Name: "phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
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We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nad&#232;ge Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche M&#233;dicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les h&#233;patites virales" (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.

참고 : Lifeact-mCherry 사용되는 플라스미드 (17) 후에 생성 박사 기욤 Montagnac, 연구소 퀴리, 파리, 일종의 선물이다. 1. 세포와 형질 참고 RAW264.7 식세포가 완전 배지에서 서브 컨 플루 (RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소) 1640 배지, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올로 성장 2 mM의 글루타민 및 10 % FCS ( 100 밀리미터 접시에 소 태아 혈청)). 그들은 전기에 의해 찬란 태그 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질된다. 정기적으로 약 5 - 6 10 6 세포는 각각 각 형질 전환 또는 공동 형질 전환 용 플라스미드의 20 μg의 10 μg의 형질된다 X. 리포 펙션 또는 전기 천공에 기초하여 형질 전환의 다른 방법은 다른 방식으로 사용될 수 있습니다. <ol><li> 셀 리프터 세포를 긁어로 pipetting하여 여러 번 아래 배지 10ml에이를 재현 탁. </li><li> 원심 분리기세포 현탁액 (300) XG, 스윙 각도 로터의 RT에서 5 분. </li><li> 완전 배지의 데우고 10 ml를 37 ℃에서 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖로 보충. </li><li> 원심 분리 후, 상층 액을 제거하고 전기 키트에서 &quot;세척 버퍼 A&quot;의 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 세포 현탁액 300 XG, 스윙 로터 각도에서 실온에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 한편, 실온에서 DNA 믹스를 조제 : 120 μL 배 완충액 B를, 관심있는 단백질 QSP 240 μL의 H 2 O를위한 플라스미드 DNA 코딩의 20 μg의 </li><li> 원심 분리 후, 전체 상층 액을 버린다. </li><li> DNA의 혼합물에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 4mm 전기 천공 큐벳으로 옮긴다. </li><li> 3 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 250 V, 900 μF에서 Electroporate. </li><li> 즉시 겐타 마이신으로 보충 된 상기 예열 (37 ° C) 세포를 완전 배지 재현 탁하고 판형100 밀리미터 접시에 m. </li><li> 하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2의 형질 감염된 세포를 품어. </li><li> 다음날 아침, (페놀 레드없는 RPMI 1640, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올, 2 mM의 글루타민) 혈청 현미경 배지 10 mL로 완전 배지를 교체한다. </li></ol> 적혈구 2. 옵 소닌 주 : 대 식세포 입자 대상의 모델로서, 양 적혈구 (SRBCs)가 사용된다. 일반적으로 35mm 유리 바닥 접시 당 약 7 × 10 6 SRBCs이 사용됩니다. <ol><li> 1X PBS (인산염 완충 식염수) /0.1% BSA (소 혈청 알부민)와 원심 분리기 (600 XG, 4 분) 100 ㎕로 세척 SRBCs. </li><li> 원심 분리 후, 상층 액을 버리고 1X PBS 100 ㎕ / 0.1 % BSA와 원심 분리기 (600 XG, 4 분)에 SRBCs을 재현 탁. </li><li> 원심 분리 후, 상층 액을 버리고 토끼 IgG 형 SRBCs와 1X PBS에서 / 0.1 % BSA를 SRBCs를 재현 탁에서 농도를 서브 응집. SRBCs의 항체 / 5 μl를 함유 용액 500 μl를 사용합니다. 주 : 항체의 서브 응집 농도 네트워크의 형성으로 검출 응집을 유도하지 않았다 최저 농도에 상응한다. 일반적으로, 서브 - 응집제의 농도는 8.2 ㎍ / mL로한다. <ol><li> 혈구 응집 시험에 의해 SRBCs을 opsonize하는 데 필요한 IgG 형 SRBCs의 농도를 결정합니다. 마이크로 1 / 25,600 - 직렬 1/50 사이 (13.1 ㎎ / ㎖에서 주) IgG 형 SRBCs을 희석. 각 웰에 2 × 10 6 SRBCs를 추가합니다. 몇 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 접시를 품어. </li></ol></li><li> 느린 회전 30 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 1X PBS에 두 세척 / 전술 한 바와 같이 0.1 % BSA 후 예열 현미경 무 혈청 배지에서의 IgG - 옵 소닌 SRBCs (IgG의-SRBCs) (2 ㎖ / 접시)를 재현 탁. </li></ol> Coverslips는 3. 폴리 라이신 코팅 <ol><li> 한편실온에서 30 분 동안 0.01 % 폴리 -L- 리신 2 ㎖로 35mm 유리 바닥 요리를 취급한다. </li><li> 1X PBS 2 ㎖로 요리 두 번 씻으십시오. </li></ol> 유리 바닥 요리에 SRBCs 4. 비 공유 고정 <ol><li> 35mm의 유리 바닥 접시 당 SRBCs 현탁액 2 ㎖를 붓고. </li><li> 35mm의 유리 바닥 접시 위에 2 분 동안 500 XG에서 스윙 로터와 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 1X PBS / 10 % BSA 2 ㎖로 한 번 씻는다. </li><li> 접시 당 1X PBS / 10 % BSA 2 ㎖로 30 분 동안 입자를 부화. </li><li> 1X PBS 2 ㎖로 요리 세 번 씻으십시오. </li><li> 예열 된 (37 ℃) 무 혈청 현미경 배지 2 ㎖로 1X PBS 교체. </li></ol> 5. 탐식 TIRFM에 의해 가시화 <ol><li> 현미경 참고 TIRFM는 오일 액침 대물 (N 100X, NA1.49), CO (2)와 가열 챔버를 구비 한 현미경을 사용하여 수행하고, 두 노래1.5 배 렌즈와 결합 르 광자 검출 카메라 EMCCD (배가 전자 전하 결합 소자). <ol><li> TIRF 현미경 세션 전날, 현미경 스테이지의 균일 한 가열을 할 수 있도록 37 ºC에서 가열 실의 전원을 켭니다. </li></ol></li><li> 임계각 결정 참고 ImageJ에 컬러 프로파일 소프트웨어 TIRF 이미지 스트림을 처리하기 위해 사용된다. <ol><li> 현미경 무 혈청 현미경 매체와 옵 소닌 SRBC를 포함하는 35mm의 유리 바닥 접시를 놓습니다. </li><li> 세포를 긁어하고 추가하기 전에 매체를 재현 탁 - 접시에 (100 500 μl를). </li><li> 현미경을 제어하고 491 nm의 및 / 또는 형광 태그 단백질을 발현하는 세포를 식별하는 561 nm의 레이저로 여기를 수행하기 위해 &quot;라이브 취득&quot;소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 찬란 태그 단백질을 발현하는 세포를 식별합니다. </li><li> 필드의 중간에 배치하고 500 메신저 취득다른 각도와 하나의 여기 파장에서 연령, 0.01º (그림 2A)의 증가와 함께, 5 °까지 0 °에서 시작. 각도 자동 현미경 시스템에 의해 변경된다. </li><li> 입사광이 완전히 유리 / 매체 인터페이스에 반영 될 수 있도록 임계각을 결정하고 소멸 파를 생성합니다. ImageJ에 색상 프로파일 러 소프트웨어를 사용하여, &quot;파일&quot;을 클릭하여 &quot;열기&quot;이미지 시퀀스를 열고 파일을 선택합니다. </li><li> 균일 한 형광 (도 2B 옐로우 1)와 셀 직사각형 도구, ROI (region of interest)를 선택한다. </li><li> 은 &quot;Z 축 프로파일&quot;플롯 (메뉴 &quot;플롯 Z 축 프로필&quot;드롭 다운 메뉴의 &quot;콘텐츠&quot;탭 &quot;스택&quot;을도 2b를 클릭하여 X 축에 대한 각도의 함수로 ROI 측정 형광 강도를 의미 빨간색 2). 주 : 임계각은 MA 선도 각도형광의 급격한 감소 전에 ximum 형광. </li><li> 예 2.00 (도 2C)과 같은 TIRF 신호를 획득하기 위해 현미경 세션 중 임계각보다 우수한 X 축에 대한 각도의 값을 사용한다. </li></ol></li><li> 취득 <ol><li> 라이브 수집 소프트웨어를 사용하여 모듈 &quot;프로토콜 편집기&quot;(그림 3A)와 인수의 매개 변수를 설정합니다. <ol><li> TIRF 지역에 대한 관심의 단백질의 형광 신호를 획득하는 &quot;멀티 채널&quot;인수를 포함하는 &quot;루프&quot;와 프로토콜을 만듭니다. (예 : 2.00)을 TIRF 각도 (예 : 50 밀리 초에 대한) 노출 시간 (예 50 %) 레이저 강도 (그림 3B 1)를 입력합니다. </li><li> 은 &quot;멀티 채널&quot;도구를 사용하여 표면 형광에서 신호 포착을 얻기 위해 TIRF 영역 위의 목적 3 ㎛의 &quot;Z 이동&quot;을 소개합니다. t 아래 각도를 입력그 임계각 (예 : 1.00)을, 폭발의 시간 (50 밀리 초) 레이저 강도 (50 %) (도 3b,도 2 및도 3). </li><li> 다음은 TIRF 영역 (그림 3B 4)에서 반환, 아래의 목적 3 ㎛의 &quot;Z 이동&quot;을 추가합니다. (발광 다이오드) (그림 3B 5) LED 밝은 빛 셀의 &quot;스냅 샷&quot;을 추가합니다. </li></ol></li><li> 입자 주위에 세포막을 확장하여 SRBC의 식균 작용을 시작 형광 태그 단백질 발현의 중간 수준으로 관심의 세포를 찾아보십시오. </li><li> 필드의 중간에 넣습니다. </li><li> 1000 프레임 - 500의 인수를 스트리밍 시작합니다. 은 &quot;루프 카운트&quot;탭에서 &quot;750 프레임&quot;(그림 3B 1)를 입력합니다. 참고 ImageJ에 컬러 프로파일 소프트웨어 TIRF 이미지 스트림을 처리하기 위해 사용된다. </li><li> 클릭하여 이미지 J 소프트웨어의 시퀀스 이미지를 엽니 다, &quot;열기&quot;, &quot;파일&quot;파일을 선택. </li><li> 탭 &quot;이미지&quot;를 클릭하여 채널을 분리, &quot;Hyperstacks은&quot;메뉴 &quot;스택 hyperstack하기&quot;기능에 드롭 다운. 등장 창을 완료 : 주문 : xyctz을; 채널 (C) : 채널 번호 (예 : &quot;2&quot;두 개의 형광 색소가있는 경우); 조각 (z) : z 축 슬라이스의 수 (예 : &quot;1&quot;Z- 축에 아무런 움직임이없는 경우); 프레임 (t) : 채널 수에 따라 분할 이미​​지의 수; 디스플레이 모드 : 그레이 스케일. 주 : 두 개의 별도의 이미지 시퀀스는 두 개의 서로 다른 채널에 대응하여 생성된다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 &#176;C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice...

식균 작용은 인식을하고 섭취 재료의 국제화 및 저하로 연결하는 수용체를 표면 재료의 결합을 시작하는 중요한 세포 기능이다. 이러한 금형 Dictyostelium의 discoideum 및 아메바 같은 단세포 진핵 생물은 박테리아에 공급하는 식균 작용을 사용하는 반면, 고등 생물 전문 세포로 진화했다. 대 식세포 또는 수지상 세포는 다양한 조직과 기관의 병원균에 대한 방어의 첫 번째 라인이며, 항원 제시 및 사이토 카인 생산 1-4을 통해 적응 면역 체계를 활성화 할 중요하다. 특정 상황에서 식균 작용은 비전문가 탐식 세포, 예컨대, 내피 세포 및 상피 세포에 의해 수행 될 수있다. 이 과정은 개발 과정과 정상 조직의 매출과 리모델링에 대한 성인의 항상성을 유지하는 것이 중요하다. 이러한 고환 또는 망막의 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 같은 마지막으로, 전문 식세포색소 상피 세포는 매우 강력한 식세포 5입니다. phagosome의 형성은 어디 미생물이나 세포 파편의 저하는 탐식 세포의 표면에 식세포 수용체의 클러스터링 시작을 발생합니다. 이러한 Fc 수용체 FCR () 또는 보완 수용체 (CR을) 등의 옵 소닌 수용체의 클러스터링을 다음과 같은 다운 스트림 신호 이벤트가 아니라 특징으로하고있다. 그러나, 수신자 같은 수용체 (TLR에), 렉틴, 만노스 수용체와 스 캐빈 저 수용체 등 다양한 비 옵 소닌 수용체도 있습니다. 이들 수용체는 만노스 또는 푸 코스 잔기, 포스파티딜 세린, 및 리포 폴리 사카 라이드 1,6-9로서 입자 표면에 결정을 인식한다. 병원체 또는 세포 파편 인식에 다음 강렬하고 과도 굴지 리모델링으로 이어질 식세포 수용체의 여러 종류의 클러스터링 바인딩을 포함한다. 세포 내 compartmen의 병렬, 초점 세포 외 유출에TS는 막 긴장의 방출에 기여하고, 큰 입자의 효과적인 식세포 작용에 중요하다. 액틴 중합 막 변형을 유도하는 신호 이벤트는 하나의 식세포 수용체를 유발 실험 모델에서 해부했다. FcRγ 쇄 매개 식균 작용하는 동안, 작은 GTP 아제 (RAC, Cdc42)에 의해 조절된다 강렬한 액틴의 중합이있다. 자신의 다운 스트림 이펙터 중, 비스 코트 - 올드리치 증후군 단백질 (WASP)은 액틴 필라멘트 1,2,4,10를 핵이 액틴 관련 단백질 복합체 2/3 (Arp2 / 3)의 활성화로 연결됩니다. 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P (2))의 로컬 생산 pseudopod 형성 초기 구동 액틴 중합 중요하다. PI (3,4,5) P (3) 그 변환은 pseudopod 확장 및 phagosome 폐쇄 (11)가 필요합니다. 여러 경로는 PI (4,5) P (2)의 실종에 기여한다. 포스파티딜 이노시톨 인산염 키나의 첫째 분리phagosome 체포의 PI (4,5) P (2) 합성에서 SES (PIPKIs). 둘째, 인산화 될 수 있고, 내가 키나제 (PI3K)를 PI3K 클래스에 의해 소비 PI (3,4,5) P (3) (12)에 변환됩니다. 포스와 포스 포에 대한 역할은 포유 동물 세포 및 Dictyostelium (13, 14)에 식균 작용 동안 PI (4,5) P (2) 가수 분해 및 F - 굴지 제거 암시하고있다. 포스 포 리파제 C (PLC) δ는 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 1,4,5- 트리스 포스페이트에 PI (4,5) P (2)를 가수 분해한다. 된 PI (4,5) P (2)와 PI (3,4,5) P (3) 인산 OCRL은 (로우의 로우 증후군)도 phagosome 형성에 관여하고있다. F - 굴지 및 해중합의 정확한 지역의 형성이 밀접하게 공간과 시간에 규제되고 우리가 세포 내 구획의 모집을 보인 것은 따라서 식세포 컵의 바닥에 지역 굴지의 해중합에 기여하고, 로컬 OCRL 포스 파타 아제를 제공하는 것이 중요하다 <sup&gt; 13, 15. 이를 위해, 우리는 여기에 설명 된 실험 셋업을 사용 하였다. phagosome 폐쇄 및 막 절단에 필요한기구 및 분자 선수는 가난 때문에 시각화 및 phagosome 폐쇄의 사이트를 모니터링의 어려움 정의 된 상태로 유지됩니다. 최근까지, 식균 작용은 어려운 phagosome 폐쇄의 사이트의 적시 시각화하고, 자신의 등쪽면에 또는면에 입자를 내면화 고정 또는 살아있는 세포에서 관찰되었다. 또한, 고정 방법은 세포막과 바이어스 pseudopodia 확장 및 폐쇄에 결과의 철회의 원인이 될 수 있습니다. 대조적으로, 우리가 설정하고 여기에 기술 한 분석은 우리가 pseudopod 확장 및 총 내부 반사 현미경 (TIRFM) (16)에 기초하여 살아있는 세포 (13)의 탐식의 폐쇄 단계를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 광학 투명의 계면에 얇은 영역에서 형광체를 여기하기 위해 소멸 파를 사용하므로뚜껑 (커버 슬립) 및 액체 (세포 배양 배지). 여진 깊이의 두께는 세포막에 가까운 분자 이벤트의 시각화를 허용 고체 표면에서 약 100 ㎚이다. TIRFM 높은 신호 대 바탕 비율을 허용 의한 세포의 조명에 수집 포커스 아웃 형광 세포 독성을 제한한다. TIRFM을 활용, 우리는 커버 슬립이의 IgG-옵 소닌 적혈구 (IgG를-SRBCs)로 코팅 한 후 폴리 리신으로 활성화되는 &quot;phagosome 폐쇄 분석&quot;을 개발했다. 관심 일시적으로 찬란 태그 단백질을 발현하는 대 식세포는 다음의 IgG-SRBCs을 삼켜 할 수 있습니다. 세포 비공유 유리 표면에 바인딩 대상 입자를 분리하는 동안, pseudopods의 선단 관찰하고 TIRF 모드에서 기록 될 수있다. TIRF 인수는 마주 할 수있는 위의 3 단계 μm의를 이동 한 후, 표면 형광 모드에서 인수와 결합탐식 컵베이스의 ualization. 이러한 과정 액틴 또는 dynamin 억제 것과 약리학 약물의 첨가는 상기 분자 수준의 처리를 절개하는 것이 가능하다. 여기에 상세히 설명 된 프로토콜은 RAW264.7 쥐의 대식 세포주 및 옵 소닌 입자이지만, 사실상, 이것은 다른 포식 세포와 같은 비드와 같은 다른 표적에 적용될 수있다. 이 방법은 시간과 다양한 식세포 과정에서 pseudopod 확장 및 phagosome 폐쇄에 관여하는 분자 선수의 공간에서 규제의 더 나은 특성을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-sheep red blood cells IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, &amp;ge;98%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes 4 mm</td><td>Cell project</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>Room temperature</td></tr><tr><td>Electrobuffer kit</td><td>Cell project</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution 0.1%</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Dilution at 0.01% in water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium GLUTAMAX&amp;nbsp; Supplement</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Sheep red blood cells (SRBCs)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conserved in Alsever buffer at 4 &amp;deg;C before use</td></tr></tbody></table>

"phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

이 논문에 설명 된 실험 시스템은 개략적으로도 1에 표시된다. 형광 태그에 융합 관심의 단백질을 발현하는 트랜 RAW264.7 식세포는 비공유 수정 된 IgG를 - 옵 소닌 양 적혈구 (SRBCs)에 접촉 배치 커버 슬립에. 대 식세포는 그것을 삼켜하기 위해 커버 슬립에서 SRBC를 분리 할 수​​ 있습니다. 사용 TIRF 현미경이 3 μm 이상의 Z 시프트 후의 표면 형광 모드 pseudopods 및...

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"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

6.4K 조회수.  Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité. We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

비디오: "Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

연구

면역학 및 감염병학

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

생화학

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

신경과학

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

생체공학

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

생물학

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

Source: Marie-Ana&#239;s, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54470">&#34;Phagosome Closure Assay&#34; to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM).</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a high-resolution total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy technique for real-time visualization of phagosome formation and closure during macrophage-mediated phagocytosis of IgG-opsonized red blood cells (RBCs) attached to the surface of a glass bottom dish. The macrophages extend pseudopodia around the RBCs and engulf them inside the phagosomes, detaching them from the glass surface.

"Phagosome 폐쇄 분석은"사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

요약

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동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

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TIRF 현미경을 통해 단일 이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

"Phagosome 폐쇄 분석은"사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

요약

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