We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Z&#252;chner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.

윤리 정책 : 인체의 권리를 보호하기는 혈액 샘플은 IRB 20,150,020 아래 마이애미 기관 생명 윤리위원회의 대학 승인 프로토콜 아래에 동의 다음 얻었다. 주 : CTC 캡쳐 필터링 혈액 응고를 방지하기 위해 EDTA 튜브에 수집한다. 1. 폴리 (N-이소 프로필 아크릴) (PIPAAm)와 마이크로 필터 코팅 <ol><li> 부탄올 10 % w / V 수용액을 제조 PIPAAm을 단다. 용액이 깨끗해질 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> 컷 플라스틱 현미경은 가위 또는 날카로운 블레이드 한 쌍의 대략 12mm X 12mm 사각형 하나에 슬라이드. 또는 단두대를 사용합니다. 주의 : 이러한 사각형 스핀 코팅 과정 동안 필터 홀더로서 기능한다. </li><li> 직선 가위의 날카로운 쌍을 사용하여, 8mm X 8mm 사각형으로 슬롯 기공 마이크로 웨이퍼를 잘라. </li><li> 플라스틱 SQUA에 컷 필터를 확보 폴리이 미드 필름 테이프를 사용하여입술 이전 단계 1.3에서 잘라. 필터 영역의 최소 7mm X 7mm가되지 않은 덮인 테이프가되도록 단지 가장자리와 필터의 코너로 필름을 적용합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54435/54435fig2.jpg" /> 그림 2 :. PIPAAm 코팅 8mm × 8 밀리 마이크로위한 마이크로 필터 세트 업의 대표적인 그림은 플라스틱 현미경 슬라이드에서 12mm X 12mm 플라스틱 사각 컷에 위치한다. 폴리이 미드 테이프를 참조 (15)의 허가 코트에게 PIPAAm.Reproduced 스핀 장소에서 마이크로을 확보하는 데 사용됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54435/54435fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="5"><li> 스핀 코터의 진공 척에, 플라스틱 광장에 고정 된 마이크로 놓습니다. </li><li> 시작, 10 초 동안 500 rpm으로, 6000 R : 다음 조리법에 스핀 코터 프로그램60 초, 10 초, 정지 500 RPM에 대한시. </li><li> PIPAAm 용액 V 완전히 표준 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 마이크로 표면을 커버하고, 스핀 코터를 시작 (1.1 제조) / w 10 %만큼을 분배. </li><li> 코팅 처리 종료 후, 스핀 코터에서 코팅 PIPAAm 마이크로 제거. 보관시 플라스틱 광장에 부착 된 필터를 둡니다. 주 : 코팅 된 필터는 최대 3 개월 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li></ol> PIPAAm 코팅 마이크로 필터 여과 카세트 2. 총회 <ol><li> 여전히 페트리 접시에 플라스틱 광장에 고정 된 마이크로 필터를 배치하여 실온에서 PIPAAm 코팅 된 마이크로을 재수. 마이크로 필터가 완전히 침수 될 때까지 1X PBS를 추가하고 5 분 동안 서 보자. </li><li> 수화 공정 후에, 가위의 쌍을 사용하여 폴리이 미드 필름 테이프를 절단하여 사각형의 플라스틱 필터를 해제. 참고 :이 필터의 어느 쪽을 기록해 둡니다PIPAAm 코팅. </li><li> 2 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 개는 개스킷 / 밀봉 역할과 함께 상하 아크릴 부재 사이의 마이크로 필터를 개재하여, 여과 카세트에 마이크로 필터를 조립한다. 필터를 확보하고 꽉 밀봉을 제공하는 클립 아크릴 카세트를 클램프. 주의 : 샘플을 통해 여과 될 때, 세포 필터 (도 1)의 표면에 도포 PIPAAm 캡처한다 있도록 PIPAAm 코팅을 위쪽으로 향하게한다. </li></ol> 마이크로 필터에서 캡처 및 CTC의 출시와 혈액 샘플 3. 여과 <ol><li> 각 주사기 펌프 브랜드가 자신의 사용자 인터페이스를 가지므로, 펌프의 사용자 매뉴얼을 참조 75ml / 시간의 속도로 유동하고 20 ㎖의 부피를 설정 주사기 펌프를 프로그래밍. </li><li> 맥코이 (상업적으로 입수 할 수 있음) 세포 배양액의 따뜻한 3 ㎖를 37 ℃까지 (10 % 태아 소 혈청 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신에 첨가하여 제조 됨). <li> 7.5 ml의 혈액 샘플에 시판 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 7.5 ML을 추가하고 25 ML의 주사기에이 희석 된 혈액을 대기음. 1 희석 혈액 10 ml를 사용하는 경우, 하나를 달성하기 위해 10 ㎖의 HBSS의 동량 혼합 HBSS 예 1 :. 주 : 혈액 샘플 (1)의 동일 부피로 희석되도록 HBSS의 볼륨을 조정한다. </li><li> 주사기와 여과 카세트를 참여하고 주사기 펌프에 배치합니다. 을 통해 흐름을 수집하고 펌프를 시작하기 위해 바닥에 50 ML 튜브를 놓습니다. 참고 : 여과 대략 10 - 12 분 소요됩니다. 모든 여과 단계를 수행하여야단계 3.8를 포함하여 상온 (20 ~ 25 °에 C)에서 아웃 </li><li> 여과가 완료되면, 어느 측 PIPAAm 코팅 표면에 잡힌 셀이 상위 인 여과 카세트 촬영 주 분리. 기음 새로운 주사기에 따뜻한 배양 배지 1 ㎖. </li><li> 매체를 포함하는 주사기 여과 카세트를 다시 결합하는 -하지만, 필터의 PIPAAm 도포면이 얻어 주사기에서 향하도록이 때 카세트의 하단부를 결합. 주 :이 완만 역방향 흐름을 적용하여 슬롯 구멍에 삽입 될 수있는 셀을 분리하는 것이다. </li><li> 다시 주사기 펌프 위에 주사기를 놓고 오른쪽 여과 카세트에서 작은 페트리 접시 또는 6 웰 플레이트를 개최합니다. 100 ㎖ / 시간의 유량을 설정하고 펌프를 시작한다. </li><li> 필터를 통해 모든 미디어에 전달하고 플로우를 통해 배양 접시를 수집합니다. 모든 미디어가 통과하는 기다린 후 펌프를 중지하고 주사기 a를 제거펌프에서 차 여과 카세트. </li><li> 주사기에서 여과 카세트를 분리하고 카세트에서 필터를 검색 할 수 엽니 다. PIPAAm 표면이 구멍에서 세포를 해제 할 때 역류를 수집하는 데 사용되는 동일한 배양 접시에 아래를 향 필터를 놓습니다. 따뜻한 매체의 나머지 부분을 추가하고 37 ° C로 설정 문화 인큐베이터로 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 30 분 후 모든 셀 필터에서 발표 될 예정이다. 그러나, 모든 세포는 분리하기 위해 최대 24 시간 동안 배양 접시에 필터를 둡니다. 참고 : 또는 방출 된 세포가 microcentrifuge 관에 수집되는 몇 가지 예를 이름을 같은 PCR, ELISA, 웨스턴 블롯으로 더 하류 분석을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 문화 24 시간 후, 신중하게 집게를 사용하여 마이크로를 제거합니다. 참고 : 필터는이 시점에서 폐기 될 수 세포가 그것에서 출시 된있다. </li><li> 부드럽게과 1000 &amp; #을 사용하여 아래로 배지를 피펫(181), 리터 피펫, 적혈구와 다시 중단에 말초 혈액 단핵 세포 필터에 포착하고 CTC와 함께 접시에 출시 (PBMC). 느슨하게 연결된 암 세포를 분리하지 않도록 신중하고 조심스럽게이 작업을 수행합니다. 조심스럽게 새로운 배지 예열을 37 ° C로 부착 된 암 세포와 대체 남기고 중에 재현 탁 적혈구와 PBMC를 포함하는 모든 매체를 제거한다. 참고 : 과도한 적혈구 하나의 세척 후 존재하는 경우이 단계를 한 번 반복 할 수 있습니다. </li></ol> 4. CTC 생존 능력 평가 <ol><li> 라이브 / 죽은 분석 (8)을 사용하여 배양 CTC의 생존 능력을 평가합니다. 참고 : 다수의 라이브 / 죽은 분석은 시판되고있다. 제조 업체의 프로토콜에 따라하는 것이 매우 좋습니다. 이 실험에 사용 된 상업 분석 키트에 대한 자료 / 시약 목록을 참조하십시오. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer:+a+retrospective+study+in+107+patients.">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).</li></ol>

Part of this work has been protected under U.S. Provisional Patent Application No. 62/219,808. Siddarth Rawal is a shareholder of Circulogix Inc. that commercially produces the filters and filter cassettes/cartridges used in this Article.

전혈에서 가능한 CTC 캡처 및 마이크로 그들을 해제 과정은 비교적 간단하다; 그러나 몇 가지 중요한 점은 언급 할 가치가있다. 이 멸균 상태가 전체 프로세스를 통해 유지되는 모든 세포 배양과 마찬가지로 필수적이다. 필터로부터 세포를 해제하는 방법의 기초가 PIPAAm의 온도 감응 계면 성질을 이용을 기반으로 PIPAAm으로 필터를 코팅의 초기 단계는 매우 중요하다. 필터는 효과적으로 피복되어 있...

전이성 질환은 대부분의 암 사망에 대한 책임이 있습니다. 전이에 대한 예후 및 동반자 진단 바이오 마커의 개발은 암 관리 및 치료에 매우 중요하다. 순환 성 종양 세포 (CTC)를 보급 종양 및 전이에 중요한 역할을 담당한다. 또한, &#39;액체 생검&#39;바이오 마커로 쉽게 접근 할 수있는, 암 환자에서 CTC 암 바이오 마커 연구를위한 온상 &#39;&#39;말초 혈액은으로 증가하고있다 &#39;. 3 - CTC 잘 유방암, 전립선 암과 대장 암 1 등 다양한 암 설정에서 예후 바이오 마커로 확인되었다. 그러나, CTC 분야에서 최근의 발전은 중재 임상 4에 도시 된 바와 같이, 이러한 희귀 세포의 단순한 열거, 임상 적 유용성을 제한 것을 지시 하였다. 따라서, CTC의 분자 및 기능 특성 수 있도록 기술에 대한 신흥 필요가있다. 현재, 몇 가지 기술은 fo를 허용하는 존재R 비 항원 바이어스, 가능한 캡처 및 CTC의 방출, 강력한 다운 스트림 분자 및 기능 분석 5,6을 가능하게한다. 이러한 미세 소자의 대부분은 마이크로 유체 플랫폼에 결합되고, 따라서 2-4 ml의 7 내지 그 처리 할 수있는 혈액의 양에 제한 요소가있다 - 10. CTC 크게 캡처 관심이 세포 분리의 가능성을 방해하므로 상기 피 처리 수의 양을 줄일 채혈 (7.5 ㎖)의 단일 튜브 희귀 이벤트이다. 우리는 더 큰 종양 세포와 작은 정상 혈구 세포 (11, 12) 사이의 크기 차이를 이용 CTC의 캡처 파릴 렌 C 막 마이크로 디바이스의 두 가지 유형을 개발 하였다. 우리는 이전에 둥근 구멍 열거 필터보고 및 마이크로은 CTC 포착 효율이 우수한 것으로 도시 된 FDA 승인 플랫폼과 비교 한암 환자의 혈액 샘플 13, 14합니다. 다만, 원형 필터의 한계를 여과 전에 포름 알데히드 계 고정 제를 사용할 필요가있다. 이 프로세스는이를 여과 과정 전단 응력 및 압력을 견딜 수 있도록하면서 세포 형태를 보존한다. 열거 분자 연구가 온 - 칩 (13)을 수행 할 수 있지만, 정착액 기능적 특성화를 수행하는 능력을 손상시킨다. 이러한 한계를 해결하기 위해 여과 전에 셀 (도 1)를 고정 할 필요성을 부정 슬롯 기공 필터를 개발했다. 슬롯 구멍 형상 (6 μm의 폭 × 40 μm의 길이 슬롯 구멍)은 단지 부분적으로 또 다른 혈액 세포 자유로운 통과를 허용하고 세포 손상을 초래할 것이다 압력 상승을 완화 따라서 세공 폐색하면서, 종양 세포를 포착 할 수 있도록 및 최종 버스트 15,16 슬롯 기공 카트리지는 샌드위치 2 아크릴 조각으로 구성된다개스킷 등의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 작용과 상부 및 하부 부분들 사이의 슬롯 기공 필터는 누수 방지 시일 (14, 15) (도 1)를 제공한다. 슬롯 구멍 필터의 포집 효율이 높은 반면, (표 1), 촬상 CTC 대신 접착 15 매개 된 세포 외 기질 (ECM)의 강한 비특이적 정전 기적 상호 작용에 의해 파릴 렌 C 막에 결합된다. 이러한 역류 또는 세포 스크레이퍼를 사용하는 등의 방법 효과적으로 필터에서 세포를 분리, 또는 세포 손상 및 세포 사망을 초래할 실패합니다. 우리는 릴리스 전략 (15)을 수립하는 PIPAAm의 자유로운 사용을 탐험했다. PIPAAm 32 °의 용액 온도 17 C 가역적 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 상전이 중합체이다. 전통적으로, PIPAAm의이 속성을 널리 조직 공학 응용 프로그램에 대해 탐구하고있다. 일반적으로 세포는PIPAAm에서 배양 PIPAAm은 소수성 인 경우 37 ℃에서 표면을 코팅. 배양 온도는 PIPAAm 코팅면 (17, 18)이된다 수화 32 ° C, 아래로 시프트 될 때 세포를 시트로 분리 될 수있다. 우리는 실온 (아래 32 ° C)에서 여과 공정을 수행 한 후 37 ° C로 유지 배지에 필터를 배치하여 세포 분리를 가능하게함으로써 열 특성을 이용. 이 온도에서, PIPAAm 중합체 층함으로써 정전 결합 된 셀 (15) (도 1)를 개방, 소수성이된다. 온도 감응 방법뿐만 아니라 다른 방법들이 성공적 19 생존 CTC 캡처를 달성하고 방출하도록 구현하였으나 -보고 된 이러한 기술이 공유 21 번 키 잠재적 인 결점들은 모두 CTC 캡쳐 항원 - 의존적 원리를 채용한다는 것이다. 항원 기반 CTC 캡처, 그림과 같이 페이지reviously, 바이어스 CTC 분석 11,14 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 선호도 기반 기술은 CTC 캡쳐는 EpCAM 결합 된 항체를 사용한다. 그러나, CTC는 이러한 기술로는 EpCAM 저와는 EpCAM 부정적인 CTC의 누락에지도는 EpCAM의 다양한 수준을 표현하는 것으로 나타났다. 비 상피 기원에서 CTC는 흑색 종 및 육종 설정에서 같은 CTC 같은 관심의 경우 또한 제한이 발생할 수 있습니다. 따라서, 항원 기반 캡처에 의해 도입 된 잠재적 인 편견없이 실행 가능한 CTC 캡처 및 출시 할 수있는 기술은 매우 바람직하다. 중요하게는, 마이크로 캡쳐 디바이스는 순수 기초 크기 및 분리 전략은 특정 표면 마커의 존재에 무관하다. 우리는 PIPAAm 코팅 된 마이크로의 고용 효과적이고 효율적으로 캡처 및 다운 스트림 분석을 위해 CTC를 해제 할 수있는 기능을 제공함으로써, 전이성 과정에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이 될 것입니다 믿습니다. 강력한이 5 월ially 쉽게 모니터링하고 암 환자 관리에 도움 될 수있는 바이오 마커를 제공하기 때문에 새로운 타겟 전신 치료가 아니라 감독 할 수있는 새로운 분자를 노출합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:216px;">Slot Filter</td>
			<td style="width:101px;">Circulogix Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MSF-01</td>
			<td style="width:167px;">Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Ploysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21458</td>
			<td style="width:167px;">Non-Hazardous. Store at room temp.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-Butanol</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7906</td>
			<td style="width:167px;">Use in well ventilated area</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="118" style="height:119px;width:216px;">Plastic Microscope Slides</td>
			<td style="width:101px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">48510-30</td>
			<td style="width:167px;">Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:216px;">Spin Coater</td>
			<td style="width:101px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:119px;">SCS G3 Spin Coater</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:216px;">Polyimide Tape</td>
			<td style="width:101px;">Uline</td>
			<td style="width:119px;">S-7595</td>
			<td style="width:167px;">Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HBSS- Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:216px;">1XPBS</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">McCoy&#39;s</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16600-082</td>
			<td style="width:167px;">Warm in 37 &#8304;C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:74px;width:216px;">Falcon Petri dishes 35x10 mm</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25373-041</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:216px;">Microfilter Cassette</td>
			<td style="width:101px;">Circulogix Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FC-01</td>
			<td style="width:167px;">Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Syringe 20mL</td>
			<td style="width:101px;">BD Scientific</td>
			<td style="width:119px;">302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:101px;">KD scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">78-0100V</td>
			<td style="width:167px;">Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellstar 50mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-322</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Greiner Bio One 6 well plate</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89131-688</td>
			<td style="width:167px;">Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SKBR3 Cells</td>
			<td style="width:101px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Live Dead Assay</td>
			<td style="width:101px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td style="width:167px;">Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">98000-368</td>
			<td style="width:167px;">Any incubator that can be used for cell culture will suffice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capture and release of viable circulating tumor cells from blood

우리는 다운 스트림 분석 및 / 또는 문화 칩에서 이러한 세포의 출시와 함께, 전체 혈액에서 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 크기를 기반으로 캡처하는 방법을 보여줍니다. 전략은 CTC CTC 및 캡처의 thermoresponsive 가능한 릴리스 코팅 폴리 (N--iso 프로필 아크릴) (PIPAAm)를 캡처하는 신규 파릴 렌 C 막 슬롯 마이크로 기공의 사용을 이용한다. 생균의 촬영은 일반적으로 여과 공정과 관련된 전단 응력을 줄이기 위해 특정 치수를 갖는 슬롯이 기공 구조의 설계를 활용하여 사용할 수있다. 마이크로 필터는 높은 포집 효율을 나타내는 반면,이 세포의 방출이 아닌 사소한입니다. 이러한 역류 또는 세포 스크랩과 같은 기술을 사용하는 경우 일반적으로 세포의 작은 비율은 해제된다. 파릴 렌 C 막 이러한 상피 암세포의 강한 접착력 비특이적 정전 기적 상호 작용에 기인한다. 일을 방해하기효과 우리 PIPAAm 코팅의 사용을 사용하여 필터로부터 세포를 분리하는 열적 반응 형 계면 성질을 이용. 혈액 제 실온에서 여과 하였다. 32 ° C 아래 PIPAAm는 친수성이다. 그 후, 필터는 배양 배지 또는 소수성을 회전시키고,이어서 세포 정전기 결합 해제 PIPAAm 결과 37 ° C로 유지 된 버퍼 하나에 배치된다.

건강한 기증자의 혈액을 사용하여 (정보통 동의 다음 마이애미 IRB 20,150,020 대학에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 획득) 배양 된 암세포, 가능한 순환 종양 세포 (CTC), 달성 캡처, 릴리스 및 검색 효율의 릴리스에 대한 thermoresponsive 기술로 아군 94 % ± 9 %, 82 % ± 5 % 및 77 % ± 5 %의 각각 (표 1) 15. 이에 비해, 필터 코팅의 박리 및 회수 효율이 상당히 낮은 (7 % ?...

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Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

프로토콜은 폴리 (N -iso - 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 - 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다.

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.4K 조회수.  University of Miami.  프로토콜은 폴리 (N -iso - 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 - 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다. 

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Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

연구

암 연구학

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene disruption, many of these studies have made use of complex gene knockout models. While these studies with knockout mice offer an elegant and time-tested system for investigating genotype-to-phenotype relationships, a rapid and scalable method for assessing candidate genes that play a role in AML cell proliferation or survival in AML models will help accelerate the parallel interrogation of multiple candidate genes. Recent advances in genome-editing technologies have dramatically enhanced our ability to perform genetic perturbations at an unprecedented scale. One such system of genome editing is the CRISPR-Cas9-based method that can be used to make rapid and efficacious alterations in the target cell genome. The ease and scalability of CRISPR/Cas9-mediated gene-deletion makes it one of the most attractive techniques for the interrogation of a large number of genes in phenotypic assays. Here, we present a simple assay using CRISPR/Cas9 mediated gene-disruption combined with high-throughput flow-cytometry-based competition assays to investigate the role of genes that may play an important role in the proliferation or survival of human and murine AML cell lines.

This manuscript describes a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) CRISPR-Cas9-based method for simple and expeditious investigation of the role of multiple candidate genes in Acute Myeloid Leukemia (AML) cell proliferation in parallel. This technique is scalable and can be applied in other cancer cell lines as well.

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor environment and cell-cell interactions. Identification of cancer and stem cell interactions, including changes in extracellular environment, physical interactions, and secreted factors, might enable the discovery of new therapy options. We combine known co-culture techniques to create a model system for mesenchymal stem cells (MSCs) and cancer cell interactions. In the current study, dental pulp stem cells (DPSCs) and PC-3 prostate cancer cell interactions were examined by direct and indirect co-culture techniques. Condition medium (CM) obtained from DPSCs and 0.4 &#181;m pore sized trans-well membranes were used to study paracrine activity. Co-culture of different cell types together was performed to study direct cell-cell interaction. The results revealed that CM increased cell proliferation and decreased apoptosis in prostate cancer cell cultures. Both CM and trans-well system increased cell migration capacity of PC-3 cells. Cells stained with different membrane dyes were seeded into the same culture vessels, and DPSCs participated in a self-organized structure with PC-3 cells under this direct co-culture condition. Overall, the results indicated that co-culture techniques could be useful for cancer and MSC interactions as a model system.

We provide protocols for evaluation of mesenchymal stem cells isolated from dental pulp and prostate cancer cell interactions based on direct and indirect co-culture methods. Condition medium and trans-well membranes are suitable to analyze indirect paracrine activity. Seeding differentially stained cells together is an appropriate model for direct cell-cell interaction.

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...