JCM은 유니레버 PLC를 (BB / L023040 / 1)와 함께 BBSRC-IPA 수상에 의해 투자된다. 현대차는 고등 교육 박사 과정 재학의 사우디 아라비아 정부에 의해 자금을 지원한다.

다음 방법은 억제제 생산 균주와 경쟁 균주를 테스트하기 위해 7,8 구성된다. 참고 :이 프로토콜은 박테리아 문화와 에어로졸 생성을 포함한다. 이것은 로컬에만 승인 안전 고려 구현과 함께 포함 된 공간에서 실행될 수있다. 레벨이 안전 캐비닛 내에서 한천 플레이트에 문화의 분사하면 한천 플레이트의 오염과 주변 환경을 최소화 할 수 있습니다. 이것은 또한 스프레이 박테리아의 에어로졸 흡입에서 연구원을 보호 할 것, 이것은 연구자가 봉쇄 레벨이 생물을 사용하는 경우 주요 관심사이다. 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다. 페트리 접시 주변 지역은 최고의 일회용 흡수 조직으로 덮여있다. UV 광을 사용 후 스프레이 오염 제거가 좋습니다. 1. 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 마뉘에 따라 뇌 심장 주입 (BHI) 한천을 준비의 facturer의 지시. </li><li> 살균, 121 ° C, 오토 클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 15 ~ 20 분 동안 PSI, 또는에서 BHI 한천을 압력솥. </li><li> 멸균 배양 접시에 멸균 BHI 한천의 15 ml의 분취 액을 붓고하고 설정할 수 있습니다. 주 : 시험 한천 동일한 스톡에서 유래 내의 모든 한천 플레이트를 사용할 수 있는지 확인하고, 각 접시 한천 동일한 양이된다. 이 사용할 수 영양분과 비교를 허용 판 사이 억제제 확산의 변동성을 제한합니다. </li></ol> 2. 멸균 국물을 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 BHI 국물을 준비합니다. </li><li> 28 ㎖의 유리 보편적 인 병에 BHI 10 ml의 분취 량을 추가합니다. </li><li> 소독, 15 psi의 20 분 동안, 또는 오토 클레이브 제조업체의 권장 사항에 따라 121 ° C에서 BHI 국물을 압력솥. 참고 : 국물 AUT 같은 배치에서 유래 분석에 사용 된 모든 국물 확인결과의 변동을 초래할 수 영양소 변화를 제한하는 동시에 oclaved. </li></ol> 3. 준비 멸균 기화기 병 (의) <ol><li> vapourizer 병을 해체. </li><li> 내부 오염 물질을 제거 밤새 5 % 표면 활성 세정제에 vapourizer 병, 뚜껑과 vapourizer을 흡수하기 위해 vapourizer을 통해 5 %의 표면 활성 세정제 스프레이. 참고 : 표면 활성 세정제를 처리 할 때 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용해야합니다. </li><li> 살균 공기 흐름 후드 아래 기화기, 뚜껑과 병을 건조. </li><li> 70 % 에탄올로 병을 채우기 vapourizer를 다시 연결하고 vapourizer을 통해 에탄올의 일부를 스프레이. </li><li> 기화기에 뚜껑을 넣고 사용할 때까지 내부의 에탄올로 저장합니다. </li><li> 무균 사용 멸균 BHI 국물와 병을 세척하고 vapourizer를 통해 국물을 살포하기 직전. 주 :이 에탄올 AFF 방지6.3 절에서 병에 추가 접종을 돌출 한 칼라. </li></ol> 세균 숙박 문화를 준비 4. (들) <ol><li> 킬 선수와 균주 억제제 멸균 BHI 한천 플레이트 상 및 약 18 시간 (야간)에 대한 호기 37 ° C에서 품어. 참고 :이 판은 4 ° C에서 저장 될 때 같은 주 내에서 여러 복제에 사용할 수있는 박테리아의 재고를 생성합니다. </li><li> 28 ㎖의 만능 병 내의 필요한 경쟁자 박테리아 균주의 단일 콜로니로 멸균 BHI 배지 10 ㎖를 접종한다. </li><li> 궤도 통에 250 rpm으로 흔들어 기적 밤새 37 ° C에서의 보편적 인 병을 품어. </li></ol> 억제제 생산 격리 5. 스팟 문화 <ol><li> 제 4 항에 기재된 바와 같이 밤새 배양 (들)을 준비한다. </li><li> 한천 플레이트 뚜껑에 결로와 완전히 건조 확인, 접종 전에 (PLA를 배양하여 예37 ° C에서 60 분)에 대한 테; 이 접종 사이트에서 접시에 걸쳐 확산 접종을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 한천 플레이트의 중심 상에 하룻밤 문화의 25 μL. 완전히 한천 배양에 걸쳐 분무 공기 방울을 방지하기 위해 플런저 피펫 누름 피한다. </li><li> 문화의 확산을 제한하는 문화가 실온에서 건조하도록 허용합니다. 기적 밤새 37 ° C에서 한천 플레이트를 품어. </li></ol> 6. 준비 시험 경쟁자 스트레인의 스프레이 접종 (들) <ol><li> 약 4 × 106 CFU ml의 -1 산출하기 BHI 국물에 부 (4) 희석에서 하룻밤 문화 10 배 바와 같이, 하룻밤 문화를 준비하고, OD 600 0.3 ± 0.05의 현탁액. 참고 : 10 배 희석은 4 × 106 CFU ml의 -1 모든 박테리아 종을 제공 1 × 10 사이에 시리얼 희석 도금 확산하여 필요한 희석 계수를 계산하지 않습니다 <s&gt; -1 -1 × 10 -6입니다. </li><li> 멸균 플라스틱 향수 기화기 병에 희석 문화를 따르십시오. 참고 : 전체 볼륨 한천 플레이트의 수는 스프레이를 위해 필요 이상으로해야합니다. 약 접시 당 250 μL는 9cm 직경 페트리 접시에 적합합니다. </li></ol> 7. 이연 성장 억제 분석 <ol><li> 문화가 이전 한천에 스프레이로 분무 장치에로드 될 수 있도록 기화기 병의 각을 통해 문화를 스프레이. </li><li> 한천 위 약 15 cm의 거리에서, 전체 한천 표면에 희석 문화의 약 250 μL (일반 50 ㎖ 기화기의 3 스프레이)를 스프레이. 기적 밤새 37 ° C에서 한천 플레이트를 품어. 스프레이 같은 수의 다른 판을 반복합니다. </li></ol> 8. 이연 성장 저해 분석 결과 해석 <ol><li> 용사 competi의 성장 억제 영역을 측정토르 변형 (그림 1A - C, &quot;X&quot; &quot;X&quot;로) (- C, &quot;Y&quot;를 &quot;Y&quot;그림 1A) 억제제 제작자의 중앙 지점의 직경을 뺀 밀리미터. 참고 : 그림 1E는이 데이터가 제공 될 수있는 방법을 보여줍니다 </li><li> 억제의 영역에 대한 선명도 점수를 기록합니다. 참고 :이 관찰 된 억제의 정도를 나타냅니다. 예는도 1a에 도시되어있다 - D, 표준화에 사용할 수있는 균주는 대표적인 결과 섹션에서 제시된다. 다음 규모는 명확하게 득점에 사용할 수 : 0의 선명도 점수는 경쟁 균주의 성장을 완전히 억제의 영역을 설명하기 위해. 1의 점수는 비운의 영역에 존재하는 개별 식민지로, 성장의 거의 완전한 억제의 영역을 설명합니다. (2)의 점수가 감소 성장의 가시 영역을 설명하기 위해,이 영역 내에서 성장은 사기꾼이다유창한 또는 합류 근처에 있지만,&gt; 50 % 농도 감소. 3의 점수를 최소한의 성장 감소를 설명하기 위해, 성장 합류하고 50 % 이하로 감소되고, 영역이 계속 표시하고 측정한다. 4의 점수는 성장의 가시적 억제을 설명 없습니다. 5의 점수는 경쟁자 균주의 성장은 테스트 억제제 생산 균주의 근방에서 증가되었음을 설명한다. 예를 그림 1을 참조하십시오. 이 점수는 실험자에 주관적이다. </li></ol> 9. 복제합니다 <ol><li> 생물학적 중으로 적어도 반복 분석은 얻은 결과의 재현성을 결정한다. 참고 : 복제는 다른 일을 수행하는 경우, 측정을 4 ℃에서 후, 배양에서 제거 후 즉시 중 저장 판을 판 점수하거나 폐기하기 전에 판의 높은 품질의 사진을 찍을. 저장 또는 판의 사진이 다른 일 사이의 결과를 쉽게 비교할 수 있도록, t자신은 일 / 실험을 통해 재현 점수를 확인하는 특히 중요하다. 판의 저장 결과를 바꿀 수있는 잠재력을 가지고 있음을 유의하십시오. 참고 : 명확한 사진 장소 플레이트를 들어 수직 확산 된 빛의 영역에 무광택 검정색 배경에 자신의 뚜껑없이, 가까운 렌즈 (매크로 모드)에 개체에 초점을 할 수있는 고해상도 카메라 (≥8 MP)를 사용합니다. 대안으로, 백색 광으로 설정 트랜스 일루미네이터 일부 겔 이미 저들은 고품질, 재현성이 높은 화상을 형성 할 수있다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

다른 사람을 구별이 박테리아 종 대회 프로토콜의 중요한 단계는 억제제의 하룻밤 배양은 경쟁 분리를 첨가하기 전에 분리합니다. 억제제의 변형이 억제 화합물을 생산하는이 성장 기간을 필요로한다. 선수 변형이 동일한 매체 위에 중첩 된 바와 같이,이 방법은 모든 가능성을 관찰하는 연구를 할 수 있습니다 억제제 계통의 경쟁 균주의 성장을 방해합니다. 결과적으로, 이러한 분석은 자연 발생하는 반사; 하나의 분리가 완전히 틈새에 설정되고, 다른 성공적 틈새를 침투 할 수있는 억제 변수를 상쇄 할 수 있어야한다. 잘못 수행 한 경우 잘못된 결과가 발생할 가능성이 가장 높은이 프로토콜에 두 부분이 있습니다. 우선, 기화기 병 불완전 멸균 분석에 세균 오염을 도입 할 수있다. 인큐무균 용기의 단계 3.6에서 증발기 병 린스 사용 브로스 bation 완전히 살균 된 병을 확인하는데 사용될 수있다. 추가 살균이 필요한 경우 등 Virkon 같은 소독제 솔루션에 추가 세척은, 단계 3.2에 설명 된 표면 활성 세정제의 세척, 이전에 사용할 수 있습니다. 잘못된 결과가 발생할 수 있습니다 두 번째 단계는 경쟁 변형 (단계 6.1)의 희석이다. 희석이 최적이 아닌 경우, 억제의 명확한 측정은 쉽게 결정되지 않을 수 있습니다. 이 분석은 억제제 생산 S. 대 그람 - 양성 및 그람 - 음성 종의 넓은 범위에 걸쳐 균주 등의 다양한 코 균주를 사용하여 최적화되었다 선수 변형 7,8 등 구균 SH1000. 그것은 이후 경쟁 및 억제제 생산 균주 등 다양한-아굴라 부정적인와 아굴라 양성 포도상 구균을 사용하여 테스트되었습니다. 경쟁자로서 상기 이외의 속을 테스트 할 때변형, 접종에 대한 희석의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다. 명확성 점수 반복 사이에서 크게 다를 경우, 특정 광학 밀도로 설정하여 경쟁 균주 접종을 표준화 할 필요가있을 수도있다. 그러나, 이것은 분석이 설정 취하고,이 실험에 따라 처리 할 수​​있다 변형의 수를 감소 할 가능성이있는 시간을 증가시킬 것이다. 시각적 신속한 대안을 제공 할 수있다 맥팔랜드 표준을 사용하여 적절한 OD로 배양을 조정. 이 기술의 한 가지 제한은 단지 박테리아 배양에 적용될 수 있다는 것이있다. 많은 연구 경쟁력 제외 상호 작용 3,4,13을 예측하기 16S rRNA의 염기 서열을 사용하는 이유입니다. 그러나, 유전 및 군 유전체학 기술은 종 수준으로 지역 사회 구성원을 구별 할 수 및 / 또는 특정 종자 간 특성의 변화를 설명하지 않습니다. particul의 연결을 선별 할 수있다박테리아 종 (5)의 유무와 특성을 인코딩 AR 유전자 그러나 이것은 종의 배제와 관련 될 가능성이 유전자의 사전 지식을 필요로한다. 이 기술의 안전 고려 사항은 박테리아의 에어로졸 생성으로 인해, 그것은 단지 레벨 2 안전 캐비닛과 함께 실험실에서 사용 또는 유사한 안전주의 사항과 함께 할 수 있다는 것입니다. 종자 간 특성의 변화를 설명하고 박테리아의 에어로졸을 생성하지 않는 균주 간의 경쟁을 테스트하는 다른 방법이 있습니다. 하나의 이러한 방법은 동시 길항 작용 분석법이있다. 이 방법에서는 하나의 분리의 접종은 한천 판에 확산되어, 제 1 건조되면 두 번째 분리 접종은 상단에 발견이나 칼에 찔린된다. 이 모두 억제 화합물을 생성 및 최초의 영양분을 소기하기 위해 경쟁 균주가 직접적인 경쟁 (동시 길항)에 환경을 생성합니다. advantag동시 길항 작용 분석을 통해 이연 성장 억제 분석의 전자는 억제제의 분리는 항상 완전 경쟁 분리의 침공하기 전에 설립되고의 경쟁 우위를 가지고 있어야한다는 것입니다. 또 다른 변형이 아니라 두 개의 분리가 동시에 8에 추가되지 않고, 추가되기 전에, 하나의 분리가 설립됩니다 대부분의 틈새에서와 같이이 환경에 무슨 일이 일어날 지 더 반사입니다. 또 다른 대안은 부어보다는 억제제의 분리에 분무 할 수있는 최고 한천에서 분리 선수를 추가하는 것입니다 박테리아의 에어로졸 발생을 방지 할 수 있습니다. 그러나, 톱 아가 추가의 체적은 플레이트에도 적용을 위해 약 3 ㎖가 될 필요가있다. 이 볼륨 내에서 경쟁의 분리는 억제제의 분리와 같은 미디어에 성장하지 않을 것이다, 그래서 감소 영양분으로 고생하지 않을 것입니다. 선수는 모든 UNT 억제 화합물과 직접 접촉하지 않을위원장은 상단 한천으로 확산. 이러한 분석은 연기 억제 또는 동시 길항 작용으로 설명 할 수 없습니다. 유사한 방법을 이전 임상 S. 사이 바시 트라 신 내성의 수준을 평가하기 위해 사용되어왔다 구균은 10를 분리합니다. (10)에 의해 기술 된 여기에 설명 된 프로토콜과 그 사이의 가장 큰 차이점은, 같은 민감한 (0 점수 inhibition- 선명도를 완료) 또는 저항 후자 만 분류 경쟁 균주이다 (더 inhibition- 선명도 부분 1-5 점수). 지연된 성장 억제 분석은 따라서 또한 다 약제 내성 병원균에 대해 활성 신규 항생제를 검색하더라도 특정 항균제 또는 생산자에 대한 내성 수준을 스크리닝하는데 사용될 수있다. 숙주 미생물이 세균 커뮤니티 (9)의 바람직하지 않은 멤버를 제거하기 위해 조작 될 수 있다고 제안되었다. 코리 네형 또는 포도상 구균의 응용 프로그램ylococcus 표피 이미 S.을 제거하는 것으로 나타났다 인구 11, 12의 상당한 부분에서 콧 구멍에 균 집락. 경쟁력있는 등 여기에 설명 된 것과 같은 기술을 통해 호스트 식물의 바람직하지 않은 회원을 제외 할 수 있습니다 특정 균주에 대한 연구는 따라서 미래의 치료제가 발생할 수 있습니다.

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.

<table><tbody><tr><td>Brain heart infusion broth</td><td>Lab M</td><td>lab049</td><td>rich general purpose media</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Merck Milipore</td><td>101614</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Plastic perfume vaporizer</td><td>not known</td><td>-</td><td>10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket</td></tr><tr><td>Universal bottles</td><td></td><td>no longer in production, alternative SLS BOT5006</td><td>28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon&amp;nbsp;</td><td></td><td>surface active cleaning agent&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

deferred growth inhibition assay to quantify the effect of bacteria-derived antimicrobials on competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

분석 결과는 중앙에서 발견 억제제 생산 균주 (그림 1) 근처 오버레이 경쟁 변형의 차이로 관찰해야한다. 이러한 차이는 완전한 억제 (도 1A)의 부분 억제 (도 1B 및 1C)없이 억제 (도 1D) 또는 양의 관계로 해석 될 수있다. 널리 사용 가능한 실험실 S. 종자 표피 Tü3298 및 S. 표피 Rp62A 및 S. 표피 Rp62A 및 S. 구균 뉴먼은 각각도 1B와 1D에 사용되었다. 우리는이 균주는이 프로토콜을 테스트하는 데 사용할 수 있음을 시사한다. 시험 종에 따라, 전체 억제 및 부분 억제 가능성이 가장 높은 항균 펩타이드 항생제 또는 다른 확산 성장 inhibito의 결과억제제 생산 균주에 의해 생산 RS. 부분 억제는 또한 억제제 변형 (6)에 의한 경쟁 흡수하기 때문에 변형 또는 영양소의 금속 이온 봉쇄에 대한 감소 영양 가용성에 연결되어 있습니다. 동일한 경쟁 균주에 대해 테스트 상이한 억제제 생산 균주 사이에 억제 영역의 크기의 비교가 다음 중 어느 하나의 차이를 나타낸다 : 억제제 생산 균주에 의해 생성 된 미생물의 양; 매체를 통해 확산 억제제의 능력; 억제제의 종류 및 제조 억제제 참가자 균주의 저항 레벨이 생성된다. 동일한 억제제 생산 균주에 대해 테스트 다른 균주 사이의 경쟁 저해 영역의 크기를 비교 억제제 생산되기 라이벌 균주의 저항 레벨을 나타낸다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 결과 사용 억제 균주 사용 된 경쟁 변형에 따라 달라질 수 있습니다. 같은 억제와 경쟁 균주를 사용하여 반복이 이상적으로 동일한 선명도 점수 (8.2 절에 설명)을해야한다, 이것은 좋은 기술이 전반에 걸쳐 사용되어왔다 나타냅니다. 박테리아의 일관성 애플리케이션 발생한 경우 플레이트에 사용되어서는 안된다. 예를 들어, 경쟁 시험 배양 너무 경우 저해 영역이 크게 나타나는 전형적 (도 2A) 관찰보다 덜 명확하게 정의 된 에지로 희석한다; 이것은 모든 비교 영역 측정 신뢰성에 영향을 미칠 것이다. 억제제 생산 균주의 자리가 완전히 밤새 배양하기 전에 건조되지 않은 경우, 억제제 변형 확산 일반적으로 영역 측정에 영향을뿐만 아니라 선명도 점수에 영향을 미칠 수있는 명확하게 정의 된 지점 (그림 2B)를 형성 할 것으로 예상된다. 경쟁사의 변형 인 경우하지 균등이 박테리아의 요철 확산 (그림 2C)로 이어질 수 분무. 경쟁사의 변형이 너무 집중되어있는 경우가 경쟁 변형이 억제 변형 (그림 2C) 위에 성장 수있다, 극단적 인 경우에이 경쟁 / 억제제 변형 역할의 일부 반전으로 이어질 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> 그림 1. 성장 저해 지연된 성장 억제 분석으로부터 얻을 수있다 정량적 결과의 범위 결과 (A) 전체 금지 범위 (0의 점수), (B) 부분 억제 (1 점) (D) 없음 억제 (4 점) 내지 (C) 부분 억제 (2 점). 라벨 (Y) 억제제 균주의 성장을 억제 가장자리의 최 외측 에지를 나타내는영역 (X). (A)에 촬영 된 플레이트에 대한 측정을 보여준다 (E)에 도시 된 바와 같이, 0mm에서 10mm 이하로 억제 범위의 영역의 크기는, B, C 및 D. 결과 최근 포도상 구균 균주 (A에 대해 도시 , C) 또는 일반적인 실험실 포도상 구균은 S.는 분리 표피 Tü3298 (억제제)와 S. 표피 Rp62A (경쟁자) (B), 및 S. 표피 Rp62A (억제제)와 S. 구균 뉴먼 (경쟁) (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> 그림 2 : 빈약 한 기술에 일치하지 않는 결과의 예 결과 경우 예상보다 다르게 나타날 수 있습니다 (A. </stro선수 변형이 균일하게 분사되지 않았고 너무 집중 경우 NG&gt;) 경쟁 변형이 너무 희석하고, (B) 억제제 균주 배양 / 판 전에 완전히 건조하지 않았다 건조 또는 (C)하지 않았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.</a>

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Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

이연 성장 억제 분석은 경쟁에 세균 유래 항생제 효과를 정량화하기

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

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Research

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Biology

14.5K 조회수.  University of Liverpool. The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

비디오: Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

연구

면역학 및 감염병학

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

생물학

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

단세포 형광 화상 진찰을 사용하여 세균 간 경쟁의 정량화

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Bacterial Co-Incubation Assay: A Fluorescence Microscopy-Based Technique to Visualize Intraspecific Bacterial Competition at the Single-Cell Level

Source: Smith, S., et al., <a href="https://app.jove.com/v/62851">Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a fluorescence microscopy-based method to study bacterial competition at the single-cell level. This method provides insights into the structure and function of bacterial communities.

이연 성장 억제 분석은 경쟁에 세균 유래 항생제 효과를 정량화하기

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