The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

이 프로토콜은 과학 기관 동물 관리 및 사용위원회 카네기 연구소 (프로토콜 없음. 139)에 의해 승인되었습니다. 1. 동물 준비 <ol><li> 14 시간에 28 ° C에서 성인과 애벌레 유지 : 10 시간 빛 : 어두운주기를. 쉘 무료 아테 미아 (디 캡슐 레이트, 비 부화, 14 DPF에서 시작) 및 상업 micropellets으로 하루에 두 번 성인 피드. </li><li> 이 프로토콜은 AB 배경의 자연 산란에 의해 수집 6-7 DPF 유충의 사용에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 다른 연령대와 배경의 유충에 대한 수정 될 수 있습니다. 외래 음식을 이전 6 DPF를 제공하지 않습니다. </li><li> 배아 매체 Tricaine (EM)와 유충 실온 (RT) (4 mg을 100 ㎖의 EM 당 / ㎖ Tricaine 4.2 ㎖) 마취. </li></ol> 지질이 풍부한 달걀 노른자 피드 2. 준비 <ol><li> 준비하고 닭고기 달걀 노른자를 저장합니다. 12 닭고기 달걀의 노른자와 흰색을 구분합니다. , 나누어지는 1 ml의 1.5에 노른자를 풀1 년에 -80 ° C 최대의 ML의 튜브, 저장 (12 노른자는 ~ 80 분취를 만들 것입니다). 백인, 저장 수영장, 지질 가난한, 단백질이 풍부한 사료로 사용합니다. </li><li> 원한다면 준비 형광 리피드 유사체 (들) 난황 사료에 첨가한다. <ol><li> 제조업체의 지침에 따라, 불투명 유리 튜브에 나누어지는 (다음 참고 용매를 논의 참조) / μL 0.1 μg의 100 % 에탄올 또는 100 % 클로로포름 구입, 분말 형광 지질 아날로그를 일시 중단 파라 필름으로 밀봉, 저장. 때문에 유기 용매의 빠른 증발에 장기 저장을 위해 ~ 400 μL 이하 분취 볼륨을 사용하지 않는다. 주 : 지질 아날로그 에탄올에 현탁하는 경우는, 클로로포름보다 N 2하에 빠르게 건조되므로 지질 아날로그 다량 사용한다. 지질 아날로그 에탄올에 현탁 경우 단계 2.2.4에서 리포솜 피드에 추가하기 전에 건조시키고, 재현 탁 될 수 없지만, 전체 에탄올 농도는 0을 초과하지 않아야한다.리포좀 피드의 1 % 에탄올 잠재적으로 혼란 생리 학적 효과를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 형광 지방산 유사체의 경우 : EM 20 mL의 5 % 난황 에멀젼의 총 부피를 준비한다. 그 라이브 공 초점 이미지 및 음식 섭취 분석 또는 1 μg의 / ㎖ 6.4 μM 4,4- 디 플루오로 -4- 보라 -3a, 4a- 디아 자 - S - 인다 센의 최종 농도 (BODIPY C 16)와 5 ml의 분취 량을 준비 입체 영상에 대한 BODIPY C (12). 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 형광 지질 아날로그 원하는 금액을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조. </li><li> 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 5 μL의 100 % 에탄올에 재현 탁을 95 μL의 EM을 추가하고, 잘 혼합한다. 참고 : 혼합물이 균질 나타납니다; 컬러 지질 튜브의 측면에 유지되거나 액체가 덩어리 진 나타나면 지질 완전히 용해 에탄올 등을 필요로하지 않았다. 이리저리 튜브를 보호얼음 m 빛과 상점. </li><li> 형광 콜레스테롤 아날로그의 경우 : 라이브 영상 연구를위한 5 ml의 0.5 % 달걀 노른자 에멀젼 2.4 μg의 / ㎖ 콜레스테롤의 최종 농도를 준비합니다. 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 콜레스테롤의 정량을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조. </li><li> 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 정제 H 2 O. RT에서 1 %의 지방산이없는 BSA 85 μL와 혼합하여 RT 100 % 에탄올 15 μL에 재현 탁 빛으로부터 튜브를 보호하고 얼음에 저장합니다. </li></ol></li><li> 계란 노른자 리포좀 피드를 준비합니다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 EM에 달걀 노른자의 해동 나누어지는을 추가합니다. 1-2 분 동안 희석 된 난황 혼합물을 와동; 혼합물이 균질 한 에멀젼으로 나타납니다. </li><li> 새로운, 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 단백질 대기업을 제거하고 수집하는 좋은 메쉬 스트레이너를 통해 혼합물을 붓고. </li><li> 펄스 SONICA리포좀을 만들 RT에서 :; 한 네 번째 인치 테이퍼 마이크로 팁과 (6 W 출력 강도 각 세트 사이에 5 ~ 10 초 일시 중지 5 회 (5 × 1 초, 1 초 오프)) 계란 혼합물을 테. 초음파기 전원 설정 종속 기기이며, 따라서 각각의 악기와 마이크로 팁에 대한 최적화를 필요로한다. 주 : 계속 사용할 때까지 동질성을 유지하기 위해 RT에서 리포좀 혼합물을 흔들어. </li></ol></li><li> 원하는 경우, 달걀 노른자 리포좀에 형광 지질 아날로그를 추가합니다. 즉시 초음파 처리 한 후, 리포솜에 통합 30 초 동안 고속으로 리포솜 혼합물 소용돌이로 제조 된 지질 피펫. 호일에 튜브를 배치하여 빛의 혼합물을 보호하고 실온에서 락을 계속합니다. </li></ol> 3. 수유 패러다임 <ol><li> 먹이의 애벌레를 준비합니다. <ol><li> 공급을 방해 할 수 명백한 형태 학적 결함에 대한 공급, 화면 애벌레를 시작하기 전에. 60mm X 15mm 페트리 접시 또는 6 또는 12도 괞 찮아로 전송 애벌레TES, EM 최소로 감소시키고, 제조 된 리포좀 용액 5 ㎖로 교체한다. </li><li> 필요한 경우, EM 5 ML의 EM 및 / 또는 5 ml의 5 % 달걀 흰색에 unfed 제어 유충을 전송하고 병렬로 처리합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 형광 지질 유사체가있는 경우 빛으로부터 보호하기 위해 계속하는 동안 음식 섭취를 장려하기 위해 공급 전반에 걸쳐 배양 로커의 유충 (30 rpm에서 29 ~ 31 °의 C를) 바위. 애벌레 필요가 빛에 노출 될 경우, 착색 유리 인큐베이터 덮개 노출을 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 공급 기간의 끝에서, EM 3 회 자유롭게 수영 유충을 헹군다. 참고 : 애벌레 피드 동안 어느 시점에서 리포좀을 소비 시작할 수 있습니다. 이 유충이 동시에 공급하기 시작하는 것이 중요한 경우, 음식 섭취에 대한 화면 급전 1 시간 후 (3.4 참조) 공급을 완료 난황 에멀젼 공급을 개시 한 경우에만 애벌레를 반환한다. </li><li> 소수로 음식 섭취량이 시점에서 유충 화면 EA 않을 수도t (일반적 ~ 0~5%). 그들이 공급 한 경우 결정하기 위해 얼음에 금속 블록에 마취 또는 약간 냉각 된 유충의 장을 검사 : 리포좀을 섭취 한 유충은 어두운 소장 (그림 1)을해야합니다. </li><li> 바로 음식 섭취에 대한 이미지 또는 공정 애벌레. 또는, 장소 신선한 EM의 유충 및 28 ° C에서 부화 대사 처리가 발생 할 수 있습니다. </li></ol> 라이브 영상에 대한 유충을 설치 (4) <ol><li> 장착 미디어를 준비합니다. <ol><li> 3 % 메틸 셀룰로오스의 경우 : -20 ° C에서 년 동안 근처 끓는 EM, 소용돌이, 4 ° C에서 2~3일 완전히 용해 될 때까지 실온에서 바위, 저장 25 ml의 0.75 g의 메틸 셀룰로오스를 추가합니다. 4 ° C에서 동결 융해의 반복주기는 공기 방울을 제거합니다. 애벌레를 설치하는 동안 얼음에 3 % 메틸 셀룰로오스를 저장합니다. </li><li> 1.2 % 낮은 마운트 아가로 오스의 경우 : 0.3 g 추가 25 ㎖ EM에 아가로 오스 낮은 용융 및 2 ML의 t에 종기, 나누어지는로 가져 와서 용해ubes, 그리고 열 블록에 26 ~ 28 ℃로 유지한다. 미사용 분취 량을 RT에서 저장 또는 -20 ° C 및 사용시에 다시 비등 될 수있다. 아가로 오스는 유충에 노출하거나 가열을 통해-수 있습니다 전에 처리 할 수있을만큼 멋진 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 낮은 배율, 중간 처리량 라이브 영상의 경우, 얼음에 금속 블록에 조직에 유리 슬라이드를 배치하고 슬라이드가 식을 때까지 기다립니다. 에 붙어 낚시 줄 포커를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스에 유충을 전송, 슬라이드에 (얼음에 4 ° C로 유지 된) 3 % 메틸 셀룰로오스의 충분한 양을 적용 (0.41 mm 직경의 낚시 줄 유리 모세관의 끝)이 메틸 셀룰로오스 희석되지 않는다 (따라서 과잉 EM 드레인) 및 원하는대로 유충 위치로 약속하다를 생성한다. </li><li> 단기 (&lt;20 분)의 경우, 수직 오일 에멀젼의 목적으로 고배율 라이브 영상은, 방법 희박로 커버 슬립과 애벌레를 탑재합니다. <ol><li> 에 시아 노 아크릴 레이트 기반의 접착제 (순간 접착제)를 사용하여유리 슬라이드의 일단에 AA 22mm X 30mm의 coverslip에 연결합니다. 커버 슬립에 인접한 슬라이드에 3 % 메틸 셀룰로오스의 세선을 넣어 전체 보어 파스퇴르 피펫으로 슬라이드에 유충을 전송 포커를 사용한다. 는 메틸 셀룰로오스를 희석되지 않도록 초과 EM을 제거합니다. </li><li> 포커를 사용하여 부드럽게 커버 슬립 옆에 그들의 머리와 함께 (오른쪽 이미지에 담낭을 측면이 위로 간 더 많은 이미지 왼쪽) 자신의 양쪽에있는 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 두 번째 커버 슬립의 코너에서 스팟 순간 접착제는 애벌레를 브리징, 장착 된 커버 슬립에 커버 슬립 및 슬라이드의 다른 한쪽 끝을 배치합니다. 이 단계 동안이나 그 유충이 손상되지 않은 상태로 유지하면서 이미지 있도록 목적으로 과잉 압력을 적용하지 않도록 조심해서. </li></ol></li><li> 장기의 경우, 수직 침지 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스에 애벌레를 탑재합니다. 아가로 오스 다음 전송 1.2 % 낮은 용융의 작은 나누어지는에 유충을 추가배양 접시에 아가로 오스의 작은 볼륨에서 애벌레. <ol><li> 빨리 아가로 오스 응고 전에 포커와 애벌레를 놓습니다. 아가로 오스는 2 ~ 3 분 동안 건조 건조되는 것을 방지하기 위해 신선한 EM 완벽 아가로 오스를 포함 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장기의 경우, 역 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스의 유리 바닥 접시에 애벌레를 탑재합니다. <ol><li> 얼음에 금속 블록 쿨. 과도한 냉각 및 유충의 동결을 방지하기 위해 조직에 의해 분리 된 금속 블록에 접시를 놓습니다. 접시에 애벌레를 전송하고 티슈로 위킹하여 EM을 제거합니다. </li><li> 유충의 상단에 28 ° C 낮은 용융 아가로 오스 (1.2 %)의 하락을 놓고 즉시 포커 (아래 최상의 이미지에 왼쪽 간, 아래로 담낭 이미지 오른쪽)에 위치. 추위 블록에서 요리를 제거 2 ~ 3 분 동안 건조 할 수 있도록하고, 아가 로스를 커버하는 신선한 EM의 충분한 볼륨을 추가 (~ 2-5 ㎖). </li></ol></li></ol> 5. 식품 섭취시험 <ol><li> 6.4 μM BODIPY C 16 함유 난황 리포솜 공급의 마지막에, 플라스틱이 1.5 ㎖의 튜브 10 세정 유충 최소 EM 풀을 제거하고 동결 스냅. 샘플을 몇 달 동안 빛으로부터 보호 -80 ° C에서 저장 될 수있다. 참고 : 가능하면 여러 복제를 수집합니다. (사용되는 동일한 클러치에서 이상적으로 유충) 배경 지질 형광에 대한 정상화를이 단계에서 unfed 애벌레를 수집하는 것이 중요하다. </li><li> 수정 후 Bligh-다이어 지질 추출 3,21을 수행합니다. <ol><li> 얼음 샘플 (2 O를 사용할 수 있습니다 대안 정제 H) 100 ㎕를 균질화 버퍼 (20 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA)를 추가합니다. (1 초 오프 1 초 5 초 총)는 마이크로 팁의 초음파기와 얼음에 균질화. 그 애벌레 완전히 균질화를 확인; 하지 않을 경우, 반복합니다. 13 ml의 일회용 유리 배양 관에 전송 (다른 유리관이 사용될 수있다). 참고 : 클로로포름은 위험합니다; 이후의 모든 지질 전을 수행화학 후드에서 실온에서 견인 단계. </li><li> (: 메탄올 클로로포름) 2 : 사용 균질화 버퍼의 각 100 μL, 1의 375 μl를 추가합니다. 소용돌이 30 ~ 60 초, 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 당 클로로포름, 소용돌이 30 초 125 μl를 추가, 10 분을 품어. </li><li> 200 mM 트리스 산도의 125 μl를 추가 7.5 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 (빛으로부터 보호 2,000 X g, 5 분, RT) 소용돌이 30 초, 원심 분리기 당. 조심스럽게 원심 분리기에서 샘플을 제거합니다. 상부상은 수성이다 유생 파편의 인터페이스 및 하부 유기상 (지질을 포함)은 이들 두 개의 단계로 구분된다. </li><li> 깨끗한 유리 피펫 하단 유기상을 수집하고 깨끗한 13 mL 유리 튜브로 옮긴다. 주 : 계면의 성상 및 유생 파편을 피하기 위해주의; 오염이 발생하는 경우, 원심 분리 단계 및 배열 회수 반복한다. 상단, 수성 상을 폐기; 그것을 제거하고이를 폐기하는 것이 도움이 될 수 있습니다유기상을 수집하기 전에 단계. 샘플 1 개월까지 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 빛으로부터 보호하면서 진공 유기상 (0.12 기압)을 건조. 이 지질 용해도가 감소하므로 액체가 증발 후 샘플을 건조 계속하지 마십시오. 2의 지질을 재현 탁 : 얼음에 저장 : 1 (메탄올 클로로포름). 클로로포름의 최적 량 : 메탄올 용액을 사용하는 측정 방법에 따라, 낮은 시작하고 필요에 따라 희석을 계속합니다. 일반적인 지침은 10 풀링 유충 10 μl를 사용하는 것입니다. </li></ol></li><li> 채널 화 TLC 판에 균등 간격으로 전체 샘플 볼륨을 파악하고 정기적으로 생체 분자 영상 (예를 들어, 형광 플레이트 리더)에 사용되는 레이저 스캐너와 함께 접시를 검사합니다. 510-665 nm 내지 500-650 nm의 최대 발광의 여기 최대 값을 가진 물질의 목록에 포함 된 형광 리피드 유사체를 들어, 520 nm의 발광 회수를 가진 488 nm의 레이저를 사용하여. <ol><li> 이미징 소프트웨어 각 스폿의 총 형광 정량화. 참고 : 자연스럽게 쌍, unfed 애벌레 샘플의 형광을 뺀 배경 지질 형광을 발생에 대한 올바른. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism.">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li><li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis.">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 기술은 연구자, 지질이 풍부한 피드 유생 제브라 치료 라이브 유충식이 지질을 시각화 처리 한 애벌레 음식 섭취를 정량화 할 수있다. 성공을 보장하기 위해 특별한주의는 몇 가지 중요한 단계에 주어져야한다. 상업 닭고기 달걀 변화; 잠재적 인 변동성을 최소화하기 위해 우리는 오메가 -3 지방산에 대한 풍부한되지 않은 케이지가없는 닭에서 유기농 계란에 대한 모든 분석을 수?...

소장식이 지질 처리를 규제하는 메커니즘은 간 복합 지질 단백 합성 및 대사 조절, 이들 기관은 음식 섭취를 조절하는 중추 신경계 작동 방법 불완전하게 이해된다. 또한 비만, 심혈관 질환, 당뇨, 비 알코올성 지방간 질환의 현재 유행의 빛이 생물 해명 생의학 관심사이다. 세포 배양에서 연구와 마우스는식이 지질과 질병, 그리고 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 사이의 역학적 관계에 대한 우리의 이해의 대부분을 제공 한이 작품을 보완하는 이상적인 모델로 부상하고있다. 제브라 피쉬는 높은 척추 동물 1, 2와 유사한 위장관 (GI) 기관, 지질 대사 및 지질 단백질 수송을 신속하게 개발 및 유전자 다루기 쉬운입니다. 애벌레 제브라 피쉬의 광학 선명도가 생체 내 연구에 용이하게하는 particula그 외 환경로 GI 시스템의 연구 연구의 장점 (즉, 담즙, 미생물은 내분비 시그널링)은 생체가. 따라서, 유전자 취급 용이성 및 conduciveness 조합 연구의 본체와 제브라 애벌레의 촬상 라이브 모델 사실상 불가능 식이 조작 (고지방 3,4, - 콜레스테롤 5, -carbohydrate 다이어트 6,7), 심혈관 질환 (8) 모델의 다양한 당뇨 9, 10, 간 지방증 11-13, 비만 14-16, 신진 대사 통찰력의 호스트를 제공하기 위해 등장하고있다. 대사 연구로 유생 전환 지브라 피쉬의 중요한 양태는 제브라 피쉬와의 고유의 장점을 활용할 새로운 분석법의 개발에 다른 모델 동물 개발 기술의 최적화이다. 이 프로토콜은 기술이 LIPI 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기 위해 개발 및 최적화 제공D가 풍부한 식사, 세포 내 해상도로 몸 전체에서식이 지질 처리를 시각화하고, 음식 섭취를 측정한다. 그것은 지방과 콜레스테롤 (지질이 ~ 닭 계란, 60 %가 중성 지방은 콜레스테롤입니다 ~ 5 %가되는 노른자, 35 %의 58 %는 인지질이 구성의 높은 수준을 포함로 닭고기 달걀 노른자는 지방이 풍부한 식사를 구성하기 위해 선택되었다 ). 제브라 피쉬 사료 및 먹이 연대는 랩 17에서 표준화되지 않은으로 닭고기 달걀 노른자는 전형적인 상업 제브라 피쉬 micropellet 식품 (~ 15 %의 지질)과 특정 지방산 종의 알려진 비율과 표준화 공급되는 장점보다 더 많은 지방을 제공합니다. 또한, 달걀 노른자에서 제공하는 형광 지질 유사체는 박층 크로마토 그래피를 통해 신진 대사를 조사, 운송 및식이 지질 (18)의 축적과 같은 중요한 염료 3 복잡한 지질에 공유 결합을 통해 모두 작용하여 지질 방울 포함 이미지 세포 성분을 시각화 (TLC) (19) </sup&gt; 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) (SAF 미발표 데이타), 총 음식 섭취 20 정량적 분석을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="832">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A5040-25G</td>
			<td style="width:335px;">Anesthesia for larval zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Chicken eggs</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Ultrasonic processor 3000 sonicator</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">S-3000</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Sonabox acoustic enclosure</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">432B</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">1/8&#8221; tapered microtip</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">419</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Amber vials (4 ml, glass)</td>
			<td style="width:143px;">National Scientific</td>
			<td style="width:127px;">13-425</td>
			<td>Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Incu-Shaker Mini&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Benchmark</td>
			<td style="width:127px;">1222U12</td>
			<td>Incubated shaker for feeds</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C16&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3821</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C12&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3822</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C5&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3834</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C5</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D2183</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">TopFluor cholesterol&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:127px;">810255</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0281-1G</td>
			<td>For TopFluor cholesterol solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">M0387</td>
			<td>Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">BP165-25</td>
			<td>Mounting media for live larval imaging; 22 x 30</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">VWR microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:143px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:127px;">16004-422</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Coverslips&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:127px;">12-544A</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Super glue</td>
			<td style="width:143px;">Loctite</td>
			<td style="width:127px;">LOC01-30379</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">FluoroDish (glass bottom dish)</td>
			<td style="width:143px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FD35-100</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsytems</td>
			<td style="width:127px;">SP-2, SP-5</td>
			<td>Microscope for high magnification live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:127px;">SM21500</td>
			<td>Microscope for low magnification live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Glass culture tubes&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Kimble</td>
			<td style="width:127px;">73500-13100</td>
			<td>Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Savant SpeedVac Plus&#160;</td>
			<td style="width:143px;">ThermoQuest</td>
			<td style="width:127px;">SC210A</td>
			<td>Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Channeled TLC plates</td>
			<td style="width:143px;">Whatman Scientific</td>
			<td style="width:127px;">WC4855-821</td>
			<td>Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Channeled TLC plates</td>
			<td style="width:143px;">Analtech, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">66911</td>
			<td>Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td>
			<td style="width:143px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:127px;">9410</td>
			<td>Fluorescent plate reader for food intake assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">ImageQuant software</td>
			<td style="width:143px;">GE Healthcare</td>
			<td>29000605</td>
			<td>Analysis of food intake assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">5 3/4&#8217; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Kimble</td>
			<td style="width:127px;">63A53WT</td>
			<td>Transfering larvae</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

29 ~ 31 ° C에서 로커에 공급되면, 건강 유충 (≥95 %)의 대부분이 1 시간 내에 먹는다. 계란 노른자 에멀젼을 소모하면, 애벌레 소장 컬러로 어둡게. 아주 어두운 장 2 시간 (그림 1)에서 관찰 할 수있다. 애벌레 unfed 또는 공급하지 않을 경우, 소장은 분명 남아있다. 애벌레 먹이 계란 흰자 전시 컬러로 어둡게하지 않는 팽창 장 루멘. <img alt="그?...

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High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K 조회수.  Carnegie Institution for Science. Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques. 

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

연구

생물학

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

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Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

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The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease transmitted through an infectious bite from the female Anopheles mosquito. Malaria control will eventually rely on a multitude of approaches, which includes ways to block transmission to, through and from mosquitoes. To study mosquito stages of malaria parasites in the laboratory, we have optimized a protocol to culture highly infectious Plasmodium falciparum gametocytes, a parasite stage required for transmission from the human host to the mosquito vector. P. falciparum gametocytes mature through five morphologically distinct steps, which takes approximately 1-2 weeks. Gametocyte culture described in this protocol is completed in 15 days and are infectious to mosquitoes from days 15-18. These protocols were developed to maintain a continuous cycle of infection competent gametocytes and to maintain uninterrupted supply of mosquito stages of the parasite. Here, we describe the methodology of gametocyte culture and how to infect mosquitoes with these parasites using glass membrane feeders.

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Detailed investigations on mosquito stages of malaria parasites are critical to design effective transmission blocking strategies. This protocol demonstrates how to effectively culture infectious gametocytes and then feed these gametocytes to mosquitoes to generate mosquito stages of P. falciparum.

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Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...