therape에 의해 감소utic 개입 반응성 신경교 증이 (도 3) 상술 한 바와 같이 반응성 신경교 증에 대한 평균 면적 비율을 측정함으로써 평가 될 수있다. 치료 개입이 직접 면역 효과없이 CNS를 보호하고 있음을 확증하기 위해, 비장에서 면역 세포의 중추 신경계에 침투와 확산의 감쇠 할인해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 뇌 면역 세포 침윤 및 말초 T 세포의 증식 및 활성화의 평가 척수 평가 방법은 상기 한 바와 같이 수행되어야한다 (도 4 및도 5). 이와 함께, T 세포 나 주변의 T 세포 증식은 CNS 함침 감소의 증거로 CNS 세포 손상을 차단하는 치료제 CNS 보호 치료법이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig1.jpg" /> 그림 1. 대표 ResuC57BL / 6, SJL 마우스에 EAE에서 임상 점수의 LTS. (A) 임상 점수는 만성 질환으로 EAE를 생산하는 MOG 35-55로 유도 (N = 10) / 6 마우스 C57BL의 (± SEM을 의미). (B) 임상 점수는 재발 완화 성 EAE 병을 생산하는 PLP 139-151로 유도 SJL 마우스 (N = 3)의 (평균 ± SEM). (C) EAE 생쥐 일반적인 질병의 진행을 추적하는데 사용되는 임상 점수 섹션. (D) EAE 마우스의 전형적인 질병의 진행을 추적하는 데 사용되는 임상 채점 루 브릭. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig2.jpg" /> EAE와 C57BL / 6 마우스 그림 2. 약리 치료 이전에 면역에 세포의 침윤. </str옹&gt; C57BL / 6 마우스 MOG 35-55으로 7 일 postimmunization에서 PBS로 처리 (N = 20) 또는 SAS (N = 19)의 임상 점수 (± SEM을 의미). 데이터는 세 풀링 독립적 인 실험에서입니다. 통계적으로 유의 한 차이는, * P &lt;0.05 비모수 양측 맨 - 휘트니 U 테스트를 사용하여 측정 하였다. (11)로부터 허가를 재 인쇄 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig3.jpg" /> 그림 3. 면역 형광 염색 및 제어, EAE의 척수에서 반응성 신경교 증의 정량화 및 치료 C57BL / 6 마우스. (A) 제어의 척수에서 GFAP (성상 세포)와 이바-1 (미세 아교 세포)에 대한 형광 라벨 (면역화 PBS (중간 패널) 또는 SAS (오른쪽 패널)로 처리) 마우스 (왼쪽 패널)와 EAE 마우스. 스케일 바 = 100 μm의. 염색 정량 immunop 퍼센트를 측정 면적 분율 기법을 사용하여 측정 하였다GFAP (B)와 이바-1 (C)에 대한 ositive 영역입니다. , ± SEM을 의미 N = 3 컨트롤, N = 3 SAS가 처리 또는 n = 4 PBS 처리 된 마우스, 마우스 당 6 절. 통계적 차이는 일방 ANOVA를 사용하여 측정 하였다 * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001. 다시 인쇄 (11)의 허가와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig4.jpg" /> EAE C57BL / 6 마우스 척수의 그림 4. 외과 분석. 처리 된 마우스에서 T 세포 침투를 감소 시연 C57BL / 6 마우스 EAE의 7 일 이내의 postinduction를 시작, SAS 또는 PBS로 처리 하였다. 척수가받은 Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) 표시 일 (15) (A) 대표 도트 플롯에 얻었다과 Th17을 (IFN-γ- / IL-17 +) CD4 + 게이트 (상단 패널)와 T 조절 세포 (Foxp3를 +) (하단 패널)에있는 세포. 도트 플롯은 오른쪽 상단 사분면의 비율을 보여줍니다. (B)의 절대 CD4 + 세포의 수뿐만 아니라, IFN-γ의 +, IL-17A +와 + Foxp3의 세포는 통계적으로 분석 하였다. (C) SAS- 및 PBS 처리 마우스 사이 EAE T 세포 개체군의 백분율에서의 변화도 관찰 하였다. 두 개의 독립적 인 실험에서 처리 SAS과 N = 9, ± SEM 평균, N = PBS 처리 10. 두 꼬리 t 테스트는 모든 막대 그래프에 사용되었다. ** P &lt;0.01. 다시 인쇄 (11)의 허가와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig5.jpg" /> 그림 5. FACEAE C57BL / 6 마우스 비장의 S 분석 치료와 처리되지 않은 마우스에 상응하는 T 세포 발현 프로필 및 확산을 입증. PBS-및 SAS 처리 된 마우스의 비장은 EAE의 15 d 개 postinduction을 분석 하였다. (A) CD4 + T 세포의 백분율받은 Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) Th17 (IFN-γ - / IL-17 +) PBS-로부터 비장, 그리고 T 조절 세포 (Foxp3의 +) 처리 (N = 10)를 2 개의 독립적 인 실험으로부터 (N = 9) 마우스 SAS는 처리. (B, 왼쪽 패널) 순 비장으로부터의 CD4 + 인구 기-67 + 세포의 비율은 (N = 4)과의 PBS-(N = 5), SAS 처리 된 마우스 (N = 5)로 유도 EAE. 단방향 ANOVA 테스트는 PBS-또는 SAS 처리 EAE의 비장 중 하나에 비해 순진 비장에서 기-67 + 세포의 비율 사이의 통계적 유의성을 보여 주었다. 어떤 의미는 PBS-및 SAS 처리 EAE의 비장 사이에 관찰되지 않았다. (B, 오른쪽 패널) 대표 도트 플롯; 번호는 확산의 비율을 나타냅니다. 도트 플롯 비율을 보여줍니다. 막대 그래프는 두 개의 꼬리 t 테스트를 나타내고, *** p &lt;0.001. 다시 인쇄 (11)의 허가와. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig6.jpg" /> 그림 6. 약리 치료 후 EAE와 SJL 마우스에 면역 세포 침투. 임상 점수 (± SEM을 의미) PBS로 처리 SJL 마우스의 (N = 8) 또는 SAS (N = 8) PLP와 하루 24 postimmunization (점선)에서 139-151. 데이터는 임상 점수의 ± SEM 평균입니다. 통계적으로 유의 한 차이는, *** p &lt;0.001 비모수 양측 맨 - 휘트니 U 테스트를 사용하여 측정 하였다. 탑 라인은 통계에 사용되는 값을 나타냅니다분석. (11)로부터 허가를 재 인쇄 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig7.jpg" /> 광학 밀도를 사용하여 MBP 염색 그림 7. 정량화. (A) EAE로 유도 한배의 새끼 제어 C57BL / 6 마우스에 비해 지정되지 않은 유전자 녹아웃 마우스에서 흉부 척수에 MBP의 대표 염색. 브라켓이 감소 MBP 염색 나타내는 탈수 초화의 대표 영역을 나타냅니다. 지정되지 않은 유전자 녹아웃 C57BL / 6 마우스에서 흉부 척수의 (B) MBP 염색. (C) EAE로 유도 지정되지 않은 유전자 녹아웃 마우스 (KO n은 = 6 마우스, 2-4 요추 및 동물 당 흉부 절) 야생형 (WT에 비해 척수에 MBP 염색의 높은 광학 밀도 (OD)를 전시, N = 3 마우스, 2-4 요추 및 EAE로 유도 흉부 동물 당 부분) 마우스. 통계적으로 분석 USI* P &lt;0.05, 두 꼬리 t 테스트를 ng를. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 스케일 바 100 μm의.

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Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

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Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

연구

면역학 및 감염병학

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for study of the human demyelinating disease, multiple sclerosis (MS). EAE is characterized by pathologic infiltration of mononuclear cells into the CNS and by clinical manifestation of paralytic disease. Similar to MS, EAE is also under genetic control in that certain mouse strains are susceptible to disease induction while others are resistant. Typically, C57BL/6 (H-2b) mice immunized with myelin basic protein (MBP) fail to develop paralytic signs. This unresponsiveness is certainly not due to defects in antigen processing or antigen presentation of MBP, as an experimental protocol described here had been used to induce severe EAE in C57BL/6 mice as well as other reputed resistant mouse strains. In addition, encephalitogenic T cell clones from C57BL/6 and Balb/c mice reactive to MBP had been successfully isolated and propagated.
The experimental protocol involves using a cellular adoptive transfer system in which MBP-primed (200 &mu;g/mouse) C57BL/6 donor lymph node cells are isolated and cultured for five days with the antigen to expand the pool of MBP-specific T cells. At the end of the culture period, 50 million viable cells are transferred into naive syngeneic recipients through the tail vein. Recipient mice so treated normally do not develop EAE, thus reaffirming their resistant status, and they can remain normal indefinitely. Ten days post cell transfer, recipient mice are challenged with complete Freund adjuvant (CFA)-emulsified MBP in four sites in the flanks. Severe EAE starts to develop in these mice ten to fourteen days after challenge. Results showed that the induction of disease was antigenic specific as challenge with irrelevant antigens did not induce clinical signs of disease. Significantly, a titration of the antigen dose used to challenge the recipient mice showed that it could be as low as 5 &mu;g/mouse. In addition, a kinetic study of the timing of antigenic challenge showed that challenge to induce disease was effective as early as 5 days post antigenic challenge and as long as over 445 days post antigenic challenge. These data strongly point toward the involvement of a "long-lived" T cell population in maintaining unresponsiveness. The involvement of regulatory T cells (Tregs) in this system is not defined.

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Certain mouse strains are able to resist induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) with myelin basic protein. Described here is a simple immunization protocol that reverses the unresponsiveness and induces paralytic disease in several typical EAE resistant mouse stains.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

포도당-6-인산염 이사머라제(G6PI)-유도 RA 마우스에서 iNKT 세포의 입양 면역 요법

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...