여기서 우리는 망막 비네큐레이트 및 피질 비야마인분해성 시냅스 기능의 측면 발현 핵 및 전기 생리학적 조사를 포함하는 급성 뇌 슬라이스의 제조를 위한 프로토콜을 제시한다. 망막 신경절 세포 축삭은 피질 입력에서 멀리 떨어진 측면 조분 핵을 입력합니다. 이를 통해 매우 다른 기능성 특성을 가진 망막 생식기 및 피질 비네큐레이트 시냅스의 별도의 자극을 허용합니다.
이 절차를 시작하려면 해부 용액의 100 밀리리터로 채워진 두 개의 슬라이스 챔버와 다른 하나는 100 밀리리터의 레코딩 솔루션을 준비합니다. 두 개의 비커를 섭씨 37도의 수조에 넣고 해부 전에 적어도 15분 동안 카보젠으로 용액을 거품을 낸다. 다음으로 플라스틱 비커에 얼음-차가운 해부 용액 250밀리리터를 채우고, 사용하기 전에 적어도 15분 동안 카보젠으로 거품을 낸다.
그런 다음 플라스틱 페트리 접시에 뇌 해부를 위한 차가운 해부 용액으로 채웁니다. 페트리 접시 뚜껑에 필터 용지 를 놓고 소량의 해부 용액으로 채웁니다. 그 후 진동의 해부 챔버를 식히십시오.
코달에서 비강으로 머리의 피부를 잘라, 두개골을 노출손가락으로 열어 유지. 전뇌를 얻으려면 먼저 후방 / 전방 미드 라인을 따라 두개골을 잘라냅니다. 그런 다음 관상 봉합사와 람도이드 봉합사를 통해 두 번 더 잘라.
관상 봉합사와 람도이드 봉합사 사이의 두개골을 제거하여 뇌관에 노출시다. 후각 전구를 자르고, 미세 블레이드로 중뇌에서 전뇌를 분리합니다. 얇은 주걱으로 두개골에서 뇌를 제거하고 페트리 접시의 뚜껑에 필터 용지에 놓습니다.
뇌 슬라이스의 등지 측삭 비석 핵에 대한 감각 및 피질 입력의 무결성을 보존하려면 두 반구를 3~5도 각도로 절단하여 분리합니다. 그 후 필터 용지에 배치하여 두 반구의 내측 측평면을 건조시다. 그런 다음 수평 평면에서 10~25도 각도로 절단 단계에 붙입니다.
스테이지를 금속 버퍼 트레이의 중앙에 놓고 나머지 얼음 냉분단 용액을 버퍼 트레이에 부드럽게 붓습니다. 너무 열심히 붓는 것은 붙여 넣은 뇌를 제거 할 수 있기 때문에 신중하게이 단계를 수행합니다. 다음으로 버퍼 트레이를 얼음으로 채워진 트레이에 보관하여 해부 중에 저온을 유지합니다.
초당 0.1 밀리미터의 속도로 면도날과 1밀리미터의 진폭으로 250 마이크로미터 슬라이스. 슬라이스를 산소 분약 용액으로 채워진 지주 실로 약 30분 동안 34도의 양을 옮은 다음, 30분 동안 기록 용액에서 슬라이스를 회수할 수 있도록 합니다. 복구 후, 수조에서 슬라이스 홀딩 챔버를 제거하고 실험에 사용될 때까지 실온에서 조각을 유지합니다.
이 절차에서, 보로실리케이트 유리 모세 혈관과 필라멘트 풀러를 사용하여 녹음 파이펫을 당깁니다. 다음으로 동일한 프로토콜을 사용하여 자극하는 파이펫을 당기지만 지름을 높이기 위해 당긴 후 팁을 약간 부수습니다. 그 후 기록 파이펫을 세포내 용액및 바이오시틴으로 채우고 자극하는 파이펫을 레코딩 용액으로 채웁니다.
그런 다음 조각을 기록 챔버에 놓고 실온에서 산소로 된 레코딩 솔루션으로 지속적으로 침투하십시오. IR-DIC 비디오 현미경이 장착된 직립 현미경으로 슬라이스를 시각화합니다. 모든 슬라이스를 확인하고 그대로 광학 기관을 표시하는 조각을 선택합니다.
레코딩 파이펫으로 셀을 패치하기 전에 자극 파이펫을 슬라이스에 놓습니다. 망막 성 합성 시냅스를 조사하기 위해 망막 신경절 세포에서 축산 섬유가 번들되는 광도에 자극 파이펫을 직접 배치합니다. 피질 비대성 시냅스를 분석하려면 자극성 전극을 등갈 측삭 비석 핵에 인접한 핵 망상 탈라미에 놓는다.
레코딩 파이펫이 레코딩 솔루션에 침지되면 파이펫 저항을 모니터링하기 위해 5밀리볼트 단계를 적용합니다. 보유 잠재력을 0 밀리볼트로 설정하고 보류 전류가 0 피코팜이 되도록 오프셋 잠재력을 취소합니다. 양압을 가하는 동안 기록 파이펫으로 셀에 접근합니다.
파이펫이 세포막과 직접 접촉할 때 양압을 방출하고 보유 잠재력을 마이너스 70 밀리볼트로 설정합니다. 그런 다음 세포막이 유리 파이펫에 부착되어 기가옴 씰이 형성되도록 약간의 음압을 가한다. 파이펫 커패시턴스를 보정하고 음압 펄스를 적용하여 셀을 엽니다.
시냅스 기능을 조사하려면 자극 파이펫을 통해 0.1밀리초 전류 펄스를 적용하십시오. 5밀리볼트 스텝을 적용하여 시리즈 저항을 지속적으로 모니터링합니다. 계열 저항은 5밀리볼트를 불러일으킨 전류의 피크 진폭으로 나누어 추정할 수 있다.
분석을 위해 20메가옴보다 작은 계열 저항을 가진 셀만 사용하십시오. 생생물시틴 라벨링의 경우, 바이오시틴이 황실으로 확산되도록 최소 5분 동안 전세포 구성을 유지한다. 녹음 후 소마가 파괴되지 않도록 셀에서 파이펫을 부드럽게 제거합니다.
24웰 세포 배양판을 준비한다. 각각 4%의 PFA 300 마이크로리터로 잘 채웁니다. 기록할 조각과 접촉할 PFA를 오염시키지 않도록 주의하십시오.
레코딩 챔버에서 고무 파이펫이 있는 PFA 함유 플레이트로 슬라이스를 옮기고 밤새 수정합니다. 다음 날, PBS로 PFA를 교체합니다. 향후 처리를 위해 PBS에서 슬라이스를 섭씨 4도로 유지하십시오.
세포를 염색하려면 신선한 PBS로 슬라이스를 세 번 씻으시다. 궤도 셰이커의 실온에서 2시간 동안 차단 용액의 슬라이스를 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 그런 다음 차단 용액을 폐기하고, 궤도 셰이커에서 밤새 섭씨 4도에서 차단 용액에 희석 된 스트렙타비딘 알렉사 568으로 슬라이스를 배양합니다.
다음 날, 항체 용액을 버리고, 궤도 셰이커의 실온에서 각각 10 분 동안 PBS로 슬라이스를 세 번 세척하십시오. 그런 다음 장착하기 전에 수돗물로 슬라이스를 씻으릅니다. 한 개의 마우스에서 슬라이스를 하나의 유리 슬라이드에 놓습니다.
염색된 셀이 슬라이스의 상부 표면에 있는지 확인합니다. 조각으로 물을 흡수한 다음 슬라이스를 그대로 두고 약 15분간 건조시합니다. 그 후 각 슬라이스에 두 방울의 마운팅 매체를 적용하고 기포를 생성하지 않고 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.
공초점 현미경으로 본 후 라벨이 부착된 슬라이스를 섭씨 4도에 저장합니다. 이 IR-DIC 이미지는 패치 파이펫의 끝을 가진 등쪽 측면 조분 핵 릴레이 뉴런의 소마를 보여줍니다. Biocytin 염색은 우리가 기록한 신경의 보기를 얻는 것을 가능하게 합니다.
양극성 형태학이있는 인터뉴런과는 달리 릴레이 뉴런에는 3 개 이상의 기본 원더라이트를 포함하는 다극성 수지상 식소가 있습니다. 생시틴 표지 릴레이 뉴런의 3차원 재구성이 생성되어 복사 대칭 수지상 아키텍처를 보여줍니다. 망막 생식기 입력을 보존하고 동일한 뇌 조각에 피질 비야성 입력이 이 프로토콜에서 가장 중요합니다.
이 절차에 따라, 우리는, 예를 들면, 또한 등쪽 측측 비질 핵 뉴런에 핵 망상 탈라미에서 억제제 입력을 조사할 수 있습니다. PFA는 위험하기 때문에 PFA로 뇌 조각을 고정 할 때 장갑을 착용해야합니다.
