광유전학은 전형적인 유도제에 비해 여러 화학물질 및 단백질의 더 높은 역가를 달성하기 위해 사용되어 왔다. 이 프로토콜을 사용하면 다른 사람들이 광 기반 제어로 자신의 프로세스를 향상시킬 수 있습니다. 광유전학 조절은 비침습적이며, 고도로 조정가능하며, 가역적이다.
이러한 특성은 미생물 공정의 간소화 된 최적화를 허용하고 삼상 발효 및 다색 제어와 같은 독특한 기회를 열어줍니다. 새로운 화학 물질의 경우 최적의 조명 조건이 다릅니다. 따라서이 프로토콜의 매개 변수를 사용하여 낮은 생산이 관찰되면 다른 조명 조건을 테스트해야합니다.
먼저 OptoINVRT 플라스미드에 필요한 마커인 HIS3 옥시트로피를 갖는 사카로마이세스 세레비시아 균주를 수득한다. Saccharomyces cerevisiae에 자생하는 유전자를 조절하려는 경우, 진행하기 전에 유전자의 내인성 사본이 삭제되었는지 확인하십시오. 균주 구성을 시작하기 위해, EZL439와 같은 OptoINVRT7 회로를 포함하는 플라스미드를 선형화한다.
PIGA를 광에서 하나의 프로모터를 억누르고, 어둠 속에서 활성화시키는 성분을 포함하는 EZL439를 사용하는 경우, Pme1 제한 부위에서 선형화한다. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 방법을 사용하여, 플라스미드를 HIS3 영양영양 균주에 통합시킨다. 형질전환 후, 세포를 1분 동안 150 G's에서 원심분리한다.
세포를 200 마이크로리터의 신선한 SC-HIS 배지에 부드럽게 재현탁시킨다. 전체 세포 부피를 SC-HIS 한천 플레이트 상에 플레이트하고, 콜로니가 나타날 때까지 이틀에서 3일 동안 섭씨 30도에서 배양한다. 표준 리튬 아세테이트 변환 프로토콜을 사용하여 유능한 세포를 준비하십시오.
PIGA1M 또는 PIGA1S 프로모터의 하류를 광유전학적으로 조절하고자 하는 유전자를 함유하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨다. 형질전환 후, 배양물을 1분 동안 150 G's에서 원심분리하고, 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 신선한 SC 드롭아웃 배지에 부드럽게 재현탁시켰다. 전체 세포 부피를 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 한천 플레이트 상에 플레이트하고, 델타 부위 또는 SC 드롭아웃 플레이트 내로 통합시키면 선택 마커를 함유하는 플라스미드로 형질전환시킨다.
세포를 일정한 청색광 하에서 섭씨 30도에서 16시간 동안 배양하여 광유전학적으로 조절된 유전자를 억제된 상태로 유지한다. 465 나노 미터 파장의 광원을 사용하고 LED 패널을 플레이트 위에 약 40 센티미터 위에 배치하여 광도가 초당 평방 미터 당 약 80 ~ 110 마이크로 몰이되도록하십시오. 양자 미터를 사용하여 강도를 측정하십시오.
델타 부위에 통합되는 경우, 플레이트를 밀리리터당 400 마이크로그램과 밀리리터 당 1, 200 마이크로그램 사이의 제오신 농도의 범위를 함유하는 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 플레이트 상에 복제하여 다양한 통합 카피 수를 선택한다. 복제 플레이트를 콜로니가 나타날 때까지 이틀에서 3일 동안 일정한 또는 펄스된 청색광 하에서 섭씨 30도에서 배양한다. 예비 스크리닝을 수행하려면 각 플레이트에서 8개의 콜로니를 선택하고 이를 사용하여 24웰 플레이트의 개별 웰에 2% 글루코오스가 보충된 SC-HIS 배지 1밀리리터를 접종합니다.
일정한 청색광 조명 하에서 분당 200 회전으로 흔들리는 섭씨 30도에서 하룻밤 사이에 세포를 성장시킵니다. 다음날, 각 배양물을 신선한 SC-HIS 배지에 2%글루코스로 희석하여 600나노미터에서 0.01 내지 0.3 범위의 광학 밀도 값을 얻고, 광학 밀도가 2~9개 사이에 도달할 때까지 섭씨 30도에서 일정한 또는 펄스 빛 하에서 분당 200회 회전속도로 진탕 조건에서 배양물을 성장시킨다. 그런 다음 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 라이트 패널을 끄고 분당 200 회전으로 섭씨 30도에서 네 시간 동안 어둠 속에서 플레이트를 인큐베이션하십시오.
배양물을 234 G's의 24 웰 플레이트에서 5분 동안 원심분리하고, 세포를 2% 글루코스로 한 밀리리터의 신선한 합성 완전 드롭아웃 배지에 재현탁시킨다. 멸균 마이크로플레이트 밀봉 테이프를 사용하여 원하는 제품의 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오. 밀봉된 플레이트를 분당 200회전으로 흔들리는 섭씨 30도에서 48시간 동안 어둠 속에서 발효시킨다.
발효물을 수확하기 위해, 플레이트를 234 G's에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액 800 마이크로리터를 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 관심있는 화학 물질에 따라 고성능 액체 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피 질량 분광법 또는 사용 된 장비에 가장 적합한 샘플 준비 기술을 사용하는 다른 분석 방법을 사용하여 분석하십시오. 각 플레이트에서 여덟 개의 콜로니를 선택하고 이를 사용하여 24웰 플레이트의 개별 웰에 2% 글루코오스를 가진 SC-HIS 배지 한 밀리리터를 접종합니다.
섭씨 30도에서 어둠 속에서 밤새 세포를 성장시키고 분당 200 회전을 흔들어 라. 다음날 아침, 각 배양물을 신선한 SC-HIS 배지에서 2% 글루코스로 희석하여 0.1 광학 밀도로 희석한다. 빛에 노출되지 않도록 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 섭씨 30도에서 어둠 속에서 배양물을 분당 200 회전으로 흔들어 광학 밀도 3에 도달 할 때까지 성장시킵니다.
이어서, 플레이트를 섭씨 30도에서 12시간 동안 펄스된 광 하에서 분당 200회 진탕으로 인큐베이션한다. 배양물을 234 G's에서 5분 동안 원심분리하고, 2% 글루코스로 신선한 SC-HIS 배지에 재현탁시킨다. 멸균 마이크로플레이트 밀봉 테이프를 사용하여 원하는 제품의 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오.
밀봉 된 플레이트를 섭씨 30도에서 48 시간 동안 빛으로 발효시켜 분당 200 회전으로 흔들어줍니다. 광유전학적 발효를 수행한 후, 화학적 생산은 두 개의 회로로 유도시에 세포 밀도의 범위에서 시험되었다. OptoINVRT7 회로는 OptoINVRT1 및 2 회로에 비해 유도 값 7.0 및 8.75의 최적 세포 밀도를 갖는 젖산 및 아이소부탄올의 높은 역가를 입증했습니다.
OptoAMP 회로를 사용한 발효는 서로 다른 광 듀티 사이클에 의해 정의된 세 단계로 연구되었다. 젖산 생산은 펄스 성장 단계와 완전히 조명 된 유도 및 생산 단계를 사용하여 최적화 될 수 있습니다. 아이소부탄올 생산은 펄스 성장 단계, 완전 조명 유도 단계, 및 펄스 생산 단계를 사용하여 최적화되었다.
반면 나링게닌 생합성은 펄스 성장을 완전히 조명한 유도 및 어두운 생산 단계를 사용하여 가장 최적화되었습니다. OptoLAC 시스템은 E.Coli에서 IPDG를 사용한 화학적 유도를 사용하여 달성된 것과 비슷하거나 그 이상의 역가에서 전사 인자 FDER를 생산하는데 사용되어 왔습니다. OptoLAC 회로는 메발로네이트를 생산하기 위해 적용되었으며 생산은 IPDG 유도를 사용하여 달성 된 역가를 초과합니다.
생물반응기 수준에서의 메발로네이트 생산은 마이크로플레이트 수준을 넘어 박테리아에서 화학 및 단백질 생산을 위한 광유전학적 조절의 확장성과 조정성을 입증한다. 조명 단계에 대해 빛의 세기가 적절한 범위에 있고 어둠이 필요한 단계의 경우 빛의 오염을 피하는 것이 중요합니다. 이 기술은 효모에서 아이소부탄올의 기록적인 역가를 달성하고, 빛으로 컨소시엄 집단을 안정화시키고, 합성 광 조절 소기관을 사용하여 대사 플럭스를 조절하는 방법을 열었습니다.
