이 에세이의 전반적인 목표는 식세포증의 시각화를 위한 대식세포와 안진적혈구를 3차원 시간 경과 현미경 검사법에 대비하는 것입니다. 이 방법은 phagocytes가 입자를 포착하고 섭취하는 방법과 같은 면역학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 입자가 섭취되었는지 여부에 대한 평가만 허용하는 전통적인 종점 애법과 달리 실시간으로 입자 섭취량을 시각화할 수 있습니다.
일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 세포 격리 절차에 익숙해질 때까지 투쟁수 있습니다. 우리는 먼저 우리가 Phagocytosis의 3D 시간 경과 화상 진찰을 위한 이 공초점 현미경 검사를 회전의 이점을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 가지고 있었습니다. 복막 대식세포를 분리하려면 24게이지 플라스틱 카테터를 3~4개월 된 마우스의 복막에 넣고, 플라스틱 5밀리리터 주사기를 사용하여 칼슘과 라베이지당 4.5밀리리터의 얼음차가운 HBSS로 2회 캐비티를 세척합니다.
흡인 현탁액을 14밀리리터 폴리프로필렌 라운드 하단 튜브로 이송하여 수집합니다. 두 샘플이 모두 수확되면, 위심분리및 완전한 중탄산염 무료 RPMI 1640 배지의 1밀리리터에서 복막 세포를 재중단하여 밀리리터 농도당 약 6배 10~6세포를 달성한다. 다음으로, 미리 채우기 슬라이드는 전체 HEPES 의 1 밀리리터를 섬유네틴 코팅 채널 슬라이드의 하나의 저장소에 보충하고 슬라이드를 기울여 매체를 다운스트림 저수지에서 흡인할 수 있도록 기울입니다.
원치 않는 기포를 제거하려면 두 저장소 중 하나에 신선한 매체의 1~2밀리리터를 추가하고 저장소 캡을 단단히 적용합니다. 그런 다음 뚜껑에 리듬 엄지 압력을 가하여 슬라이드에서 공기를 펌핑하고 필요에 따라 슬라이드를 기울입니다. 모든 공기가 배출되면 슬라이드를 저수지가 들어 있는 미디크 매체쪽으로 기울이고 캡을 제거하여 공기가 다시 채널로 빨려 들어가는 것을 방지합니다.
이제 세포 용액을 몇 번 피펫하여 응집을 줄이고 이산화탄소가 없는 경우 섭씨 37도의 습한 챔버에서 2시간 동안 슬라이드의 한 채널에 세포의 마이크로리터 100마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서 각 슬라이드에 배지를 함유하는 HEPES를 완전한 중탄산염 보충 매체로 대체합니다. 그런 다음 세포를 37도 의 습한 인큐베이터에 넣고 야간 배양에 대해 5 %의 이산화탄소를 제공합니다.
다음 아침 에 새로 얻은 건강 한 기증자 혈액의 1 밀리 리터를 전송 2 밀리 리터 둥근 바닥 폴리 프로필렌 미세 원심 분리 기 튜브. 그런 다음 샘플을 원심 분리합니다. 상체가 함유된 플라즈마와 버피 코트를 제거합니다.
그리고 퇴적한 적혈구의 100 마이크로리터를 완전한 HEPES 보충 배지 100 마이크로리터를 포함하는 2밀리리터 미르코센트심분리기 튜브로 조심스럽게 이송한다. 튜브를 1:1로 표시하고 희석된 적혈구의 4개의 마이크로리터를 완전한 HEPES 보충 배지의 2밀리리터를 포함하는 새로운 2밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송한다. 그런 다음이 튜브4:2000에 레이블을 지정하고 희석 된 적혈구 샘플 튜브를 얼음에 둘 다 놓습니다.
복막 대식세포에 레이블을 지정하려면 각 채널 슬라이드의 중탄산염 배지를 HEPES로 보충하는 완전한 매체로 대체합니다. 그런 다음 슬라이드를 기울여 슬라이드의 100 마이크로리터 채널의 개구부에 현명하게 드롭을 첨가할 수 있도록 형광 태그마우스 대식세포 특이적 항체의 100 마이크로리터를 허용한다. 하류 저수지로 흐르는 매체를 흡습하고 이산화탄소가 없는 경우 섭씨 37도에서 습한 챔버에서 20분 동안 세포를 배양합니다.
복막 세포가 부드럽게 4:2000 적혈구를 혼합하고 새로운 2 밀리리터 마이크로 센트리후르 튜브로 세포의 400 마이크로 리터를 전송하는 동안, 약 5 ~ 8 분 동안 라미나르 흐름 후드 내부가열 알루미늄 블록에. 세포가 섭씨 37도까지 따뜻해지면 세포와 적절한 적색 형광 혈장 막 얼룩의 0.4 마이크로리터를 혼합합니다. 그런 다음 세포를 열 블록에 다시 놓습니다.
5 분 후 신선한 HEPES의 1.6 밀리리터를 추가하여 세포를 씻어 완전한 중간 및 원심 분리기를 보충합니다. 적혈구 펠릿을 식별하기 위해 튜브를 회전합니다. 1-1.5 밀리리터 파이펫 팁을 사용하면 펠릿을 방해하지 않고 두 부피로 상체를 조심스럽게 제거하고 2000 마이크로리터의 신선한 HEPES를 혼합하여 세포와 완전한 매체를 보충합니다.
원심 분리기 및 400 마이크로리터의 중간 체질을 다시 중단합니다. 그런 다음 플라즈마 멤브레인 얼룩에 대한 튜브 PMS에 레이블을 지정합니다. 20분 의 복막 세포 라벨인 배큐베이션의 끝에서 신선한 완전한 HEPES 보충 배지의 1 밀리리터로 슬라이드를 씻어내십시오.
적혈구를 opsonize하기 위해 PMS 샘플 튜브에 마우스 IGG2B 단일 클론 항인간 CD235A 항체의 마이크로리터 1개를 첨가한다. 37°C에서 8분 후 분당 1회 혼합을 한 번 혼합한 후 IGG는 채널 슬라이드를 포함하는 배니토날 대식세포로 인간 적혈구를 염색하여 분당 100마이크로리터를 전달하였다. 인간 적혈구가 첨가되자마자 회전 디스크 공초점 현미경에 슬라이드를 장착합니다.
단계 인큐베이터는 섭씨 37도로 설정하고 즉시 세포를 이미징하기 시작합니다. 적색 형광 인간 적혈구로 제시된 녹색 형광 대식세포의 시간 경과 3D 이미징은 단일 입자 식세포 이벤트의 시각화를 가능하게 한다. 예를 들어, 대식세포 필로디펜디움에 의한 인간 적혈구를 opsonized 마우스 IGG의 포획을 관찰할 수 있다.
뿐만 아니라, phagocytic 컵 형성 하는 동안 인간의 적혈구의 압박. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 상주 복막 대식세포, 형광표시 세포 및 공진 입자를 분리하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야 합니다.
