This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).

윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다. 혈액에서 단핵구 세포의 분리 (1) <ol><li> 단핵구 세포의 분리 (일 -5) <ol><li> 셀 준비 튜브 (CPT)에서 혈액 추첨에서 신선한 혈액의 10 ml의를 얻습니다. </li><li> 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 혈액을 전송하고 하나의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석 : 4 비율. 주 : 희석 높은 비율은 더 높은 순도를 위해 사용될 수있다. </li><li> 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 밀도 구배 배지 10 ㎖를 첨가하고 신중 밀도 구배 매체 위에 희석 혈액 층을 포함한다. 원심 브레이크없이, 실온 (RT)에서 30 분 동안 750 × g으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 버피 층 전송 튜브를 PBS 30 mL를 넣고 세포를 세척 하였다. </li><li> RT에서 5 분 동안 515 XG에 세포를 원심 분리기. &lt;/ 리&gt; <li> PBS를 폐기하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 세포를 카운트하고, 24 웰 플레이트의 웰 당 1 × 10 6 세포를 접시. 증발을 방지하기 위해 주변의 우물에 PBS를 추가합니다. </li><li> 전달 전에 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 5 일 동안 세포를 안정화. 세포를 방해하지 않고 일 3-4에 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ML을 추가합니다. </li></ol></li></ol> 센다이 바이러스 2. 형질 <ol><li> 전달 (0 일) <ol><li> 모아서 15 ml의 원추형 튜브에 혈액 세포를 전송하여 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 전달 당 3 × 10 5 세포를 준비하고 실온에서 5 분 동안 515 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 흡인함으로써 상층 액을 제거하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 비 코팅 24- 웰 플레이트의 웰에 세포를 옮긴다. </li><li> 얼음 센다이 바이러스 액을 해동하고, SU에 추가spended 세포. 제조업체의 권장 사항에 따라 세포에 센다이 바이러스를 추가합니다. </li><li> 밀봉 막 접시를 밀봉하고 30 ℃에서 30 분 동안 1150 × g으로 원심 분리하여 그것을. </li><li> 원심 분리 후, 5 % CO 2 밤새 (O / N)으로 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li></ol></li><li> 공급 매트릭스 셀 전송 (1 일) <ol><li> 다음 날, 코트 비트로 넥틴과 24 웰 플레이트. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS의 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 24- 웰 플레이트의 웰에 비트로 넥틴 1 ㎖를 첨가하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서이를 부화. 사용 전에, 코팅 용액을 제거한다. 코팅 된 플레이트 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 잘 코팅에 세포와 바이러스를 포함하는 모든 미디어를 전송합니다. </li><li> 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ㎖의 나머지 세포를 수집하고 세포를 함유 웰에 추가한다. </li><li> 35 ° C에서 10 분 동안 1,150 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 센트 후rifugation, 상층 액을 제거 IPSC 미디어 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO 2 O / N 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li></ol></li><li> 제 2 셀 트랜스퍼 (주 2) <ol><li> 코팅 단계 2.2.1에 기술 된 바와 같이 5 μg의 / ㎖ 비트로 넥틴과 새로운 24- 웰 플레이트의 웰. 각 형질에 대한 플레이트 잘 하나를 사용합니다. </li><li> 새롭게 코팅 된 비트로 넥틴 플레이트에 상기 제 1 플레이트로부터 세포 현탁액을 전송. 주의 : 필요하지 않으면, 현탁 세포는 폐기 될 수있다. 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 세포를 수확. </li><li> 한편, 5 % CO 2 O / N에서 37 ℃를 유지 관리를 위해, 제 1 플레이트의 웰에 IPSC 배지 1 mL를 넣어 배양한다. </li><li> 37 ° C에 부착 된 세포를 유지하고 5 % CO 2와 신선한 IPSC 미디어와 함께 매일 미디어 변경을 수행합니다. 식민지는 전달 후 일에 14-21 나타납니다. </li><li> CentrifugE 1150 XG 10 분간 35 ℃에서 현탁 세포를 포함하는 새로 도장 판. </li><li> 원심 분리 후, CO 2 O / N이 5 %에서 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li><li> 다음날, 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC의 용지로 교체합니다. 주의 : 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 상층 액에 세포를 수확 단계 2.3를 반복합니다. </li><li> 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 미디어 변화에 부착 된 세포를 유지한다. </li></ol></li></ol> 3. 재 프로그래밍 셀 유지 보수 <ol><li> 24 웰 플레이트 배양 후 조기 유지 보수 <ol><li> 세포가 합류 일단 7-10일 전달 후하는 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS에서 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 접시에 비트로 넥틴의 1 ML을 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 그것을 품어. </li><li> 씻어PBS로 세포와 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %. </li><li> 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC 미디어의 3 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 새로 코팅 된 60 mm 접시에 모든 재현 탁 세포를 플레이트. </li><li> 세포가 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 5 % CO 2에서 37 ° C에서 그들 세포에 10 mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가하고 유지한다. </li></ol></li><li> 식민지 모양에 대한 분할 (서브 클로닝 준비) <ol><li> 단계 3.1.2에 설명 된대로 비트로 넥틴 코팅, 100-mm 요리를 준비합니다. </li><li> PBS로 세포를 세척하고 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %. </li><li> 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 세어 접시 당 1 × 104 세포를 준비합니다.</li><li> 250 XG에서 세포를 원심 분리기 및 RT 2 분. </li><li> IPSC 배지 6 ㎖, 재현 탁에 1 × 104 세포가 도포 100 mm 접시에 입혀, 미디어에 10mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가한다. </li><li> 큰 식민지가 나타날 때까지 일주일 동안 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 세포를 품어. 참고 : 유지 및 서브 클로닝을 위해 식민지를 확장합니다. 서브 클로닝은 일반적으로 5 구절 아래에 이루어집니다. </li></ol></li><li> 식민지 용액을 분리 IPSC 식민지를 사용하여 따기 <ol><li> 식민지 따기, 씨앗 단계 3.2.7에서 언급 한 바와 같이 비트로 넥틴 코팅, 100 mm 접시에 1 × 104 세포, 전에 일주일. </li><li> 비트로 넥틴 용액 2 ㎖를 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하여 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다. </li><li> 현미경 (40X 또는 100X 배율)을 통해 관찰함으로써, 마커 펜을 사용하여 명확한 경계와 식민지를 표시합니다. 단계 3.3.2에서 만든 새로운 판에서 비트로 넥틴 솔루션을 제거하고 6 ml에 추가IPSC의 매체는 10 mM의 Rho 키나아제 보충. </li><li> 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS 3 ㎖로 씻는다. </li><li> IPSC 식민지 분리 액 1ml를 추가하고 RT에서 30 초 동안 그들을 품어. </li><li> 플레이트에서 솔루션을 제거하고 추가로 30 초 동안 RT에서 그것을 품어. </li><li> P200 피펫을 사용하여 판에서 미디어 200 μl를 그리는 피펫 팅하여 대상 식민지를 분리합니다. 새로운 100 mm 접시에 흩어져있는 식민지를 전송합니다. </li><li> 부화 및 5 % CO 2에서 37 ℃에서 세포를 유지한다. 참고 : 그들이 10 특성이 적어도 10 구절 이후에 이루어졌다 통로에 도착할 때까지 순수한 IPSC 식민지를 획득 한 후, 세포를 유지 하였다. 항체 희석 및 프라이머 정보는 표 1 및 표 2에 나타낸다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application.">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine:+current+progress+and+future+perspectives.">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li><li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application.">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li><li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions.">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li><li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells.">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li><li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells.">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

배아 줄기 세포 (는 ESC)는 여러 단점을 보였다 때문에, 다른 도구의 필요성이 요구되었다. 따라서 야마나카에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포의 발달 (iPSCs)은 국제 주목 받게되었다. 야마나카는 만능 성인이 체세포에 네 개의 유전자를 추가로 유도 될 수 있다는 것을 발견한지 거의 10이었다. iPSCs 성숙한 체세포에서 &quot;유도&quot;된다 때문에, 한번는 ESC 관련된 문제이었던 윤리적 문제를 회피 할 ?...

줄기 세포는 최근 몇 년간 한 임상 치료에서 가장 매력적인 물질 중 하나이었다. 줄기 세포의 분화능 매력적인 특성과 자기 갱신 할 수있는 기능이다. 1981 년, 제 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 마우스 배아 (2)로부터 분리 하였다. 이 기술은 인간 배아에 적용된 때, 그것은 여러 윤리적 문제에 직면했다. 박사 야마나카와 그의 팀이 마우스 체세포에서 첫 번째 만능 세포를 재 프로그램 할 때 2006 년, 줄기 세포 분야는 가능성을 회복하고 관심은 3 재연했다. 여러 정의 요소를 제공함으로써, 다 능성 줄기 세포가 성공적으로 성숙한 체세포에서 &quot;유도&quot;이었고, 따라서 지명되었다 &quot;(iPSCs)를 유도 만능 줄기 세포.&quot; 2007 년,이 기술은는 ESC의 정확한 특성을 가진 세포를 산출, 인간 세포 4에 적용되었지만 윤리적 논쟁 없음. 이론적으로 유도 만능 줄기CS는 개인 또는 환자로부터 얻은 세포 유형에서 생성 될 수있다. 환자 별 iPSCs는 질병 표현형 및 각 개별 환자의 후생 유전 학적 조건을 시뮬레이션 할 수있는 잠재적 인 도구로 상승하고있다. 유전자 편집 또는 병원성 상태를 반전 할 수있는 다른 방법을 사용하여 환자 별 iPSCs 또한 개인화 된 약 5에서 사용될 수있다. 그들은 6 자동 이식을 더욱 가능하게, 도너와 같은 면역 ID를 가지고 있기 때문에 또한 iPSCs 덜 면역 거부 반응과 연관된다. 따라서, iPSCs 질병 모델링, 약물 검사, 및 재생 치료에서 가장 유망한 플랫폼이되었다. 이러한 혜택, 지속적으로 개발 중에있는 작은 셀 소스에서 시간의 최소 금액에서 순수하고 높은 수율을 줄 수있는 개선 된 프로토콜을 감안할 때. 미래의 애플리케이션에 가장 효율적인 프로토콜을 찾는 하나의 중요한 고려 사항은 일차 전지 유형이다. 초기 IPSC 생성 프로토 대부분의COLS은 원래 IPSC 라인은 피부 섬유 아세포 (4)로부터 유도 된 이후 부착 세포에 최적화되어 있습니다. 그러나, 이들 세포의 분리 및 제조는 노동 집약적이다. 또한, 피부 섬유 아세포의 분리는 광범위한 응용 프로그램의 주요 단점이 될 수 침습 수술 절차가 포함되어 있습니다. 따라서, iPSCs의 추가 사용, 편리한 수집과 셀 소스가 필요합니다. 그것은 오히려 최소 침습 절차 7-9 통해 획득하기 때문에 혈액 이상적인 셀 소스로서 간주된다. 본 연구는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 hiPSCs 발생 프로토콜에 대한 간단한 수정을 개발 하였다. 예컨대 CD34 + 세포와 같은 특정 세포 유형의 어려운 팽창 과정없이 전혈 세포 또는 PBMC를 직렬 야마나카 인자 함유 센다이 바이러스 형질 도입 한 후 원심 분리하여 매트릭스 - 코팅 된 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 이 방법은 요구되는 시간을 단축형질 도입 부유 세포의 부착과 자신에 부착 할 수 없었다 재 프로그래밍 셀의 손실을 감소시켰다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm Dish</td>
			<td>TPP&#160;</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Cornical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Cornical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>7551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBMC Isolation Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9805</td>
			<td>Blood cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC110</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>8697</td>
			<td>Blood cell media supplement (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC Generation and Culture Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E8 Media</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>iPSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express (TrypLE)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReleSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>12604-039</td>
			<td>Colony detaching solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quality Control Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Cover Glass</td>
			<td>Superior</td>
			<td>HSU-0111580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldyhyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BIOSESANG</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>SP-5050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SSEA4 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Oct4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>630801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Klf4 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab151733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>A11037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probe</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass, Coated&#160;</td>
			<td>Hyun Il Lab-Mate</td>
			<td>HMA-S9914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>366919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprypylalcohol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td>
			<td>Thermo Scientfic</td>
			<td>K1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>i-Taq DNA Polymerase</td>
			<td>iNtRON BIOTECH</td>
			<td>25021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 10X TBE Buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15581-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading star</td>
			<td>Dyne Bio</td>
			<td>A750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb (+) DNA ladder marker</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>DM003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0520.1000</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BIOSESANG</td>
			<td>T1027</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Duksan</td>
			<td>1129</td>
			<td>Rinse Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induced pluripotent stem cell generation from blood cells using sendai virus and centrifugation

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 최근의 발전은 성숙한 체세포는 미분화, 만능 상태로 돌아갈 수 있음을 증명했다. 초기 실험은 일반적으로 피부 섬유 아세포로 행해졌 등 각질 세포, 소변 세포, 섬유 아세포, : 지금, 프로그래밍 다양한 성인 체세포의 종류 이루어집니다. 그러나 이는 환자의 섬유 아세포를 수득 침습 수술이 필요했다. 따라서, 혈액 및 소변 세포와 같은 세포 현탁액이 때문에 일차 세포를 얻는 편리함 프로그래밍 이상적으로 간주 하였다. 여기서, 우리는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 IPSC 생성하는 효율적인 프로토콜을보고한다. 새로운 매트릭스 도장 판하여 원심 직렬로 형질 도입 된 PBMC를 도금함으로써,이 프로토콜은 쉽게 IPSC 콜로니를 제공 할 수있다. 이 방법은 또한 제대혈 단핵구 (CBMCs)에 적용 가능하다. 본 연구는 간단하고 효율적인 PROT를 제시PBMC를하고 CBMCs의 재 프로그래밍에 대한 ocol.

이 프로토콜은 혈액에서 분리 된 PBMC를 재 프로그램 할 수있는 간단한 방법을 제시한다. 직렬 원심 도금의 조합을 사용 iPSCs 성공적으로 생성되었다. 이 방법은 iPSCs 단리 또는 특정 세포 유형을 확장하지 않고 전체 혈액 세포의 적은 양으로 생성 될 수있다. 우리는 성공적으로 작은 세포 배양 접시 만 1 × 104 세포에서 iPSCs를 생성합니다. <p class="jove_content" fo:keep-t...

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Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.1K 조회수.  The Catholic University of Korea. We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

연구

발생학

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...