Name: recording gamma band oscillations in pedunculopontine nucleus neurons
Uploaded: 2016-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons at JoVE.com

This work was supported by core facilities of the Center for Translational Neuroscience supported by NIH award P20 GM103425 and P30 GM110702 to Dr. Garcia-Rill. This work was also supported by grants from FONCYT-Agencia Nacional de Promoci&#242;n Cient&#236;fica y Tecnol&#242;gica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 and UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (to Dr. Urbano).

모든 실험 프로토콜은 의료 과학에 대한 아칸소 대학 (프로토콜 번호 # 3593)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 관리 및 실험 동물의 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소와 일치 하였다되었다. 표준 인공 뇌척수액 1. 준비 (ACSF) <ol><li> 주식 용액 A의 제조 <ol><li> 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 1 L 비이커에 증류수 700 ML을 추가합니다. </li><li> 지속적으로 500 ML의 볼륨을 교반하면서, 염화나트륨의 136.75 g, KCl을의 6.99 g, 황산의 2.89 g과의 NaH 2 PO 4의 2.83 g을 추가합니다. </li><li> 희석 한 후 L. 최종 부피에 도달하기 위해 더 많은 증류수를 추가하고, 각 화합물의 최종 농도는 117 mM의 염화나트륨, 4.69 mM의 KCl을이고, 1.2 mm의 4 황산, 1.18 밀리미터의 NaH 2 PO 4. </li><li> 최대 2 주 동안 4 ° C에서 냉장 유지. </li></ol></li><li> 스톡 용액 B의 제조 <ol><li> 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 1L 비커에 증류수 700 ML을 추가합니다. </li><li> 연속적으로 500 ㎖를 교반하면서, D- 글루코스 및 41.45 g의 NaHCO3 41.84 g을 추가한다. </li><li> 희석 한 후 L. 최종 부피에 도달하기 위해 더 많은 증류수를 추가하고, 각 화합물의 최종 농도는 11.5 mM의 D 글루코오스 24.9 mM의 NaHCO3을한다. </li><li> 최대 2 주 동안 4 ° C에서 냉장 유지. </li><li> 각 실험 혼합 전에 50 50 ㎖ 스톡 B와 스톡 (A)의 용액과 연속적 carbogen (- 5 % CO 2 혼합물 95 % O 2)와 함께 산소로하면서 최종 농도 ACSF 용액을 수득하고 RT 떠날 증류수 1 L에 가져다 적어도 30 분. 각 실험의 시작에서 최종 농도 ACSF 준비하고 하루의 끝에 버린다. </li></ol></li></ol> 자당 인공 뇌척수액 2. 준비(자당 - ACSF) <ol><li> 원액 C의 제조 <ol><li> 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 1 L 비이커에 증류수 700 ML을 추가합니다. </li><li> 계속해서, 증류수 500 mL를 교반하면서, 수 크로스 240 ​​g,의 NaHCO3 6.55 g, 0.671 g의 KCl,의 MgCl 2 4.88 g, CaCl2를 0.22 g 및 아스코르브 산 0.21 g을 추가한다. </li><li> 희석 한 후 1 L. 최종 부피에 도달 할 더 많은 증류수를 추가하고, 각 화합물의 최종 농도는 701.1 밀리미터 크로스, 78 mM의 NaHCO3을 9 mM의 KCl을 24 mM의의 MgCl 2, 150 mM의 CaCl2를 1.2 mM의 아스코르브 산이다 . </li><li> 최대 일주일 4 ° C에서 원액의 C를 유지합니다. </li><li> 각 실험 혼합 전에 연속적 carbogen (95 % O 2~5%의 CO 2 혼합물)와 함께 산소로하면서 최종 농도에서 자당 ACSF 용액을 수득하고 RT 떠날 증류수 600 mL를 스톡 C 50 ml를 300 ml의 적어도 30 분. </li></oL&gt; </li></ol> 3. 슬라이스 준비 <ol><li> carbogen와 함께 산소로 동안 얼음에 100 ml의 자당 ACSF 솔루션 깨끗한 비커를 넣고 0.1 M NaOH 용액 몇 방울을 추가하는 동안 pH 미터를 사용하여 7.4에서 pH를 고정 (때의 pH &lt;7.4) 0.1 M HCl 용액 ( pH가&gt; 7.4). </li><li> 크로스 - ACSF와 vibratome의 커팅 챔버를 입력하고 산소를. 절단 챔버에 결합 된 글리세롤 기반 냉동 시스템의 전원을 켜고은 0으로 냉각 할 수 있도록 15 분을 기다립니다 - 4 ° C를. </li><li> (&lt;50 μl의 최종 볼륨을 사용하여 70 ㎎ / ㎏, IP) 케타민과 (성인 초과 임신 흰쥐에서 12에 9 세) 쥐의 새끼를 마취. 강아지가 진정되면, 두 배는 꼬리 핀치 반사가없는 확인합니다. </li><li> 강아지 목을 벨. <ol><li> 탄소강 메스 블레이드를 사용하여 백업하고, 집게를 사용하여 피부면을 끌어 전방으로부터 길이 방향으로 두피를 잘라. SC를 움직이는 뇌를 덮고있는 뼈를 잘라측면 issors 완전히 뇌를 노출 제거합니다. </li><li> 그런 다음, 빠르게 (처음에는 부드럽게 대부분의 꼬리 부분을 향해 가장 주동이에서 뇌를 밀어하기 위해 후각 망울 아래에 위치) 주걱을 사용하여 두뇌를 제거합니다. 조심스럽게 얼음 냉각 산소 크로스 - 인공 뇌척수액 (자당 ACSF)으로 뇌를 밀어 넣습니다. </li></ol></li><li> (반구의 약 삼분의 제거) 오른쪽 반구에 시상 컷을 확인하고 자기 적를 포함 시상 400 μm의 섹션을 잘라 vibroslicer의 절단 실에 고정하는 금속 디스크에 뇌의 손질 측 접착제 pedunculopontine 핵 (PPN). 전체 셀 패치 클램프 녹음하기 전에 45 분 동안 실온에서 PPN 슬라이스를 유지합니다. </li></ol> PPN 조각 4. 녹음 감마 밴드 진동 <ol><li> 칼륨 글루코 네이트 세포 내 용액의 조제 (하이 K + 솔루션) <ol><li> 에 배치증류수 10 ml의 깨끗한 비커를 아이스. K + -gluconate, 90.68 mg의 크레아틴 인산 디 트리스 소금, 47.66 mg을 HEPES, 1.5 mg을 EGTA, 40.58 mg의 마그네슘 2 + -ATP, 4 mg의 나트륨 + 2 -GTP을 : 지속적으로 추가 교반하면서. </li><li> KOH 7.3 (증류수 100 밀리미터)로 산도를 조정합니다. 20 ㎖의 최종 부피에 도달 증류수를 추가한다. 이 290mOsm - 필요한 경우, 280로 자당 (증류수 100 밀리미터)와 삼투압을 조절합니다. 희석 한 후, 각 화합물의 최종 농도는 124 mM의 K + -gluconate 인 10 밀리미터 크레아틴 인산 디 트리스 염, 10 mM의 HEPES, 0.2 mM의 EGTA, 4mM의 Mg를 2 + -ATP 및 0.3 mM의 나트륨 + 2 -GTP. </li><li> 나누어지는 세포를 1 ml의 튜브 솔루션 및 동결 -20 ° C에서. 하루에 한 나누어지는을 사용하여 실험하는 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 전체 셀 패치 클램프 녹음 <ol><li> 침지 챔버 슬라이스를 넣고 산소로 (1.5 ㎖ / 분)를 관류(95 % O 2 - CO 2 5 %) 다음 수용체 길항제 함유 ACSF : 선택적 NMDA 수용체 길항제 2- 아미노 -5- phosphonovaleric 산 (APV, 40 μM)를 경쟁적 AMPA / 발생한 kainate 글루타메이트 수용체 길항제 6- 시아 노 -7- 퀴녹 살린 -2,3- 디온 (CNQX, 10μM) 글리신 수용체 길항제 스트 리키 닌 (STR 10 μM) 비 GABA 수용체 길항제 gabazine (GBZ 10 μM) 및 나트륨 채널 차단제 테트로도톡신 (TTX, 3μM) 참고 : 결과와 수치, 이러한 길항제가 종합적으로 시냅스 차단제 또는 스케쥴링이라고합니다. </li><li> 기록 패치 피펫 채우기; A를 상업적으로 이용 가능한 패치 피펫 필러를 사용하여 세포 내 높은 K + 솔루션 (저항 2-7 MΩ 1.0 mm 외부 직경 0.6 mm 내경의 일반 시판 두꺼운 벽 붕규산 유리 모세관에서 만든) 솔루션 필터. 그 앰프의 홀더에 피펫을 삽입합니다. 작은 POS 적용세 방향 밸브에 접속 된 실리콘 튜브를 사용하여 피펫 홀더에 연결된 1 mL를 주사기를 사용하여 압력을 직관적. 패치 클램프 증폭기에 피펫 홀더의 뒷면을 연결합니다. </li><li> 근적외선 미분 간섭 대비 광학에 결합 된 4 배 목표를 사용하여 PPN 핵 근처의 기계적 미세 조작기를 사용하여 기록 피펫을 이동합니다. 참고 : PPN 핵이 우수한 소뇌 꽃자루에 조각 등쪽에서 관찰 할 수있다 (SCP, 축삭의 두꺼운 번들로 관찰). 녹화 피펫은 PPN에 위치 하였다는 꽃자루의 후방 끝에 지느러미 바로 위치한 compacta을 갈 거예요. </li><li> 40 배의 물에 침지 렌즈를 사용하여 시각 동안 PPN 신경 세포와 접촉하는 기록 피펫을 가지고, 그리고 신속하게 셀과 시일을 형성하는 음의 흡입을 적용한다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 음의 흡입 동안 피펫 저항을 모니터링 전압 클램프 인감 소프트웨어를 사용합니다. <ol><li> 음수의uction 서서히 증가하고, 피펫 끝으로 패치 - 클램프 모니터 판독 저항 값이 80에 도달 - 급속 MV를 -50 부압을 해제 유지 전위 변경을 100 옴. 계속 신경 세포의 막과의 전기 접속은 전체 셀 구성에서는 달성 파열까지 네거티브 흡인 적용 시작. </li><li> 전압 클램프 시일 소프트웨어로 측정 접속 저항 값이 10 옴 이상이라면, 더 적은 양에서 음의 흡입을 계속인가. </li></ol></li><li> 용량 보상 전압 클램프 모드 및 직렬 저항 (즉, 느린 및 빠른 과도 현상은 전지의 멤브레인 파열 후에 관찰). 다리 값을 보상 빠르게 전류 클램프 녹음 모드를 전환하고 (예를 들어, 앰프 노브를 이동하거나하게 컴퓨터의 마우스를 사용하여 자동 보정 메뉴를 클릭). <ol><li> PPN 신경 세포의 연속 휴식 모니터합니다 막 잠재력 유를 기록중인제조 업체의 프로토콜을 노래. 탈분극 또는 hyperpolarizing 값으로 막 잠재적 인 변화를 쉬고 경우, 최적 -50 MV 최종 값을 유지하기 위해 직류 (100 pA에까지) 소량을 사용합니다. 주 : -48 MV의 안정적인 휴식 막 잠재력 (RMP) 이상 과분극 (즉, RMP &lt;-48 MV) 만 PPN 뉴런을 유지합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

PPN 뉴런은 그들이 깨어 또는 REM 수면 동안,하지만 서파 수면 2,3,5,13-17 중에있는 동물의 생체 내 녹음하는 동안 베타 / 감마 대역 주파수에서 활동 전위를 해고 할 수 있도록 고유 특성이 있습니다. PPN은 EEG 녹음 중에 감마 주파수를 감소 이외의 저자는 더 전방 수준에서 그 뇌간 transections을 보여왔다. 뇌간의 병변이 핵의 위치에 후부 그러나, PPN의 직접적인 자극은 EEG 2,3,5,18-21에</...

PPN 핵은 해부학 꼬리 중뇌 피개에 포함되어 있습니다. PPN은 RAS (1)의 핵심 구성 요소입니다. PPN은 (, 깨어있는, REM 수면 예) 2 행동 활성화 상태의 유지 보수에 참여하고 있습니다. 쥐에서 양측 PPN 병변이 감소 또는 REM 수면 (4)를 제거하면서 대뇌 피질 EEG 3 - (40 Hz에서 20) 생체 내에서 PPN의 전기 자극은 빠른 진동을 유발. PPN 뉴런의 대부분이 베타 / 감마 대역 주파수에서 활동 전위 발생하는 동안 (20-80 Hz에서) 일부 신경 세포가 자연 발화의 저렴한 요금을 제시 (&lt;10 Hz에서) 5. 또한, PPN은 동기 및 주의력 6과 같은 동작의 다른 측면에 관여하는 것으로 보인다. 직접 고주파 (40-60 Hz에서) decerebrate 동물 PPN 핵의 7 전기 자극은 운동을 홍보 할 수 있습니다. 최근에는 깊은 뇌 자극 (DBS)은 PPN의 아프로 앓고있는 환자를 치료하는데 사용되어왔다파킨슨 병 (PD) (8) 등의 보용 결핍과 관련된 질환 m. 이전 보고서는 사각형 전류 펄스 (9)를 사용하여 탈 분극 때 거의 모든 PPN 뉴런 감마 대역 주파수에서 활동 전위를 해고 할 수 있음을 보여 주었다. 때문에 MV까지 또는 -25에서 평방 펄스 depolarizations 동안 전압 - 문이 칼륨 채널의 급격한 활성화. 결과적으로, 더 강력한 감마 진동은 테트로도톡신 (10)을 사용하여 활동 전위의 생성을 차단 한 후에는 관찰되지 않았다. 이러한 문제를 우회하기위한 노력의 일환으로, 한 - 긴 현재의 램프를 탈분극 2 초를 사용 하였다. 부분적 전압 게이트 칼륨 채널을 비활성화하는 동안 경사로 점차 0까지 MV 값을 쉬고에서 막전위가 탈 분극. 삭제 감마 밴드 진동 막 10 (-25 MV 및 MV -0 사이 IE) 문턱 칼슘 통로의 전압 의존성 윈도우 내에 분명 하였다. 결론적으로, 감마 밴드 activi타이 PPN 뉴런 9에서 관찰되었고, 모두가 P / Q- 및 N- 유형 전압 관문 칼슘 채널은 PPN 10 감마 대역 진동을 생성하기 위해 활성화 될 필요가있다. 일련의 연구는 PPN 뉴런 높은 임계 칼슘 통로의 위치를​​ 결정 하였다. 염료의 조합을 주입 비율 적 형광 이미징 전류 램프 (11)를 사용하여 다른 탈 분극시 수지상 활성화되는 전압 게이트 된 칼슘 채널을 통해 칼슘 과도 현상을 보였다. PPN 뉴런의 고유 특성 따라서 RAS 및 thalamocortical 루프 사이에 고주파 진동 신경 세포 활성을 유도 일어나고 REM 수면시에 이들 세포의 동시 활성화를 허용하도록 제안되어왔다. 이러한 장기에 도달 상호 작용은 안정적으로 지속적으로 12 일에 우리 주변의 세계를 평가 할 수있는 뇌 상태를 지원하는 것으로 간주됩니다. 여기서는 실험을 설명알 필요 조건 생성 및 시험 관내에서 세포 PPN 감마 밴드 발진을 유지한다. 이 프로토콜은 이전에 설명하지 않은, 다른 뇌 영역에서 감마 밴드 활동을 매개 고유 막 성질을 연구하는 그룹의 번호를 도울 것이다. 또한, 현재 단계에서는 감마 대역 활동이 이들 세포에서 생성 될 수있는 잘못된 결론을 초래할 수도있다.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>C&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;, molecular weight = 342.30</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 84.01</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl, molecular weight = 74.55</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =&amp;nbsp; 203.30</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =147.02</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight = 180.16</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight =176.12</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td>NaCl, molecular weight =&amp;nbsp; 58.44</td></tr><tr><td>Potassium Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;KO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 234.25</td></tr><tr><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td>C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P &amp;middot; 2C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 453.38</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>C&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;S, molecular weight = 238.30</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;]&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 380.40</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate magnesium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;13&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xMg2+, molecular weight = 507.18</td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xNa+, molecular weight = 523.18</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin citrate</td><td>Alomone Labs</td><td>T-550</td><td>C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;17&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;, molecular weight = 319.27</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P, molecular weight = 197.13</td></tr><tr><td>CNQX disodium salt hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>C&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; xH2O, molecular weight = 276.12</td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>C&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 334.41</td></tr><tr><td>Mecamylamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9020</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;N &amp;middot; HCl, molecular weight = 203.75</td></tr><tr><td>Gabazine (SR-95531)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S106</td><td>C&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;BrN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 368.23</td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Mylan</td><td>67457-001-00</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>Pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>&amp;nbsp;Leica VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeration system</td><td>Vibratome Instruments</td><td>900R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

recording gamma band oscillations in pedunculopontine nucleus neurons

(; CL / PF 핵 예를 들어, centrolateral / parafascicular)을 PPN에서 시냅틱 efferents는 여러 intralaminar 시상 영역의 신경 세포의 활성을 조절하는 것으로 알려져있다. PPN 또는 생체 내에서 CL / PF 핵 하나의 활성화는 동물의 흥분과 피질 뇌파 (EEG)의 감마 대역 활동의 증가를 유도하는 것으로 설명되었다. 망상 활성화 시스템에서 감마 대역 진동의 생성을위한 세포 메커니즘 (RAS) 뉴런 다른 뇌 핵 감마 대역 진동을 생성하기 위해 발견 된 것과 동일하다. (9에서 시상 조각에서 - 이십오일 된 래트) PPN 뉴런 전류 클램프 녹음 중에 사각 단계 탈분극의 사용은 급속 -25 MV 이상의 탈 분극되는 PPN 뉴런 방지 전위 의존성 칼륨 채널이 활성화. 1 주입 - 긴 현재의 램프를 탈분극 2 초 점차 PPN 막 잠재적 인 입술을 탈 분극팅은 0 MV으로 값. 그러나, 주사 펄스 탈분극 사각형 램프에 의해 발생되는 진동에 비해 진폭이 작게 나타났다 막전위 감마 대역 진동을 생성. 모든 실험은 전압 게이트 된 나트륨 채널 및 고속 시냅스 수용체 차단제의 존재 하에서 수행되었다. 높은 임계 전압 의존성 칼슘 채널의 활성이 PPN 뉴런 감마 대역 진동 활동의 기초가 있다고 밝혀졌다. 구체적인 방법 론적 및 약리학 적 개입을 유도하고 체외에서 PPN에게 서브 쓰레 숄드 감마 밴드 진동을 유지하는 데 필요한 도구를 제공, 여기에 설명되어 있습니다.

초기 감마 진동은 사각형 전류 펄스를 이용하여 유발시켰다. 시냅스 차단제 TTX의 존재 PPN 뉴런 전류 클램프 기록을 연속적 쉬고 막 전위는 -50 ~ MV (도 1a)에서 안정하게 유지되었다는 것을 보장하도록 모니터링 하였다. 두 번째 긴 사각형 전류 펄스는 200 Pa 이상 600 펜실베니아 (도 1a)에 그 진폭을 크게, 기록 피펫을 통해 패치 클램프 증폭기에 의해 ...

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Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

pedunculopontine 핵 (PPN)은 뇌간에 위치하고 있으며 그 뉴런은 최대한 깨어 및 빠른 안구 운동 (REM) 수면 뇌 상태 동안 활성화됩니다. 이 작품은 PPN 뉴런 시험관 감마 밴드 서브 쓰레 숄드 막 진동에 기록 할 수있는 실험 방법을 설명합니다.

Pedunculopontine 핵 뉴런에서 녹음 감마 밴드 진동

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K 조회수.  University of Buenos Aires.  pedunculopontine 핵 (PPN)은 뇌간에 위치하고 있으며 그 뉴런은 최대한 깨어 및 빠른 안구 운동 (REM) 수면 뇌 상태 동안 활성화됩니다. 이 작품은 PPN 뉴런 시험관 감마 밴드 서브 쓰레 숄드 막 진동에 기록 할 수있는 실험 방법을 설명합니다. 

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

연구

신경과학

Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable electroencephalography (EEG) radiotelemetry or tether system approaches. Pharmacologically, hippocampal theta is heterogeneous (see dualistic theory) and can be differentiated into type I and type II theta. These individual EEG subtypes are related to specific cognitive and behavioral states, such as arousal, exploration, learning and memory, higher integrative functions, etc. In neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s, structural and functional alterations of the septohippocampal system can result in impaired theta activity/oscillations. A standard quantitative analysis of the hippocampal EEG includes a Fast-Fourier-Transformation (FFT)-based frequency analysis. However, this procedure does not provide details about theta activity in general and highly-organized theta oscillations in particular. In order to obtain detailed information on highly-organized theta oscillations in the hippocampus, we have developed a new analytical approach. This approach allows for time- and cost-effective quantification of the duration of highly-organized theta oscillations and their frequency characteristics.

Theta activity in the hippocampus is related to specific cognitive and behavioral stages. Here, we describe an analytical method to detect highly-organized theta oscillations within the hippocampus using a time-frequency (i.e., wavelet analysis)-based approach.

쥐 EEG에서 매우 조직 된 세타 진동의 자동 감지

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable ...

행동분석학

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. Neurons typically receive multiple excitatory and inhibitory afferent and/or efferent inputs that integrate with each other, and the ultimate measured response properties of the neuron are driven by the neural integrations of these inputs. To study information processing in neural systems, it is necessary to understand the various inputs to a neuron or neural system, and the specific properties of these inputs. A powerful and technically relatively simple method to assess the functional role of certain inputs that a given neuron is receiving is to dynamically and reversibly suppress or eliminate these inputs, and measure the changes in the neuron's output caused by this manipulation. This can be accomplished by pharmacologically altering the neuron's immediate environment with piggy-back multibarrel electrodes. These electrodes consist of a single barrel recording electrode and a multibarrel drug electrode that can carry up to 4 different synaptic agonists or antagonists. The pharmacological agents can be applied iontophoretically at desired times during the experiment, allowing for time-controlled delivery and reversible reconfiguration of synaptic inputs. As such, pharmacological manipulation of the microenvironment represents a powerful and unparalleled method to test specific hypotheses about neural circuit function.
Here we describe how piggy-back electrodes are manufactured, and how they are used during in vivo experiments. The piggy-back system allows an investigator to combine a single barrel recording electrode of any arbitrary property (resistance, tip size, shape etc) with a multibarrel drug electrode. This is a major advantage over standard multi-electrodes, where all barrels have more or less similar shapes and properties. Multibarrel electrodes were first introduced over 40 years ago 1-3, and have undergone a number of design improvements 2,3 until the piggy-back type was introduced in the 1980s 4,5. Here we present a set of important improvements in the laboratory production of piggy-back electrodes that allow for deep brain penetration in intact in vivo animal preparations due to a relatively thin electrode shaft that causes minimal damage. Furthermore these electrodes are characterized by low noise recordings, and have low resistance drug barrels for very effective iontophoresis of the desired pharmacological agents.

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontophoresis of neural agonists and antagonists during extracellular in vivo recordings is a powerful way to manipulate a neuron&#x2019;s microenvironment. These manipulations can most easily be done via piggy-back multibarrel electrodes. Here we describe how to manufacture them and use them during auditory recordings.

에 대한 Multibarrel 전극을 제조 및 꽃돼지 - 다시 사용<em&gt; 생체에</em신경 응답&gt; 약리 노는

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A protocol is provided to generate a model for studying CA1 &#947; oscillations (20 - 80 Hz). These &#947; oscillations are stable for at least 30 min&#160;and depend upon excitatory and inhibitory synaptic activity in addition to activation of pacemaker currents. Tetanically stimulated oscillations have a number of reproducible and easily quantifiable characteristics including spike count, oscillation duration, latency and frequency that report upon the network state. The advantages of the electrically stimulated oscillations include stability, reproducibility and episodic acquisition enabling robust characterization of network function. This model of CA1 &#947; oscillations can be used to study cellular mechanisms and to systematically investigate how neuronal network activity is altered in disease and by drugs. Disease state pharmacology can be readily incorporated by the use of brain slices from genetically modified or interventional animal models to enable selection of drugs that specifically target disease mechanisms.

Oscillations are fundamental network properties and are modulated by disease and drugs. Studying brain-slice oscillations allows characterization of isolated networks under controlled conditions. Protocols are provided for the preparation of acute brain slices for evoking CA1 &#947; oscillations.

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝<em&gt; 체외에서</em&gt; : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Recording Gamma Band Oscillations From Pedunculopontine Nucleus Neurons in a Brain Slice

Source: Urbano, F. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54685">Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the method to record gamma-band oscillations in PPN neurons. Using a sagittal brain section with synaptic blockers in aCSF, it employs positive current pulses via a patch pipette to open calcium channels, inducing crucial subthreshold activity for wakefulness.

뇌 절편에서 pedunculopontine 핵 뉴런의 감마 대역 진동 기록

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Pedunculopontine 핵 뉴런에서 녹음 감마 밴드 진동

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

쥐 EEG에서 매우 조직 된 세타 진동의 자동 감지

에 대한 Multibarrel 전극을 제조 및 꽃돼지 - 다시 사용

파상풍의 자극에 의해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝

심각한

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

뇌 절편에서 pedunculopontine 핵 뉴런의 감마 대역 진동 기록

Pedunculopontine 핵 뉴런에서 녹음 감마 밴드 진동

요약

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운동에 의해 변조된 뉴런의 생리, 형태학의 및 Neurochemical 특성화

쥐 EEG에서 매우 조직 된 세타 진동의 자동 감지

에 대한 Multibarrel 전극을 제조 및 꽃돼지 - 다시 사용

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝

심각한

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

뇌 절편에서 pedunculopontine 핵 뉴런의 감마 대역 진동 기록

파상풍의 자극에 의해 지역의 CA1 γ 진동의 발생