전이는 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 이 현상은 암세포가 1 차적인 종양에서 분리될 때, 마지막으로 먼 표적 기관에 도달하기 위하여 혈액 순환으로 이동할 때 생깁니다. 일단 이 분리된 세포가 혈액으로 들어가면, 우리는 그(것)들을 이차 종양 세포에게 부릅니다.
그(것)들은 가변적인 물질을 대표하는 가변적인 물자 때문에 한편으로는, 그(것)들은 전이 형성의 주범이고 다른 한편으로는, 종양 생검 보다는 쉽습니다. 실제로, 그들은 간단한 혈액 펑크에 의해 수집 될 수있다. 혈액 샘플에서 이러한 세포의 낮은 수에도 불구 하 고, 우리는 3D 대조 조건을 사용 하 여 더 큰 관심사와 환자의 혈액에서 여러 순환 종양 세포 라인을 설정 하는 첫 번째.
이 세포주 일상적인 실험을 위해 임의의 상업적 세포주에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전 약물 스크리닝의 경우, 관심 있는 단백질에 대한, 그러나 또한 생체 내 실험에서 종양 개시 능력 및 그들의 전이성 잠재력을 시험한다. CTC, 순환 종양 세포주, 저산소증에 있는 3D 조건에서 배양되어야 합니다.
CTC가 구체를 형성하면 300 RCF에서 5분 동안 배지및 원심분리기에 넣을 수 있습니다. 상체를 버리고 500 마이크로리터의 Accumax를 추가합니다. 우리는 하나를 중단하고 37도에서 20 분 용액을 배양합니다.
그런 다음 세포에 PBS와 펠릿으로 해리 된 구를 씻는다. 새로 보충된 DMEM/F12로 펠릿을 다시 중단하고 새로운 24개의 저부착 플레이트에서 마이크로리터 당 5개의 세포 밀도로 세포를 볼 수 있습니다. 원심분리기 CtCs 구체는 상체를 제거하고 PBS로 펠릿을 두 번 세척합니다.
PFE의 500 마이크로리터에서 잘 혼합하고 20 분 동안 얼음에 튜브를 배양. 그런 다음 고정 된 구체를 원심 분리하고 PBS로 펠릿을 두 번 세척하여 PBS의 최대 부피를 제거하고 형성 된 HistoGel의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 현탁액에 가져 가서 배양 꽃병에 물방울을 만들고 10 분 동안 건조하고 메스를 사용하여 분리하십시오.
이제 원하는 관심 단백질을 대상으로 하는 CtC를 위해 원하는 것을 처리할 수 있습니다. CtC를 수집하고 이전에 설명한 대로 구를 Accumax와 분리합니다. Accumax를 제거하고 3mL의 블로킹 버퍼로 펠릿을 다시 중단하고 14 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 서스펜션을 전송하여 단일 세포 용액을 얻습니다.
세포를 계산하고 튜브로 디스패치하고 200, 000 세포의 부피를 추가하고 튜브를 원심분리하고 상체를 폐기하십시오. 항체 데이터 시트에 따르면, 튜브, 항체의 원하는 부피를 다른 튜브에 추가하고 그 등류형을 추가하고 제조업체의 지도에 따라 단계를 계속한다. 나머지 튜브는 라벨이 지정되지 않으며 생존 가능성 시장의 사용은이 실험에서 강력하게 제안됩니다.
사이토미터에서 레이블이 지정되지 않은 튜브로 시작하여 음으로 표시된 영역에서 전압을 설정합니다. 이에 따라, 등류형 튜브를 놓습니다. 동종형은 양수 신호와 비특이적 신호를 구별하는 부정적인 제어 역할을 할 것이다.
그리고 관심의 단백질이 표현되는 경우, 긍정적으로 표지된 게이트의 변화를 보아야 하는 관심있는 항체를 가진 표지된 세포를 가진 실험을 완료한다. 이 일시 중단 은 mL 당 200, 000 세포의 밀도에서 보충 배지에서 CtC를 분리. 초저부착(96)에서는 50마이크로리터의 부피를 밀봉하고 저산소증으로 24시간 플레이트를 배양한다.
다음 날, 테스트 된 약물의 상이한 농도의 50 마이크로 리터를 추가하고 세포 생존가능성의 기초를 더 결정하고 또 다른 48 시간 동안 플레이트를 배양하기 위해 DMEM / F12의 동일한 볼륨을 추가합니다. 셋째 날에는 에이전트를 재구성하고 믹스의 70 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 20분 동안 놓은 다음 발광을 측정합니다.
이 분석은 CTC의 세포 성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 많은 수의 약물을 테스트하는 유용한 도구입니다. Eppendorf에서, PBS의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단 마우스의 뒷면에 피부를 꼬집어 피부 아래에 바늘을 삽입. 같은 지점에서 전체 부피를 천천히 주입하고 종양이 1.5 입방 센티미터의 크기를 초과하는 경우 매일 종양 성장을 모니터링하고 마우스를 희생한다.
수술 전에, 피하 진통제를 주입, 마우스의 등쪽 복부 측에, 10 갈비뼈 아래 작은 절개를. 비장을 부드럽게 들어 올려 멸균 거즈에 놓습니다. 인슐린 주사기를 사용 하 여, 주입 50 PBS에 다시 중단 된 CTC의 마이크로 리터와 바늘을 제거 하지 않고 3 분 동안 기다립니다.
한쪽에서 동맥 선박을 리게이트하고 다른 쪽에서 정맥 선박을 리게이트합니다. 그런 다음 두 합자 바로 위에 절단하여 비장을 제거합니다. 복막과 피부를 꿰매고 부위를 잘 소독합니다.
이 실험의 목적은 대장암 환자로부터 유래된 CTC의 용량을 테스트하여 간을 식민지화하고, 눈에 보이는 전이성 선견지명을 유도하여 대장암 환자의 용량을 검사하는 것이다. 클리닉 종양 세포주의 분리 및 확립은 근본적이고 번역적인 연구 모두를 위한 새로운 도구입니다. 예를 들어, 생체 내 연구에서 이 유전자가 대장암 세포주의 이력 및 침입 능력에 관여하는 것으로 입증된 관심 유전자가 있는 경우, 마우스비장에서 주사하기 전에 종양 세포주를 순환시키는 이 유전자를 노크하여 간을 식민지화시키는 것이 생체 내 결과를 확인하는 좋은 도구가 될 수 있다.
번역 연구를 위해 순환 종양 세포주를 분리하는 우리의 주요 관점은 개인화 된 의학에서이 귀중한 재료를 사용하는 것입니다. 환자의 혈액 샘플에서, 우리는 가능한 약물의 패널을 선별하고 마침내 속성에 그것의 세포 독성을 평가하기에 충분한 자료를 갖기 위하여 2 3 주 동안 문화에서 CTC를 격리하고 증폭할 것입니다
