이 연구는 교육, 싱가포르 교육부 (AcRF Tier1-RG40 / 13 Tier2-MOE2013 - T2-2-038)에 의해 지원됩니다. 원고는 Obrizus 통신에서 에이미 설리번에 의해 편집되었다.

모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 조건에서 유지되고 모든 마우스 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 실시하고있다. 버퍼 및 시약 1. 준비 <ol><li> 55 μM 2- 머 캅토 에탄올을 완료 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 페니실린 (100 IU / ㎖) / 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖)을 제조 ). </li><li> 별도로, 20 배 균형 소금 용액 (BSS) 주식 1 재고 2를 준비합니다. <ol><li> 20 배 BSS의 1 개 (1 L 멸균 111 mM의 포도당, 8.8 MM의 인산 칼륨, 26.7 mM의 인산 나트륨)를 준비하고 최종 볼륨 조정하기 전에 20 배 BSS의 1 개에 40 ㎖의 0.5 % 페놀 레드를 추가합니다. 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터. </li><li> 20 배 스톡 BSS 2 (25.8 mM의 염화 칼슘 이수화 물, 107 mM의 염화칼륨, 2.73 M 나트륨 CH 준비loride 19.6 mM의 염화 마그네슘 육수화물, 1- L 멸균 16.6 mM의 마그네슘 설페이트). 4 ℃에서 저장하기 전에 0.2 μm의 필터를 사용하여 살균 필터. </li><li> 400 ml의 멸균 각각 별도로, 50 ㎖ BSS의 1 개 및 50 ml의 BSS 주식이 희석, 실험적인 사용을 위해 1X BSS를 준비합니다. 모두 희석 솔루션을 결합하여 pH 7로 조정하고, 20 ㎖의 FBS (2 %)를 추가합니다. 0.2 μm의 필터를 사용하여 멸균 및 살균 필터를 사용하여 1 L까지 최고. 참고 : 농축 BSS 주식 혼합 직접 침전이 발생할 수 있기 때문에 BSS의 재고 솔루션은 별도로 준비해야한다. </li></ol></li><li> 적혈구 (RBC) 용해 버퍼 <ol><li> , RBC 용해 버퍼를 준비 사용하기 전에 1 부품 재고 트리스베이스 (멸균 130 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, 산도 7.65) 9 부에게 재고 암모늄 클로라이드 (멸균 155 MM의 염화 암모늄)를 혼합합니다. 참고 : 4 ° C에서 염화 암모늄 및 트리스베이스의 저장 멸균 재고 솔루션을 제공합니다. 용해 B를 제조적혈구의 효율적인 용해를 보장하기 위해 신선한 uffer. </li></ol></li></ol> 비장 또는 림프절에서 림프구 서스펜션의 2 세대 주 : 마우스를 안락사 이전 실험에 필요한 모든 시약 및 장치를 제조 및 높은 세포 생존율을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 림프구의 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 중요하다. <ol><li> 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식에 의해 실험 마우스를 안락사. 참고 : 이후이 단계에서 모든 실험 절차는 무균 적으로 수행해야합니다. </li><li> 어떤 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 전체 마우스를 찍어. 비장과 림프절 무균 8을 제거하고 또는 (단계 1.2.3에서) BSS / FBS (2 % FBS와 RPMI) 5 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS를 포함하는 별도의 15 ml의 튜브에 배치합니다. 주 : BSS 효율적 RBC 용해를 방지하기 때문에, 비장 세포 현탁액의 제조 RPMI를 사용 afte BSS로 전환R RBC 용해. </li><li> 2 ml의 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS를 포함하는 페트리 접시에 멸균 100 μm의 셀 스트레이너 메쉬의 두 조각 사이에있는 기관 (들)을 배치, 비장이나 림프 노드에서 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그것은 매우 미세한 부분으로 찢어 때까지 1 ml의 주사기의 플런저를 사용하여, 기관 (들) 매쉬. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고, 셀 스트레이너 얼음처럼 차가운 RPMI / FBS 또는 BSS / FBS 메쉬 씻는다. 나머지 세포 현탁액을 수집 같은 15 ML 튜브에 추가하고, 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. 뜨는을 제거합니다. 주 : 다음 단계에서 RBC 용해 버퍼 또는 매체를 추가하기 전에 손가락으로 튜브를 flicking하여 펠렛 세포를 일시 중지 다시. </li><li> 세포 현탁액을 원심 분리 동안 실온 (RT) RBC 용해 버퍼를 준비한다 (단계 1.3 참조.). 상층 액을 세포를 펠렛 및 제거한 후, 매 10 8 세포를 1 ml의 RBC 용해 버퍼와 세포를 다시 일시 중지합니다. 인큐BATE 3-4 분 동안 RT에서 분해 반응. </li><li> 14 ml의 얼음처럼 차가운 BSS / FBS와 RBC 용해를 중지하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. </li></ol> B 및 T 세포의 정제 3. <ol><li> B 세포의 정제 <ol><li> 혈구 세포를 사용하여 계산. 300 ㎕의 BSS / FBS 최대 10 8 비장 세포를 다시 일시 중지하고 50 μl의 항 CD43에게 자기 마이크로 비드 9,10를 추가합니다. 죽은 세포를 제거 30 μl를 넥신 V 자석 구슬을 추가합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화. </li></ol></li><li> T 세포의 정제 <ol><li> 혈구 세포를 사용하여 계산. 비 T 세포 고갈 항체 칵테일 10 8 세포 (CD19, B220, GR-1에 대한 비오틴 항체까지 다시 일시 중지, TCR-γδ, CD49b, 중 CD11c, CD11b를, Ter119 및 CD4 또는 CD8은에 표적 세포 인구에 따라 / FBS -4,5- 200 μL의 BSS 200 :) 정제 1 희석. A의 세포 현탁액을 부화15 분 동안 4 ° C 냉장고. </li><li> 배양 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 10 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 30 μL의 스트렙 타비 딘 마이크로 비드 15 ㎕를 넥신 V 자기 구슬 165 μL의 BSS / FBS에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 30 분 동안 4 ℃로 냉장고에 세포 현탁액을 부화. 주 : 심지어 자기 마이크로 비드와 라벨을 보장 15 분 동안 마이크로 비드와 세포를 배양 한 후 15 ML 튜브를 눌러 부드럽게 세포 현탁액을 혼합 단계 3.1.1 중에 다른 15 분을 품어. 또는 3.2.2. </li></ol></li><li> 셀 정화를위한 분리 컬럼의 제조 <ol><li> 세포의 마이크로 비드 라벨 동안 사용되지 않은 분리 컬럼을 준비한다 (단계 3.1.1. 또는 3.2.2.). RT에 (FBS)없이 사전 따뜻한 BSS 및 세척 및 무균 열 평형을 2 ml를 사용합니다. BSS와 평형 후, 세척 된 열은 건조하도록 허용해서는 안된다. 참고 : 우리는 LS의 C를 사용하여olumn 대신 권장 LD 열 인해 재사용 성을 (단계 3.4를 참조하십시오.). </li><li> 자기 구슬 표시 한 후, 세포를 세척하고 4 ℃에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운 14 ml의 BSS / FBS를 추가합니다. 상층 액을 제거하고 1-3 ml의 RT BSS에서 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 정제 과정에서 유속을 감소시키기 위해 열 선단에 멸균 21 G 바늘을 부착. 평형화 컬럼에 세포 현탁액을 넣고 정제 된 표적 세포를 함유 통해 흐름을 수집한다. 주 : 열로드하는 동안에 거품을 도입하지 마십시오. </li><li> 1 ml의 BSS / FBS 한 번 컬럼을 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 다시 한번를 통해 흐름에 열을 다시로드합니다. 동일한 15ml를 튜브에 제 2 로딩 돌파 흐름을 수집한다. </li><li> 1 ml의 BSS / FBS와 열을 3 회 세척하고 정제 된 표적 세포를 포함 통해 흐름을 수집합니다. 그 후, 토륨 5 ml의 BSS / FBS를 추가플런저와 전자 칼럼은, 새로운 15 ML 튜브에 열을 밖으로 자기 표지 된 세포를 세척합니다. </li><li> 정제 B 또는 T 세포의 항원 4,5- 표면에 결합하는 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 수집 된 세포의 순도를 확인한다. </li></ol></li><li> 다시 사용하여 분리 컬럼을 주 : LS 열이 정화 효율에 영향을주지 않고 4 회 이상 재사용 할 수있다. <ol><li> 5 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)와, 플런저를 사용하여 상부로부터 증류수 5 mL로 3 회 컬럼을 3 회 세척 하였다. </li><li> 5 ml의 70 % 에탄올로 컬럼을 세척하고 광범위 열에 녹의 축적을 방지하기 위해 공기 탭을 사용하여 열을 건조. </li><li> 별도의 정화 실험을 위해 사용 된 LS 열을 준비하려면, 주사기 어댑터를 사용하여 5 ml의 70 % 에탄올로 아래에서 위로 열을 씻는다. 다음으로, 컬럼의 상단에서 한 번에 5 ml의 PBS 다음에 5 ml의 멸균 PBS로 두 번 아래에서 위로 열을 씻는다. 2 추가ml의 RT BSS는 열 평형을 다음 라벨 세포와 열을로드로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 4. CFSE 라벨 및 자극 주 : 정제 된 세포는 시험 관내의 다양한 생체 기능 분석에서 실시 될 수있다. 여기서는 장갑차 (5)의 T 세포 자극 기능을 결정하기 위해 정제 된 T 세포를 사용한다. <ol><li> 37 ° C 이전 CFSE에 로딩 사전 따뜻한 라벨 솔루션 (PBS에서 0.1 % FBS). 참고 : PBS에서 FBS의 낮은 비율을 사용하여이 CFSE 로딩 중 세포 사멸을 감소시키고 원심 분리하는 동안 세포 손실을 최소화 할 수 있습니다. 그러나, 너무 많은 FBS는 CFSE 로딩을 방해 할 수 있습니다. </li><li> 라벨 용액으로 두 번 정제하여 세포를 세척 한 다음 15 ㎖의 튜브 예열 라벨링 용액에 2 × 107 세포 / ㎖로 재현 탁. </li><li> 10 μM CFSE의 용액을 제조 하였다 (1 : 500 희석 5mM의 CFSE 원액) 예열 라벨 솔루션이다. CFSE 솔루션해야갓 최적 라벨링을 달성하기마다 준비. </li><li> CFSE로 세포를 로딩하기 위해, 37 ° C에서 10 분 동안 어두운 데에서 15 ㎖의 튜브에 1 부분 10 μM CFSE의 용액에 한 부분에 세포 현탁액을 추가 배양한다. 5 μM CFSE의 최종 농도는 1 × 10 7 세포 / mL의 라벨을 사용한다. </li><li> CFSE 로딩 동안 세포 균질 한 혼합을 보장하기 위해 관마다 2 분 전환. </li><li> 반응을 중지 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 매체의 여러 볼륨을 추가, 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운합니다. 성공적인 CFSE 로딩되면, 세포 펠렛은 황색 표시됩니다. </li><li> 워시 CFSE는 얼음처럼 차가운 완전한 RPMI 배지로 세포를 한 번 더로드 및 체외 배양 또는 생체 자극에 사용하기 전에 4 ° C에서 5 분 동안 453 XG에 스핀 다운. </li></ol> 5. 체외 자극 <ol><li> 바로 사용하기 전에 자극의 2 배 원액 (2 배 자극 원액)를 준비 (10) 그래서배 자극 원액 0 μL를 96 웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕의 최종 부피로 세포 100 μl를 첨가 할 수있다. </li><li> (B 세포 또는 T 세포 CD3 및 CD28 또는 CD40에 대한 IgM의) 자극 코팅 플레이트가 필요할 경우, 밤새 4 ℃에서 PBS에 자극 및 프리 코트 배양 접시를 희석. 대안으로, 배양 용기는 실험 하루에 1 시간 동안 37 ℃에서 코팅 할 수있다. PBS (접시 언제든지 건조하는 것을 허용하지 않는다)로 두 번 코팅 된 판을 씻으십시오. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> B 세포 </td><td></td></tr><tr><td> 자극 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> F (AB &#39;) 2 염소 항 - 마우스 IgM의 </td><td> 0.6-2.4 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 반대로 마우스 CD40 단클론 항체 </td><td> 0.5 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 재조합마우스 IL-4 </td><td> 25 U / ㎖ </td></tr><tr><td> 리포 폴리 사카 라이드 </td><td rowspan="2"> 0.1 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> E.에서 (LPS) 대장균 혈청 형 055 : B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> T 세포 </td><td></td></tr><tr><td> 자극 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 항 CD3 (플레이트 코팅) </td><td> 2-10 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> (50 μL / 웰 코팅) </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CD28 (플레이트 코팅) </td><td> 2 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 재조합 IL-2 </td><td> 40 U / ㎖ </td></tr><tr><td> PDBu (포르 볼 에스테르) </td><td> 5-50 ng를 / ㎖ </td></tr><tr><td> A23187 (칼슘 이온 운반체) </td><td> ng를 250 / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 체외 배양에서 림프구를 자극하는 데 사용되는 자극의 농도.<ol start="3"><li> CFSE 표지 된 B 세포의 경우, 3 × 105 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양 6 × 10 3 세포 / ml을 다시 중지 / 웰로 72 시간 동안 96- 웰 편평 바닥 플레이트. </li><li> CFSE 표지 된 T 세포, 0.5~3 × 105 세포 중으로의 완전한 RPMI 배지 및 배양에 0.5~3 × 106 세포 / ㎖로 재 - 정지 / 웰에서 48 또는 72 시간 동안 96 웰 둥근 바닥 플레이트 . </li></ol> 6. 생체 자극 <ol><li> 생체 자극, 적응 적 전송을위한 마우스 당 4 × 10 6 CFSE 표지 T 세포 (정맥 주사 (IV) 200 ㎕의 PBS에) 각 MHC-일치받는 사람 마우스로. 참고 :이 프로토콜에서, CFSE 표지 T 세포가 적응 적 집 같은 비장과 림프절 등 장기 림프하는 것입니다 이러한 세포로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 이용하여 전송할 수 있습니다. </li><li> 일일 나중에 항원받는 사람 마우스에 도전. 노트:OVA 특이 적, T 세포 수용체 (TCR) -transgenic T 세포가 적응 적받는 마우스에 옮겼다 때문에이 예에서는 항원으로서 난 알부민 (OVA 단백질를 50㎍ / 마우스)를 사용한다. 각받는 사람 마우스 (5)로, 피하 주사 (SI)를 통해 멸균 PBS에서 OVA 단백질을 준비하고 OVA 단백질 / PBS 또는 PBS 제어의 100 μl를 주입. </li><li> 수확 3 일 OVA 단백질 또는 PBS와 예방 접종 후받는 사람 마우스의 단일 림프 기관에서 세포 현탁액 (림프절과 비장)을 생성합니다. 근위 림프절 장간막, 오금, 사타구니, 허리와 꼬리 림프절을 포함 겨드랑이, 상완 및 표면 경부 림프절) 및 말초 림프절 (DLN)를 포함한다 (PLN),에 별도의 림프절. FACS 적절한 항체를 사용하여 염색 된 세포는 T 세포의 증식을 확인한다. 주 :이 CFSE 셀 추적 실험에서 비 디위한 기준선 형광을 설정 PBS가 주입 된 대조군 마우스로부터 T 세포를 CFSE 표지세포를 이용하므로. 증식 세포 분열은 항원 자극, CFSE 표지 된 세포는 형광 피크 (12, 13)을 측정함으로써 가시화된다. PBS를 제어으로 증식 세포 분열의 수, CFSE 표지 된 T 세포 12,13 결정될 수있다. </li><li> 샘플 사이의 세포 분열이나 피크의 수를 비교하여 CFSE 표지 된 세포 증식 데이터를 분석 (도 1 및도 2). 참고 : 예를 들어, CFSE 표지 된, 적응 적 난자 항원을 수신받는 마우스에 전달 OVA 특이 적 T 세포는 PBS가 주입 된 대조군 마우스에 비해 5,12- 활성 증식을 받게 될 것이다. 또한, 호킨스 동료 (14)에 의해 입증 된 바와 같이 CFSE 세포 증식 데이터를 분석하는 다양한 방법이 있다는 것을 지적 주목할 만하다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜에서는, 우리는 림프 기관에서 림프구를 정제하는 과정을 보여줍니다. 자기 비드 정렬을 사용하여 셀 정화가 가능한 고도로 정제 된 표적 세포를 산출 빠르고 간단한 방법이다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 세포 생존 및 세포 수율 체외에서 조혈 계통 세포의 생존을 유지하는 것은 성공적인 및 재현 실험을 보장하는 데 중요합니다. 화학 및 생물학적 시약, 하위 최적의 실험 조건이나 절제 기관의 부적절한 보관 조건은 모든 세포 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 마우스의 적출 후, 림프 기관 얼음과 가능한 빨리 제조 된 단일 세포 현탁액에 저장 될 필요가있다. 세포 현탁액을 고속 원심 또한 피해야한다. 또한, 세포 펠릿 상층 액을 제거 후 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 느슨하게해야합니다. 그것은 아니다피펫으로 매체의 많은 양의 직접 다시 중단 펠렛에 좋습니다. 약 모든 주요 림프절 2-4 × 10 7 비장의 B 세포와 2 × 10 7 T 세포는 하나의 8-10주 된 WT 마우스에서 분리 할 수 있습니다. 앞서 언급 한 바와 같이 정제 및 B (예상 값 이하) T 세포의 감소 된 수는 서브 - 최적의 조건을 나타낸다. 세포 순도 이 프로토콜을 이용하여 분리 된 세포의 평균 순도는 시험 관내 또는 생체 내 실험 (도 1a)에 후속 충분히 순수 90 ~ 95 %의 범위이다. 이 때문에 열의 제한 바인딩 용량 이렇게하면 세포의 순도를 손상시킬 수 있기 때문에 분리하는 과정에서 세포의 과도한 숫자와 분리 컬럼에 과부하를하지 않는 것이 좋습니다. FBS의 품질 그만큼FBS의 품질은 배지 림프구를 시험 관내 생존에 중요한 보완하기 위해 사용. 다른 소스와 배치에서 FBS는 체외 림프구의 반응에 지원하기 위해 자신의 능력에 따라 다를 수 있습니다. 따라서, 낮은 배경 높은 특정한 응답을 제공 하나를 찾기 위해 FBS의 종류를 시험하는 것이 중요하다. 병의 상당수는 재고로 확보되어야한다. 수정 및 문제 해결 CFSE 라벨 조건 CFSE 표지 플레인 RPMI 작동하더라도, 우리는 PBS의 FBS의 낮은 비율을 사용하여 라벨링의 효율을 손상시키지 않고,로드 과정 세포 사멸을 감소 시킨다는 것을 발견 하였다. 또한, FBS의 존재 원심 동안 세포 손실을 최소화한다. CFSE 표지의 중요한 측면은 별개의 피크를 가시화하기 위해 셀에도 표시되도록하는 것이다의 세포 분열을 대표하는. CFSE의 오버로드는 시험 관내 또는 생체 내에서 표지 세포의 가난한 복구 증가 세포 사망을 초래할 수 있습니다. 한편, 표시하는 과정 표적 세포 현탁액 불충분 CFSE 표지 또는 얼룩이 CFSE 12 피크 잘못 해석 될 수 있습니다. 따라서, CFSE 표지 조건을 최적화하는 것이 중요하다. 라벨 사용 CFSE의 양은 과부하 잠재적 독성 효과를 감소시킬 수만큼 낮게, 여전히 실험 기간 내에 자극에 멋지게 해결 피크를 검출하기에 충분한 표시를 달성한다. 또한, 제대로 해결 피크를 피하기 위해, 세포 덩어리는 CFSE 로딩하기 전에 단일 세포 현탁액으로부터 제거한다. 세포 덩어리 및 세포 손실 영구적 remova 때문에 다음 단계로 진행하기 전에 세포가 완전히 재현 탁되도록 중요실험 중 세포 덩어리의 난 크게 세포 수를 감소시킨다. 세포 덩어리는 일반적으로 세포 생존율이 감소 또는 세포 펠렛 불충분 재 현탁액과 연관된다. CFSE 및 발광 스펙트럼 오버랩 세포가 더 배양 한 일 후 형광 - 복합 항체로 정의 할 수 있습니다 CFSE 표지 그러나, 이러한 CFSE 표지 된 세포는 여전히 문화에서 하루 후 밝은 형광 남아있다. 이러한 피코 에리 트린 (PE) 및 피코 에리 트린 - 시아닌 7 (PeCy7) CFSE와 같은 발광 스펙트럼 오버랩 최소량으로 밝은 형광 접합 된 항체의 조합을 사용하여 최적의 염색 결과를 제공한다. 그러나 보상은 방출 스펙트럼의 중첩이 여전히 필요 줄일 수 있습니다. 또한, 수신 거부를 달성하기 위해 FL-2 값의 높은 비율을 차감하여 보상 할 수있는 FL-2 채널로 유출 CFSE 신호 (FL-1 채널)의 높은 강도의 FL-2 채널이있다 인해imal CFSE 프로필. 하나는 Quah 등., 문제 해결 CFSE 라벨 및 결과 (12)의 분석을위한 솔루션을 제공에서 발표 한 논문을 참조 할 수 있습니다. CFSE 대안 CFSE의 발광 스펙트럼은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 형광 염료 (FITC) 컨쥬 게이트 항체 형광 유도체 CFSE의 조합의 사용을 제한한다. , 노란색 (CTY, 580분의 555 ㎚), 지금까지 적색 (CTFR, 630 : 바이올렛 동일하게 높은 형광 강도 및 낮은 세포 독성 (450분의 405 nm의 CTV, 여기 / 방출) 다른 상업적으로 이용 가능한 세포 염료는, 그러나,있다 / 661 nm의 또는 CPD670, 670분의 647 ㎚)과 빨간색 (PKH26, 567분의 551 ㎚). 다양한 발광 스펙트럼과 세포 표지 염료를 사용하여 실험 설계에서 유연성을 제공한다. 한편, 상술 한 셀 라벨 염료 모든 별개의 세포 분열 피크를 생성 할 수있다. 비교 연구는 사용하여 수행다양한 세포 표지 염료 CTV 명확히 정의 세포 분열 피크 (13)의 더 많은 수의 검출이 가능하기 때문에 CTV는 CFSE에 대한 더 여분이라고 결론 지었다. 제한 자기 세포 정렬의 주요 제한은 간단 셀 정렬에만 적합하다는 것이다. 우리의 예제에서, 우리는 비장에서 모든 비 B 세포를 고갈 CD43을 사용할 수 있습니다; 그러나 변 연대 B 세포로부터 모낭 B 세포를 분리 할 수 ​​없다. 이 하위 집단은 여러 표면 마커로 정의 할 수 있습니다. 이 양 자기 세포를 사용하여 세포를 여러 표면 마커에 기초하여 정렬이 선택 가능하지만, 제 2 마커를 진행하기 전에 정렬의 첫 번째 라운드 후에 표적 세포의 마이크로 비드의 분리가 가능하게 특별히 제조 된 시판되는 시약에 의존한다. 따라서, 사용자는, 시판 키트에 완전히 의존 할 것이다. 이러한 경우, FACS I훨씬 더 유리한 정제 된 세포 집단을 분리에서이야. 기술의 중요성 자기 세포 정렬 및 FACS 등의 항체 기반의 셀 정렬 방식은, 15 데이트 기술을 정렬 가장 신뢰할 수있는 세포이다. 세포 분리하는 다른 방법은 그러나, 임파구가 잘못 부착 세포는 밀도 계 순응도 기반 기술을 포함하여 존재 및 개체군 따라서 adherence- 밀도 계 적용하거나하지 기술이며, 밀도가 상대적으로 비슷하거나 매우 비효율적 15 . 도입, 신속, 간단, 높은 세포 생존에 언급, 어떤 정교한 장비와 독립적으로 FACS를 통해 정렬 자기 셀의 경력이 기능은 다음과 같습니다. 최소 modificatio와 표적 세포를 단리하는 동안 특히 네거티브 고갈, 자기 분리 컬럼을 사용하여 바람직하지 않은 세포를 라벨 정렬 자기 셀을 이용하여 고갈NS 세포 표면 및 나이브 상태를 유지. 미래의 응용 프로그램 이러한 자기 - 기반 정제 기술을 사용하여 정제 고도로 농축 가능한 한 나이브 림프구 림프구 행동의 다양한 기능 분석 및 시험 관내 및 생체 내에서 시그널링 메커니즘을 실시 할 수있다. 이 프로토콜에서 우리는 두 개의 서로 다른 세포 증식 분석을 사용하여 시연 - [3 H] 티미 딘 통합 분석 및 CFSE 세포 증식 분석 - 활성화 림프구의 세포 증식 능력을 조사하기. 사이의 선택 [3 H]를 티미 딘 혼입 분석 및 CFSE 세포 증식 분석은 주로 샘플 크기 및 실험 조건에 의존한다. 큰 샘플 크기의 실험에 [3 H] - 티미 딘 혼입 분석을 이용하여 높은 처리량 세포 증식 데이터를 생성한다. 위해 &lt;[최적의 보장세포의 대다수가 적극적으로 분할 될 때 SUP&gt; 3 H] - 티미 딘 흡수 및 결과의 재현성 [3 H] - 티미 딘을 배양 물에 첨가한다. 라벨 프로토콜의 최적화가 다른 세포 유형 및 자극을 위해 요구된다. 또한 의한 [3 H] - 티미 딘이 혼입 분석에만 수신자 마우스에 시험 관내 (도 2B)에서 활성화 또는 적응 적 전송 될 수있는 셀의 CFSE 표지 달리 시험 관내에서 수행 될 수있다 (도 1b의 방사능 자연 및 1C). CFSE 세포 증식 분석, 다른 한편으로는, [3 H] - 티미 딘 혼입보다 세포 증식에 대한 정보를 제공한다. CFSE 표지 된 세포 CFSE의 강도는 각각의 세포 분열 절반으로 감소하기 때문에, 하나의 셀 분할 수와 피크의 수와 크기를 계산하여 각 부문의 세포의 비율을 결정할 수있다 <suP&gt; 12, 13. 또한, CFSE 표지 된 세포는 상기 대응하는 형광 접합 된 항체를 사용하여 유세포 분석하여 그 표면 분자의 발현에 따라 서로 다른 서브 세트들로 정의 될 수있다. 가장 중요한 것은, 최종 시점에서 세포 증식을 측정하는 [3 H] - 티미 딘 혼입 분석 달리 CFSE 세포 증식 분석 세포 증식 능력의 동력학에 대한 추가 정보를 제공하고, 세포 분열의 추적을 허용한다. 그러나, CFSE 세포 증식 분석은 큰 샘플 크기 실험에 적합하지 않을 수있다.

Mature lymphocytes generally exist in the resting state if there is no pre-existing infection or inflammation in the individual. Therefore, it is important to retain the na&#239;ve status of lymphocytes during the isolation process before performing in vitro or in vivo functional assays. The key to ensuring consistent and reproducible results is to limit any unnecessary manipulation of the cells. 
Magnetic cell sorting utilizes antibodies and microbeads to label cells so as to enrich the cell population of interest. With this approach, there are two purification strategies: positive enrichment and negative depletion. Positive enrichment enriches the cell population of interest using an antibody that binds to the target cells. Negative depletion, on the other hand, depletes non-target cells, leaving the cell population of interest. In our lab, we prefer negative depletion to positive enrichment because the binding of antibodies to the target cells could potentially alter cell features and behavior. In fact, many established cell surface markers suitable for the isolation of a particular cell population are also functional receptors. 
Magnetic cell sorting not only yields highly pure populations of viable target cells, it is also less time-consuming and avoids the cellular stress induced by high-pressure flow used in fluorescence-activated cell sorting (FACS). By labeling the unwanted cell populations and depleting them using a magnetic separation column, we are able to perform rapid cell isolation without compromising the viability of the target cell population. In this protocol, we demonstrate the use of negative depletion strategies to purify na&#239;ve B cells or T cells.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 (without L-Glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Heat inactivated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD43 magnetic microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td>Mix well prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-101</td>
			<td>Mix well prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Annexin V magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-201</td>
			<td>Mix well prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LD&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom sterile culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well F-bottom sterile culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m cell strainer mesh</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To sterilize using UV radiation prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m&#160; sterile disposable filter units</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>567-0020</td>
			<td>Can be substituted with any sterile filter device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34557</td>
			<td>CTV for short; alternative to CFSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Yellow</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34567</td>
			<td>CTY for short; alternative to CFSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34564</td>
			<td>CTFR for short; alternative to CFSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Dye eFluor 670</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0840</td>
			<td>CPD670 for short; alternative to CFSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td>PKH26, alternative to CFSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Can use from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(5-(and 6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-1157</td>
			<td>Reconstitute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A23187 (Calcium ionophore)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and recombinant protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b biotin (clone m1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c biotin (clone N418)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117304</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin (clone Ter119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#947;&#948; biotin (clone GL-3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118103</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 biotin (clone 6D5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115504</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 biotin (clone RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49b biotin (clone DX5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108904</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 biotin (clone GK1.5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100404</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 biotin (clone 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td>T cell depletion cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#8217;)2 goat anti-mouse IgM (plate coated)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>115-006-075</td>
			<td>50 &#181;l/well for coating (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD40 mAb (plate coated)</td>
			<td>Pharmingen&#160;</td>
			<td>553722</td>
			<td>50 &#181;l/well for coating (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant IL-4</td>
			<td>ProSpec&#160;</td>
			<td>Cyt-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E. coli Serotype 055:B5</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (clone clone OKT3) (plate coated)</td>
			<td>eBioscience&#160;</td>
			<td>16-0037-85</td>
			<td>50 &#181;l/well for coating (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD28 (clone clone 37.51 ) (plate coated)&#160;</td>
			<td>eBioscience&#160;</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>50 &#181;l/well for coating (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant IL-2</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>Cyt-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from chicken egg white, Ovalbumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and activation of murine lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

림프구 세포 자기 정화 사용자가 상대적으로 짧은 시간 동안 표적 세포 집단을 정제 할 수있다. 우리 공핍 프로토콜을 사용하여, 정제 후 94.2 % (에 72.8 % (전 정제) 행 (재결합 활성화 유전자 1 (RAG-1) 결핍 생쥐 OT-I) CD8 T 세포의 비율을 증가 할 수 있었다; 도 1a) 4,5. 이러한 정제 림프구는 림프구 증식 및 신호 전달 4,5-을 결정하는 다운 스트림 기능 분석에 사용될 수있다. 예를 들어, 우리는 장갑차의 생체 내 T 세포 자극 능력을 연구 할 야생형 (WT) 및 적합한 항원 5 면역화 돌연변이 (MT) 마우스에 CFSE 표지 된, 항원 특이 적 T 세포를 옮겨서. 우리의 대표 실험에서, 우리는 정제, CFSE 표지, 난백 알부민 (OVA) 특정 OT-I CD8 T에 c 전송제어 (WT) 및 돌연변이 (MT) 마우스에 ELL 학생은과 OVA 단백질과 일일 나중에이 쥐를 면역화. 사흘 면역화 후에는 림프절 (기단 및 말단) 및 비장을 수확하고 유동 세포 계측법에 의해 T 세포를 분석 하였다. CD45 대립 유전자 형태는 더 비 표지받는 CD8 T 세포로부터 분할, CFSE 표지 된 도너 OT-I CD8 세포를 분리하는데 이용 될 수있다. 이 예에서, 기증자와받는 사람 세포 CD45.1와 CD45.2 쥐, 각각 (그림 1B)에서 있습니다. 이 시점에서 생존 CFSE 레벨 비자극 OT-I T 세포 비 증식 세포 (도 1c, 점선)에 피크를 정의하는데 사용된다. 자극시 OT-I T 세포의 수준 CFSE의 강도는 각 부문에 반으로 줄일 수있다. T 세포 증식시켜 CFSE가 6,12 봉우리의 개수를 카운트함으로써 결정될 수있다. 우리의 대표적인 결과에서, 우리는 WT와 MT 장갑차의 크로스 프리젠 테이션 능력의 차이를 (표시되지 않습니다도 1c에 실선)은 T 세포가 모두 마우스에서 비슷한 속도로 증식하기 때문이다. 별도의 실험에서는 작동 제어 및 MT T 세포의 세포 증식을 연구하는 [3 H] - 티미 딘 혼입 분석을 수행 하였다. 정제 된 WT 및 MT T 세포는 48 시간 동안 다양한 자극과 자극 최종 8 시간 동안 [3 H] 티미 딘와 펄스했다. 세포주기의 S 단계에서 세포 증식하는 방사성 표지 된 뉴클레오티드를 포함 할 것이다 [3 H]를 티미 딘, 새로 합성 된 데 옥시 리보 핵산 (DNA)에 따라서, 액체 섬광 계수를 이용하여 세포 증식에 의해 측정 될 수있다 [3 H] 티미 딘 흡수. 분 (CPM) 당 카운트의 수는 직접적으로 T 세포 증식에 [3 H] - 티미 딘 흡수의 양에 상관. 우리의 대표적인 결과, 자극에 MT T 세포로부터 얻은 CPM의 감소 된 수는 C에 비해WT T 세포에서 ounts는 MT T 세포 (그림 1D)의 손상 증식 능력을 나타냅니다. B 세포의 증식 능력을 결정하기 위해 상술 한 플리 전략을 사용하여 비장 B 세포를 정제 하였다. 정제시에, 우리는 98.4 %로 (정제 이전) 63.9 %에서 B220의 B 세포 (WT 마우스)의 비율을 증가 할 수 있었다 (정제 한 후,도 2a) 4. T 세포를 정제하여 유사하게, 정제 된 비장 B 세포는 림프구 증식 및 신호 전달 (4) 평가하기 위해 다운 스트림 기능 분석에 사용될 수있다. 다음으로, 우리는 CFSE로 정제 WT 비장 B 세포를 표지 및 사이토 카인 IL-4를 보충 항 CD40으로 코팅 된 플레이트를 사용하여 시험관 내에서 이들 세포를 자극. 세 일간 자극 후에는 유동 세포 계측법에 의해 실행 가능한 활성화 된 B 세포를 분석 하였다. CFSE 생존의 수준은이 시점에서 자극되지 않은 B 세포를 사용비 증식 세포 (그림 2B, 점선)의 피크를 정의합니다. T 세포와 유사하게, B 세포의 수준 CFSE의 강도는 각 부문 6,12 절반으로 줄일 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54596/54596fig1.jpg" /> 도 1 면역화 후 적응 적 전송 정제 OT-I T 세포의 CFSE 프로필 OT-I 세포 분리 (A) CD4 및 CD8 염색]. RAG-1 결핍 마우스 전 (위 패널)과 (하판) 이외의 T 세포 고갈 후. (B), 비장 (SP)에서 T 세포의 대표적인 FACS 플롯 근위 림프절 (PLN) 및 말초 림프절 (DLN). 기증자 OT-I CD8 T 세포는 긍정적 인 CD45.1된다. 비장으로부터 전송, CFSE 표지 된 OT-I 공여체 T 세포 (C) 대표 CFSE 프로필 (SP), 근위 림프절 (PLN) 및 말초 림프절 WT의 (DLN) (곡선 음영) 및MT (실선)받는 사람 마우스 삼일 OVA 단백질과 LPS와 예방 접종 후. 점선 (PBS 주입) 면역없이 WT받는 마우스에서 OT-I T 세포를 나타낸다. [3 H] - 티미 딘 흡수 분석법에 의해 측정 된 활성화 된 제어 또는 MT T 세포 (D) 세포 증식. 결과는 분 (CPM) 당 카운트에 제시되어있다. 정제 된 제어 (오픈 바) 또는 MT (폐쇄 바) T 세포는 매체 만 (중)에서 48 시간 동안 배양 하였다거나 또는 재조합 IL-없이 플레이트 바인딩 항 CD3 또는 항 CD3 플러스 안티 CD28의 존재 2. 클론 세포 활성화는 PMA (포르 볼 에스테르)와 A23 (칼슘 이온 운반체)에 의해 발생했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54596/54596fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54596/54596fig2.jpg" /> 그림 2 : CFSE 프로필시험 관내 자극시에 B 세포. (A) 및 B220 (상판) 전 (하판) 비 B 세포 고갈 후 WT 쥐로부터 분리 된 비장 세포의 CD3 염색. (B) 항 CD40과 IL4로 코팅 된 플레이트 시험 관내 자극 3 일 후 CFSE 표지 WT (회색 곡선) 비장 B 세포의 대표 CFSE 프로필. 점선은 자극없이 CFSE 표지 WT B 세포를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54596/54596fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K 조회수.  Nanyang Technological University. Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

비디오: Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

쥐과 잇몸 세포의 분리, 처리 및 분석

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...