This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

서스펜션 세포 배양 1. 구축 <ol><li> BY-2 미디어 PO 4 4.43 g Linsmaier &amp; 스쿡 기저 배지, 수크로오스 30 g, 200 mg의 KH 2를 첨가하여 액을 제조하고, 증류하여 200 내지 900 μg의 2,4- 디클로로 페녹시 아세트산 (2,4-D)의 용액 물과 0.1 M KOH와 5.8의 pH. pH를 조정 한 후, 증류수 및 오토 클레이브 1,000 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다. 미디어는 4 ° C에서 2 주까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 1 %의 추가 BY-2 미디어 250 ㎖의 삼각 고체 BY-2 미디어에 성장 100 BY-2 미디어 액체 ml의 BY-2 캘러스의 한 조각 (&gt; 직경 1cm)와 플라스크 (액체 접종 한천) 및 알루미늄 호일로 밀봉. 5 일간 진탕 28-30 ° C에서 문화를 품어. 참고 : 액체 문화가 빠르게 자라다 바와 같이 BY-2 캘러스는 장기 저장을위한 고체 배지에 유지된다. 배양 부피는 통상적으로 100 ml의 배양은 세 서른 6 w 로딩 가능한 것, 필요에 따라 조정할 수있다엘 플레이트. </li><li> 전송이 BY-2 배양 신선한 BY-2 미디어의 98 ml의에 로그 상 ㎖의 진탕 28 ~ 30 ℃에서 5~7일 동안 품어. 참고 캘러스 100 5-7일 오래 배양 희석보다는 접종 : 확립 된 액체 배양 물의 계대 정기적 하나를 사용하여 수행 될 수있다. </li><li> 세포가 빠르게 정착하는 바와 같이, 철저하게 문화를 믹스 및 전송 세포 배양의 6 ml의 15 ML 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브와 세포가 적어도 10 분 동안 정착하자. 상등액을 제거하여 총 부피의 50 %까지 충전 셀 볼륨을 조정한다. </li><li> 소화를위한 6 웰 플레이트의 각 웰에 500 μl를 반전하고 피펫으로 튜브를 흔들어. 그들은 조밀 한,이 단계에서 세포를 전송 넓은 구멍 피펫을 사용하여 표준 피펫 팁을 방해 할 것입니다. </li></ol> 2. 원형질체 분리 <ol><li> 로봇 시스템 (그림 1A)의 모든 구성 요소의 전원을 켜고 소프트 예약 판 이동기 작업을 엽니 다제품. 작업 스케줄링 프로그램은 장비의 각 부분 사이의 판의 전송을 가능하게하는 다른 장비와 마이크로 이동기를 통합합니다. </li><li> 다음과 같이 이전에 실험에, 플레이트 이동기 소프트웨어 실험 실용의 각 부분에 대한 기술적 프로토콜에 사용되는 실험 실용 사양 (예를 들면, 접시, 뚜껑)뿐만 아니라, 시작 및 종료 위치를 정의합니다 : <ol><li> 판 이동기 소프트웨어의 기본 도구 모음에서 설치 프로그램을 클릭하고 관리 컨테이너 형식의 명령을 선택합니다. </li><li> 컨테이너 유형이 기존의 컨테이너 형식 라이브러리에 나와있는 경우, 해당 컨테이너를 선택합니다. </li><li> 컨테이너 유형이 기존의 컨테이너 형식 라이브러리에없는 경우 새 컨테이너 유형을 지정하기 위해 추가를 클릭합니다. </li><li> 새 컨테이너 유형을 추가 한 후, 해당 탭에 (오프셋 높이, 폭, 스택 크기 및 그리퍼) 새로운 컨테이너의 크기를 삽입하고 저장을 클릭합니다.<ol><li> 정확한 치수는 제조 업체에서 사용할 수없는 경우, 정확하게 캘리퍼스를 사용하여 가장 가까운 밀리미터에 모든 차원을 결정합니다. 컨테이너의 크기를 측정하는 오류는 판 이동기의 고장의 원인이됩니다. </li></ol></li><li> 반복 판 이동기가 발생하는 모든 컨테이너 유형에 대한 2.2.4.1 통해 2.2.2 단계를 반복합니다. 모든 실험 실용이 단계의 종료 후, 각 용기 (단계 2.2.6)의 시작 및 종료 위치를 정의 할 필요가있다. 참고 :이 프로토콜에 대한 실험 실용은 6 웰 플레이트, 깊은 웰 플레이트, 그리고 96 웰 형광 검사 플레이트를 포함한다. </li><li> 각 컨테이너의 시작과 끝 위치를 정의하려면, 특정 프로토콜에 시작 / 종료 탭을 클릭합니다. 우선, 각 콘테이너의 개시 위치를 선택한다. 다음으로, 시작과 끝 위치에서 모두 뚜껑 / Unlidded에 대한 확인란을 선택합니다. 모든 컨테이너에 대해 반복합니다. 참고 : 용기는 EQU의 또 다른 조각에 남아있을 경우ipment은 (대신 판 이동기의) 최종 위치는 비워 둘 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이 단계에서 수동으로 전체 워크 플로우의 시작 위치로 모든 판을로드합니다. 호텔 (3)에 BY-2 세포 호텔에 플레이트 히터 / 냉각 둥지 (2) 상 변환에 사용되는 96 깊은 웰 플레이트, 및 50 ml의 원뿔 2, 6 웰 플레이트를 96 웰 형광 검사 판을로드 다중 모드 분배기 상에 효소 용액 (보조 파일 1.2.2 절 참조)를 포함하는 튜브. <ol><li> 변환이 프로토콜하에 수행 될 경우, 웰 당 플라스미드 DNA 10 μL에 96 딥 웰 플레이트를 미리로드 (1 μg의 / μL하는 260/280&gt; 1.8)을 OFP 리포터 작 제물을 함유하는 플레이트에 부화 4 ℃에서 가열 / 냉각. 각 웰은, 하나의 변환을위한 실험 장치에 따라 달라집니다 가득 우물 따라서 번호를 사용합니다. </li></ol></li><li> 하려면 자동 모든 용품 및 플레이트로드지정된 위치에서 D 액 처리 플랫폼은 자동화 제어 소프트웨어 (도 1b)의 각 항목의 위치를 정의한다. <ol><li> 1 열의 MMG에 40 % PEG 200 μL (0.4 M 만니톨, 100 밀리미터의 MgCl 2, 4 밀리미터 MES, pH를 5.7), 프로피 듐 요오다 이드 200 μL 미리로드 96 웰 플레이트 하중 (PI, 1 μg의 / ㎖) 2 열 및 3 열 (둥지 2) 에탄올 200 μL, 그리고 둥지 8 피펫 팁 상자에 입력하십시오. </li><li> 메뉴에서 자동 액체 처리 플랫폼의 소프트웨어의 실험 실용의 위치를 선택 도구를 정의하고 연구소 용 편집기를 클릭합니다. </li><li> 풀다운 메뉴에서 실험 실용의 유형을 선택하거나 새 연구소 용 버튼을 사용하여 새 실험 실용 유형을 정의합니다. </li><li> 기본 프로토콜 탭을 선택하고 구성 연구소 용을 클릭하여 선택 실험 실용의 각 부분의 위치를 정의합니다. 자동화 된 액체 처리 플랫폼에 배치 실험 실용의 각 부분이 있는지 확인프로토콜을 실행하기 전에 정의. </li><li> 자동화 된 프로토콜을 트리거하려면 프로필 탐색기 창을 클릭하고 실행하는 프로토콜 (원형질체 분리, 세포 수, 및 PEG-매개 변환)의 이름을 선택합니다. </li><li> 프로토콜에서 사용되는 모든 장치를 초기화 실행을 클릭합니다. </li><li> 마지막으로, 작업 탐색기 창에서 시스템에있는 모든 용기 / 실험 실용을 확인하고 자동화 된 프로토콜을 시작하기 위해 작업 단위 추가를 클릭합니다. 참고 : 자동화 된 프로토콜의 전체 설명은 보조 파일에 포함되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 세포 수에 대한 표준 곡선을 설정 <ol><li> 수동 1 ㎖를 1 × 106 원형질체 / ml의 농도로 원형질체를 농축시킨다. 원심 분리기는 10 분 동안 1,000 XG에서 원형질체 및 상층 액을 제거합니다. </li><li> 수동으로 원형질체 펠릿에 (4 ° C로 유지) 70 % 에탄올 900 μl를 추가와 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 세포를 해결하기 위해 얼음에 10 분 동안 품어. </li><li> 핵 라벨 및 플레이트 리더 검출을 허용하도록 원형질체에 PI 100 ㎕ (1 μg의 / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 로드 2 열에서 시작하여 96 웰 형광 검사 판의 각각의 열과 행에 BY-2 미디어 액의 80 μL. </li><li> 96 웰 형광 검사 판의 1 열에서 열에서 각 웰에 BY-2 미디어 원형질체의 70 μl를 50 μl를 추가합니다. </li><li> 자동화 된 액체 처리 플랫폼의 둥지 6 접시를 놓고 2 배 연속 희석을 실행합니다. <ol><li> 자동화 된 액체 처리 플랫폼에 일련의 희석을 수행하려면 직렬 희석 마법사를 실행 클릭하고 전송 볼륨 (60 μL), 믹스 및 볼륨 (2, 70 μL), 초기 우물의 수 (열 1, 행 AF), 희석을 조절 우물 (열 2-11, 행 AF) 및 흡인 및 분배 특성 (물론 바닥에서 0.5 mm). </li><li> 매개 변수를 설정 후, 저장프로토콜을 실행하는 거라고. 주 : 모든 원형질체는 (인해 세포의 고정에) PI으로 표시되기 때문에, 형광은 원형질 농도에 비례한다. </li><li> 시리얼 희석이 완료되면 둥지 (9)으로부터 상기 플레이트를 제거하고, 플레이트 리더에 삽입하고 플레이트 판독기 소프트웨어의 표준 곡선 프로토콜을 실행. 주 : 표준 곡선은 다음 공지 원형질 농도로 각 웰에 PI에서 (여기 536 ㎚ / 620 nm의 발광)을 형광을 비교하여 생성된다. </li></ol></li><li> 플레이트 리더 프로토콜의 종료 후 플레이트를 제거한 오토 클레이브 또는 &#39;바이오 프로토콜에 정의 된 다른 드 및 활성화 절차에 대한 형질 전환 세포를 수집한다. </li></ol> 변환 4. 현미경 분석 <ol><li> 형질 전환 된 원형질체 로봇 시스템의 호텔 (1)에서 (자동 프로토콜 3, 보충 파일의 제품)와 플레이트를 제거합니다. </li><li> 회전거꾸로 현미경, 카메라, 형광 램프. </li><li> , 원형질체에 초점을 맞춘 초기의 10 배 목표를 선택 할로겐 램프를 켠 형광 램프 셔터를 닫습니다. </li><li> 브라이트를 사용하여 원형질체에 현미경 시스템과 초점 상에로드 플레이트. </li><li> 원형질체에 초점을 맞춘 후, 할로겐 전구를 끄고 형광 램프 셔터를 엽니 다. </li><li> 형질 전환 원형질체로 표시되는 pporRFP 단백질의 시각화를위한 설정 CY3 / TRITC 필터를 선택합니다. </li><li> pporRFP 형광 마커를 표현 원형질체의 수를 결정하기 위해 각 웰을 스캔합니다. </li><li> 형광 마커를 원형질체의 총 수를 표현 원형질체의 총 개수 등의 변환 효율을 계산한다. </li><li> 고압 증기 멸균 또는 &#39;바이오 안전성 프로토콜에 정의 된 다른 탈 활성화에 절차에 대한 승인 바이오 안전성 가방에 형질 전환 세포를 포함하는 접시를 수집합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 관심이 없음을 선언합니다.

위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 원형질체 분리, 열거, 및 변환에 의해-2 담배 현탁 세포 배양을 사용하기위한 검증되었습니다; 그러나, 프로토콜은 쉽게 식물 현탁 배양으로 확장 될 수있다. 현재, 원형질체 분리 및 변형 옥수수 (ZEA 메이스) (10), 당근 (Daucus의 carota) (32), 포플러 (사시 나무속 euphratica) (33), 포도 (유럽 종 포도) (34), 기...

최근, 초식 동물 6 방지 매스 수율 7 증가하고 세포벽 들음 감소 가뭄 3,4- 내염성 5 부여 제초제 저항성 2 부여 각종 질병 한 극복 유전자 변형 작물의 설계에 배치 상당한 자극이 있었다 8. 이러한 경향은 dsRNA를 10, 11의 miRNA와 siRNA를 12까지 침묵 CRISPR TALENs과 9를 사용하여 게놈 편집 및 유전자를 포함한 형질 전환 식물을 생성하는 새로운 분자 도구의 개발에 힘 입어되었다. 이들 기술은 형질 전환 체의 생성을 단순화되었지만, 또한 트랜스 제닉 식물의 투명 수 식물 재생에 의존하는 기존의 시스템을 이용하여 스크리닝 될 수 생성 병목을 만들었다. 상기의 많은 침묵과 게놈 구조 편집 빠르게 식물에 삽입 될 수 있지만, 이러한 병목 관련타겟 특성 식물을 온실에서 분석 할 때까지 종종 발견되지 않는 목적하는 효과를 생산하지 못한다. 본 논문에서는 특히 표적 유전자 사일런 편집 및 유전자의 다수의 초기 스크리닝에서의 전류 병목 현상을 해결하기 위해, 식물 원형질체의 신속한 자동화 고 처리량 스크리닝하기위한 방법을 개발 하였다. 그대로 식물 세포 반대로 원형질체의 사용은 자동화 된 플랫폼의 개발을위한 여러 가지 장점을 갖는다. 먼저, 원형질체는 식물 세포벽의 분해 후에 격리되고, 더 이상 존재하지 않는 장벽이, 변환 효율은 13 커진다. 그대로 식물 세포 (14) 및 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환 15 바이오리 스틱스 (biolistics) 변환을위한 두 개의 잘 확립 된 방법이있다. 바이오리 스틱스 (biolistics)는 변압기의 용 전문 장비를 필요로 이러한 방법 중 어느 것도 쉽게, 액체 처리 플랫폼으로 변환 할 수 있습니다rmation, 아그로 박테 리움 반면 - 매개 변환은 공동의 문화와 박테리아의 연속적인 제거가 필요합니다. 둘 다 높은 처리량 방법에 대한 의무가 없습니다. 원형질체의 경우, 변환은 통상적으로 단지 몇 액 교환이 필요하며, 이상적으로는 액체 처리 플랫폼에 적합 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 매개 형질 감염 (16)를 사용하여 수행된다. 둘째, 원형질체는 정의에 의해 단일 세포 배양, 따라서 식물 세포 배양에서 응집 및 체인의 형성과 관련된 문제들, 원형질체에서 관찰되지 않는다. 접시 기반 분광 광도계, 세포의 응집을 사용하여 빠른 심사의 관점에서, 또는 여러면에서 세포는 일관된 측정을 획득 어려움으로 이어질 것입니다. 원형질체가 배지보다 또한 치밀하기 때문에, 이들은 플레이트 기반 측정법위한 도움이되는 단일 층을 형성하고, 웰의 바닥에 침전. 마지막으로, 식물 세포의 현탁 배양은 PRIMAR 반면ILY 캘러스 (17)로부터 유래 된 원형질체는 조직 - 특이 적 발현을 확인 할 수있는 능력에 이르는, 식물 조직의 개수에서 수확 될 수있다. 예를 들어, 기능 표현형 예측에 매우 중요 할 수 루트 레벨 또는 유전자의 잎 특이 적 발현을 분석한다. 이러한 이유로,이 연구에서 개발 된 프로토콜은 널리 사용되는 담배 (담배 속 tabacum L.) &#39;밝은 노란색&#39;2 (BY-2) 현탁 배양에서 분리 된 원형질체를 사용하여 검증 하였다. 에 의해-2 현탁 배양은 식물 세포 (18)의 분자 분석에서의 유비쿼터스 사용하기 때문에, 고등 식물의 &quot;헬라&quot;셀로 설명되었다. 최근 BY-2 세포는 식물의 효과를 연구하는 데 사용 된 세포 내 단백질 지역화 23, 24, 및 식물 생물학에서 이러한 문화의 다양한 유틸리티를 보여주는 기본적인 세포 생물학 25-27, 19-22을 스트레스. BY-2 문화의 또 다른 장점입니다유전자 발현에 대한 향상된 재현성을 초래할 수있는 aphidicolin와 문화를 동기화 할 수있는 능력은 28 연구. 또한, 방법은 전통적 원형질체를 생성하는데 사용 효소 선정 높은 스루풋 시스템 금지이기 때문에, 저비용 29,30 효소를 사용하여 -2- 원형질체의 추출을 위해 개발되었다. 이와 같이, 후술하는 프로토콜 BY-2 현탁 배양을 이용하여 검증되었지만, 어떤 식물 세포의 현탁 배양으로 수정할 수있는 있어야한다. 개념 증명 실험은 하드 산호 Porites에서 오렌지 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)는는 CaMV 35S 프로모터의 제어하에 31 porites 사용하여 수행됩니다.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp;amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Formerly Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

지난 10 년간의 신호 전달 경로, 전사 조절 네트워크, 유전자 발현, 유전자 편집 및 유전자 침묵의 분석 종을 잘라내 모델 종에서부터 식물 원형질체의 사용 부활되고있다. 또한, 상당한 진전 식물 게놈 이러한 시스템의 사용에 더 많은 이익을 생성 한 원형질체로부터 식물의 재생에 만들어졌다. 이 작품에서, 프로토콜은 로봇 플랫폼을 사용하여 &#39;밝은 노란색&#39;2 (BY-2) 담배 현탁 배양에서 원형질체 분리 및 변환의 자동화를 위해 개발되었다. 변환 절차는 콜리 플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S)의 제어하에 오렌지색 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)을 사용하여 검증 하였다. 원형질체의 OFP 발현 표면 형광 현미경으로 확인 하였다. 분석은 propidiu을 사용하여 원형질체 생산 효율 방법을 포함m 요오드화. 마지막으로, 저가 식용 효소는 엄청난 비용 원형질체의 분리 및 분석을 자동화 높은 처리량에 실험실 등급 효소의 필요성을 우회 원형질체 분리 절차를 사용 하였다. 본 연구에서 개발 된 프로토콜에 기초하여, 변형에 원형질 분리의 전체 과정은 운영자의 입력없이, 4 시간 이내에 수행 될 수있다. 이 연구에서 개발 된 프로토콜은 BY-2 세포 배양과 검증 동안, 절차 및 방법은 작물의 게놈 연구의 가속을 활성화해야합니다 모든 식물 현탁 배양 / 원형질체 시스템에 번역해야합니다.

현재 연구에서, BY-2 배 속도는 15 hr의 평균 세포주기 길이 이전보고와 일치 배양은 배양되는 온도에 따라 14 ~ 18 시간에서 변화. 이 두배 속도로, 1 : 100부터 접종 5-7 일 동안 50 %의 적혈구 용적 (PCV)를 배양 선도 배양을 개시 하였다. 배양 매체 200㎖에 성장 된 상기 현재 프로토콜에서, 100 ㎖의 PCV 33 6- 웰 플레이트를 채우기에 충분한 세포를 제공 칠일, 생성 하였다. 원형질체 ?...

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

14.3K 조회수.  University of Tennessee, Knoxville.  높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다. 

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High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

연구

유전학

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

의학

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

생화학

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

생물학

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

생체공학

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

모스의 효율적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중재 변환 Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation or polyethylene glycol (PEG). Previous methods were developed to produce tens of thousands of transfected protoplasts at once. Here,&#160;we describe a straightforward method to isolate and transfect millions of leaf mesophyll protoplasts in maize (Zea mays L.). This streamlined process removes certain common protoplasting steps, such as washing in W5. Additionally, steps such as centrifugation, PEG-mediated transfection, and incubation have been modified to work with a greater number of protoplasts. The ability to express large libraries of plasmid constructs enables genome-scale experiments, such as massively parallel reporter assays in maize.

Here, we present a high-throughput protocol to transiently transfect millions of maize protoplasts for testing large libraries of plasmids in maize mesophyll cells.

옥수수 중엽 원형질체의 확장 가능한 형질감염

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...