The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

Diese Protokolle wurden von der Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care und Use Committee (Protokoll Nr. 139) zugelassen. 1. Vorbereitung der Tiere <ol><li> Pflegen Erwachsene und Larven bei 28 ° C auf einer 14 Stunden: 10 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus. Ziehen Erwachsene zweimal täglich mit der Schale , ohne Artemia (decapsulated, nicht-Schraffur, ab 14 dpf) und kommerzielle Mikro. </li><li> Diese Protokolle sind für den Einsatz von 6-7 dpf Larven von natürlichen Laich des AB Hintergrund gesammelt optimiert. Protokolle können für Larven anderer Altersgruppen und modifiziert werden. Nicht bieten exogene Lebensmittel vor 6 dpf. </li><li> Anästhesieren Larven mit Tricaine in Embryomedium (EM) (4,2 ml einer 4 mg / ml Tricaine pro 100 ml EM) bei Raumtemperatur (RT). </li></ol> 2. Herstellung von lipidreichen Eidotter-Feed <ol><li> Bereiten Sie und speichern Sie das Huhn Eigelb. Trennen Sie das Eigelb und Eiweiß von 12 Hühnereiern. Pool die Eigelbe, aliquoten 1 ml in 1,5ml-Röhrchen, und bei -80 ° C bis zu 1 Jahr (12 Eigelb wird ~ 80 Aliquots machen). Pool die Weißen, zu speichern und zu verwenden als Lipid armen, eiweißreiches Futter. </li><li> Bereiten fluoreszierendes Lipid analog (s) bis zu dem Eigelb Futter hinzugefügt werden, falls gewünscht. <ol><li> Hängen Sie das gekauft, pulverisierte fluoreszierende Lipid analog in 100% Ethanol oder 100% Chloroform bei 0,1 ug / ul (siehe folgenden Hinweis Lösungsmittel diskutieren), aliquoten in opaken Glasröhren, Dichtung mit Parafilm und Speicher nach den Anweisungen des Herstellers. Aufgrund der schnellen Verdampfung von organischen Lösungsmitteln nicht aliquoten Mengen von weniger als ~ 400 &amp; mgr; l für die Langzeitlagerung verwendet werden. Hinweis: Wenn das Lipid analog in Ethanol suspendiert wird, um große Mengen des Lipid analog verwendet werden , weil es schneller unter N 2 als Chloroform trocknet. Wenn das Lipid analog in Ethanol suspendiert muss es nicht, bevor es an das Liposom Futter in Schritt 2.2.4 getrocknet und resuspendiert werden, das Hinzufügen, aber die Gesamtethanolkonzentration nicht 0 überschreiten sollte.1% in der Liposom-Zufuhr potentiell verwirrende physiologischen Wirkungen von Ethanol zu vermeiden. </li><li> Für fluoreszierende Fettsäure-Analoga: Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 20 ml 5% Eigelb-Emulsion in EM. Von der Vorbereitung 5 - ml - Aliquots mit einer Endkonzentration von 6,4 &amp; mgr; M 4,4-Difluor-4-bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacen- (BODIPY C 16) für die Live - konfokale Bildgebung und die Nahrungsaufnahme Assays oder 1 &amp; mgr; g / ml BODIPY C 12 für Stereoabbildung. Übertragen, um die gewünschte Menge des fluoreszierenden Lipids analogen in ein 1,5 ml-Kunststoffröhrchen. Trocknen Sie das Lipid unter einem Strom von N 2, kümmert sich nicht um das Lipid aus dem Rohr zu blasen. </li><li> Sofort Resuspension in 5 ul 100% Ethanol durch einen Strom Pipettieren an den Seiten des Rohres, fügen Sie 95 ul EM, und gut mischen. Hinweis: Die Mischung homogen erscheinen soll; wenn farbige Lipid an den Seiten des Röhrchens bleibt oder die Flüssigkeit erscheint clumpy hat das Lipid nicht vollständig solubilisiert und Ethanol erfordert. Schützen Sie den Schlauch herm Licht und auf Eis lagern. </li><li> Für fluoreszierende Cholesterin analog: eine endgültige Konzentration von 2,4 ug / ml Cholesterin in 5 ml 0,5-5% Eigelb-Emulsion für Live-Imaging-Studien vorzubereiten. Übertragen, um die gewünschte Menge an Cholesterin in einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen. Trocknen Sie das Lipid unter einem Strom von N 2, kümmert sich nicht um das Lipid aus dem Rohr zu blasen. </li><li> Unmittelbar, resuspendieren in 15 ul RT 100% Ethanol , indem ein Strom an den Seiten des Röhrchens pipettiert und mit 85 ul RT 1% fettsäurefreies BSA in gereinigtem H 2 O mischen Schützen Sie das Rohr vor Licht und lagern auf dem Eis. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Eidotter Liposom-Feed. <ol><li> Fügen Sie eine aufgetaute Aliquots von Eigelb EM in einem 50 ml konischen Röhrchen. Vortex die verdünnte Eigelbmischung für 1-2 min; Die Mischung sollte eine homogene Emulsion zu sein scheinen. </li><li> Gießen Sie die Mischung durch ein Sieb feinmaschigen Protein Konglomerate zu entfernen und sammeln sich in einem neuen, frischen 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pulse sonicate die Ei-Mischung mit einem ein Viertel Zoll verjüngte microtip (5-mal (5 x 1 sec, 1 sec aus) pausieren 5-10 sec zwischen jedem Satz; Ausgangsintensität: 6 W) bei RT Liposomen zu erstellen. Sonicator Leistungseinstellungen sind Instrument abhängig und deshalb eine Optimierung für jedes Instrument und microtip erfordern. Hinweis: Kontinuierlich Liposomenmischung rocken bei RT Homogenität bis zum Gebrauch aufrechtzuerhalten. </li></ol></li><li> Fügen Sie die fluoreszierenden Lipids analog zu den Eigelb-Liposome, falls gewünscht. Unmittelbar nach der Ultraschallbehandlung pipettieren die vorbereiteten Lipide in dem Liposom Mischung und vortex bei hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden in die Liposomen zu inkorporieren. Schützen Sie die Mischung aus Licht, das durch das Rohr in Folie wickeln und weiter bei RT zu schaukeln. </li></ol> 3. Fütterung Paradigm <ol><li> Bereiten Sie die Larve für Füttern. <ol><li> Vor dem Futter zu Beginn Bildschirm Larven auf offensichtliche morphologische Defekte, die Fütterung behindern. Transfer Larven bis 60 mm x 15 mm Petrischalen oder 6- oder 12-Well-plaTES, reduzieren EM auf ein Minimum, und mit 5 ml der hergestellten Liposomenlösung ersetzen. </li><li> Bei Bedarf übertragen unfed Kontrollarven bis 5 ml EM und / oder 5 ml 5% Eiweiß in EM und parallel zu behandeln. </li></ol></li><li> Schütteln Sie die Larven in einem inkubiert Wippe (29-31 ° C bei 30 Umdrehungen pro Minute) während der gesamten Futternahrungsaufnahme zu fördern und gleichzeitig weiterhin von Licht abzuschirmen, wenn fluoreszierende Lipid-Analoga vorhanden sind. Wenn Larven Notwendigkeit Licht ausgesetzt werden, minimieren die Belichtung mit einer getönten Glas Inkubator Abdeckung. </li><li> Am Ende der Fütterungsperiode, spülen Sie die frei schwimmenden Larven in EM 3 mal. Anmerkung: Die Larven beginnen Liposomen an einem beliebigen Punkt während des Vorschubs raubend. Wenn es wichtig ist, dass Larven zur gleichen Zeit beginnen Fütterung, Bildschirm für die Nahrungsaufnahme (siehe 3.4) nach 1 Stunde der Fütterung und zurück nur Larven, die begonnen haben, auf die Eigelb-Emulsion Zuführen des Futter abzuschließen. </li><li> Bildschirm, um die Larven zu diesem Zeitpunkt für die Nahrungsaufnahme als kleine Zahl kann nicht eat (in der Regel ~ 0-5%). Untersuchen den Darm der Larven , die anästhesiert wurden oder leicht abgekühlt auf einem Metallblock auf Eis , um zu bestimmen , ob sie eingespeist wurden: Larven , die Liposomen verbraucht wird einen abgedunkelten Darm aufweisen (Abbildung 1). </li><li> Bild oder Prozess Larven für die Nahrungsaufnahme sofort. Alternativ Ort Larven in frischen EM und bei 28 ° C inkubieren metabolische Verarbeitung auftreten zu lassen. </li></ol> 4. Larvae Montage für Live-Imaging <ol><li> Bereiten Sie die Montage Medien. <ol><li> Für 3% Methylcellulose: 0,75 g Methylcellulose zu 25 ml in der Nähe siedende EM, Wirbel, Felsen bei RT 2-3 Tage, bis sie vollständig gelöst und bei 4 ° C über Jahre bei -20 ° C hinzufügen. Wiederholte Zyklen von Einfrieren und Auftauen bei 4 ° C Luftblasen zu entfernen. Lagern Sie 3% Methylcellulose auf Eis, während Larven Montage. </li><li> Für 1,2% niedrig-Mount-Agarose: add 0,3 g niedrigschmelzende Agarose zu 25 ml EM und lösen sich durch zum Kochen zu bringen, aliquoten in 2 ml tUBEs und auf einem Heizblock bei 26-28 ° C halten. Unused Aliquots können bei RT oder 20 ° C und kochte erneut zum Zeitpunkt der Verwendung gelagert werden. Achten Sie darauf, dass Agarose kühl genug ist, vor der Belichtung zu Larven zu handhaben oder sie können überheizt. </li></ol></li><li> Für Low-Vergrößerung, mittleren Durchsatz Live-Bildgebung, einen Glasobjektträger auf einem Gewebe auf einem Metallblock auf Eis und warten, bis die Folie zu kühlen. Tragen Sie eine großzügige Menge von 3% Methylcellulose (die bei 4 ° C auf Eis gehalten wurde) auf den Objektträger, übertragen eine Larve auf die 3% Methylcellulose, mit einer Angelschnur Poker (0,41 mm Durchmesser Angelschnur auf den aufgeklebten Ende eines Kapillarrohrs Glas) schaffen eine troth überschüssige EM abzulassen (so dass Methylcellulose wird nicht verdünnt) und die Larven positionieren, wie gewünscht. </li><li> Für kurzfristige (&lt;20 min), hoher Vergrößerung Echtzeit-Bildgebung mit einem aufrechten Öl emersion Ziel, montieren Larven mit dem Deck lean-to-Methode. <ol><li> Verwenden Sie Cyanoacrylat basierten Klebstoff (Superglue) zuaa 22 mm x 30 mm Deckglas an einem Ende eines Glasobjektträger befestigen. Verwenden Sie einen Poker eine dünne Linie von 3% Methylcellulose zu setzen auf dem Schlitten neben dem Deckglas und übertragen Larven auf den Schlitten mit einer großen Bohrung Pasteur-Pipette. Überschüssiges EM, damit es nicht die Methylcellulose zu verdünnen. </li><li> Mit einem Poker positionieren sanft Larven in der Methylcellulose auf ihren Seiten (linke Seite bis zur Bild mehr von der Leber, der rechten Seite nach oben auf Bild, um die Gallenblase) mit ihren Köpfen neben dem Deckglas. </li><li> Spot superglue in den Ecken eines zweiten Deckglas und legen sanft eine Kante des Deckglases auf dem montierten Deckglas und die andere auf der Folie, die Larven überbrücken. Achten Sie darauf, nicht Überdruck in diesem Schritt anzuwenden oder mit dem Ziel, während Bildgebung, so dass Larven heil bleiben. </li></ol></li><li> Für langfristige, hoher Vergrößerung Bildgebung mit einem aufrechten Tauchziel, montieren Larven in Agarose. Fügen Sie eine Larve auf eine kleine Teilmenge von 1,2% niedriger Schmelz Agarose dann übertragen dieLarve in einem kleinen Volumen von Agarose zu einer Petrischale. <ol><li> Lage, schnell die Larven mit einem Poker vor dem Agarose verfestigt. Lassen Sie die Agarose für 2-3 min zu trocknen und die Agarose vollständig mit frischem EM bedecken Austrocknen zu verhindern. </li></ol></li><li> Für langfristige, hoher Vergrößerung Bildgebung mit einem invertierten Ziel, montieren Larven auf einem Glasbodenschale in Agarose. <ol><li> Kühlen Sie einen Metallblock auf dem Eis. Die Schale auf dem Metallblock durch ein Gewebe getrennt zu starke Abkühlung und Larven Einfrieren zu verhindern. Übertragen einer Larve in die Schale und nehmen Sie die EM, indem sie mit einem Gewebe Wicking. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von 28 ° C niedrigschmelzende Agarose (1,2%) an der Spitze der Larve und sofort Position mit einem Poker (linke Seite nach unten auf beste Bild der Leber, rechte Seite nach unten auf Bild der Gallenblase). Entfernen Sie Gericht aus dem kalten Block, lassen für 2-3 Minuten, um zu trocknen, und fügen Sie ein ausreichendes Volumen an frischem EM decken die Agarose (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> 5. NahrungsaufnahmeProbe <ol><li> Am Ende eines Eigelb Liposom Futter mit 6,4 uM BODIPY 16 C, Pool ein Minimum von 10 gewaschen Larven in einem Kunststoff - 1,5 oder 2 - ml - Röhrchen, entfernen EM und gefrier schnappen. Die Proben können vor Licht geschützt für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden. Hinweis: Wenn möglich, sammeln Sie mehrere Replikationen. Es ist wichtig, unfed Larven in diesem Schritt zu sammeln für die Hintergrundfluoreszenz Lipid zu normalisieren (idealerweise Larven von der gleichen Kupplung verwendet werden). </li><li> Führen Sie eine modifizierte Bligh-Dyer Lipidextraktion 3,21. <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l Homogenisierungspuffer (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) auf die Probe auf Eis (alternativ gereinigtem H 2 O verwendet werden können). Homogenisieren auf Eis mit einem microtip Beschallungsgerät (5 sec gesamt: 1 s auf 1 s aus). Überprüfen Sie, dass Larven sind völlig homogenisiert; wenn nicht, wiederholen. Transfer in ein 13-ml-Einwegglaskulturröhrchen (andere Glasröhren verwendet werden). Hinweis: Chloroform ist gefährlich; führen alle nachfolgenden Lipid-exTraktionsschritte bei RT in einer chemischen Haube. </li><li> Für jeweils 100 &amp; mgr; l verwendet Homogenisierungspuffer, fügen 375 ul 1: 2 (Chloroform: Methanol). Vortex 30-60 sec, Inkubation 10 min, fügen Sie 125 ul Chloroform pro 100 ul verwendet Homogenisierungspuffer, und Vortex 30 Sekunden. </li><li> In 125 ul 200 mM Tris pH 7,5 pro 100 ul Homogenisierungspuffers verwendet, Wirbel 30 sec, und Zentrifuge (2000 x g, 5 min, RT, lichtgeschützt). Entfernen Sie vorsichtig die Proben aus der Zentrifuge. Sie werden in zwei Phasen getrennt werden: eine obere Phase wäßrig ist, über eine Schnittstelle von larvalen Schutt, und eine untere organische Phase (enthält Lipide). </li><li> Mit einem sauberen Glaspipette den Boden, organische Phase sammeln und übertragen sie in ein sauberes 13 ml Glasröhrchen. Hinweis: Achten Sie auf die wässrige Phase und Larven Trümmer an der Schnittstelle zu vermeiden; wenn Verunreinigungen auftreten, Zentrifugationsschritt und recollect wiederholen. Entsorgen Sie die obere, wässrige Phase; kann es hilfreich sein, dies zu entfernen und zu entsorgenPhase vor der organischen Phase zu sammeln. Die Probe kann bis zu 1 Monat bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Die organische Phase wird unter Vakuum (0,12 atm), während sie von Licht zu schützen. Machen Sie nicht weiter um die Proben zu trocknen, nachdem die Flüssigkeit verdampft ist, wie es Lipidlöslichkeit reduzieren. Resuspendieren der Lipide in 2: 1 (Chloroform: Methanol) und auf Eis lagern. Das optimale Volumen der Chloroform: Methanol-Lösung hängt von dem Nachweisverfahren verwendet wird; beginnen niedrig und weiterhin nach Bedarf zu verdünnen. Eine allgemeine Richtlinie ist 10 &amp; mgr; l für 10 gepoolten Larven zu verwenden. </li></ol></li><li> Finde die gesamte Probenvolumina in gleichmäßigen Abständen auf eine DC - Platte kanalisiert und scannen Sie die Platte mit einem Laserscanner routinemäßig für biomolekulare Bildgebung verwendet (zB ein Fluoreszenzplattenleser). Für die fluoreszierende Lipid-Analoga in der Materialliste enthalten, die eine Anregungsmaxima von 500 bis 650 nm und Emissionsmaxima von 510 bis 665 nm haben, verwenden Sie einen 488-nm-Laser und mit Emissions Sammlung bei 520 nm. <ol><li> Quantifizierung der Gesamtfluoreszenz von jedem Ort mit Imaging-Software. Hinweis: Richtige für natürlich durch Subtraktion der Fluoreszenz gepaart, ungefüttert Larven Proben Hintergrund Lipid Fluoreszenz auftritt. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die hier beschriebenen Techniken können Forscher Larven Zebrabärbling mit einer lipidreichen Futter, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung in lebenden Larven und quantifizieren Larven die Nahrungsaufnahme zu behandeln. Um den Erfolg sicherzustellen, sollte besonderes Augenmerk auf einige kritische Schritte gegeben werden. Kommerzielle Hühnereier variieren; mögliche Variabilität zu minimieren, führen wir alle Tests auf Bio-Eier aus Käfigfreie Hühner, die nicht für Omega-3-Fettsäuren angereichert hab...

Die Mechanismen, mit denen der Darm Nahrungslipid Verarbeitung reguliert, steuert die Leber komplexe Lipidsynthese und Lipoprotein-Metabolismus und wie diese Organe mit dem zentralen Nervensystem arbeiten Nahrungsaufnahme zu steuern, sind nicht vollständig verstanden. Es ist der biomedizinischen Interesse, diese Biologie in Anbetracht der aktuellen Epidemien von Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf- Erkrankungen aufzuklären, Diabetes und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung. Studien in der Zellkultur und Mäusen haben die Mehrheit der unser Verständnis der mechanistischen Beziehungen zwischen Nahrungslipiden und Krankheit, und Zebrabärbling (Danio rerio) sind , sich als ideales Modell zur Verfügung gestellt , diese Arbeit zu ergänzen. Zebrabärblinge haben ähnliche gastrointestinale (GI) Organe, den Fettstoffwechsel und Lipoprotein Transport zu den höheren Wirbeltieren 1,2, entwickeln sich schnell und sind genetisch manipulierbaren. Die optische Klarheit des Larven Zebrabärbling erleichtert in vivo - Studien, eine particular Vorteil für das Studium des GI - System als extrazelluläre Milieu (dh, Galle, Mikrobiota, endokrine Signalisierung) ist praktisch unmöglich , zu modellieren , ex vivo. Entsprechend wird ein Körper der Forschung der genetischen Lenkbarkeit und Zuträglichkeit Kombination Bildgebung von Zebrabärblingembryonen zu leben eine Vielzahl von Nahrungs Manipulationen ( mit hohem Fettgehalt 3,4, -Cholesterin 5 und Kohlenhydrat - Diäten 6,7) und Modelle von kardiovaskulären Erkrankungen 8, Diabetes 9,10, Hepatosteatose 11-13 und Fettleibigkeit 14-16, entstehen eine Vielzahl von metabolischen Erkenntnisse zur Verfügung zu stellen. Ein wesentlicher Aspekt der Larven Zebrabärbling in Stoffwechselforschung des Übergangs ist die Optimierung der in anderen Modelltiere auf den Zebrabärbling und die Entwicklung neuer Assays entwickelt Techniken, die die einzigartigen Stärken der Zebrabärbling nutzen. Dieses Protokoll stellt Techniken entwickelt und optimiert Larven Zebrabärbling zu füttern ein lipid-reiche Mahlzeit, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung von ganzen Körper zu subzellulärer Auflösung, und die Nahrungsaufnahme zu messen. Chicken egg yolk wurde gewählt, um die lipidreichen Mahlzeit zu schreiben, da es ein hohes Maß an Fetten und Cholesterin enthält (Lipide komponieren ~ 58% der Hühner Eigelb, von denen ca. 5% Cholesterin, 60% Triglyceride sind, und 35% sind Phospholipide ). Chicken egg yolk bietet mehr Fett als typische kommerzielle Zebrabärbling Mikropellet Lebensmittel (~ 15% Lipide) und dem Vorteil , dass es eine standardisierte Feed mit bekannten Prozentsätze der spezifischen Fettsäuren Art ist, wie Zebrabärbling Diäten und Fütterungs Regimenter nicht über labs 17 standardisiert. Darüber hinaus visualisieren fluoreszierende Lipid - Analoga im Eigelb zur Verfügung gestellt Transport und Akkumulation von Nahrungslipiden 18, Bild Zellkomponenten einschließlich Lipidtröpfchen , die durch die beiden als Vitalfarbstoffe 3 und durch kovalente Einbindung in komplexe Lipide wirken, untersuchen Stoffwechsel durch Dünnschichtchromatographie (TLC) 19 </sup&gt; Und Hochleistungs - Flüssigchromatographie (HPLC) (nicht veröffentlichte Daten SAF) und einen quantitativen Assay für die Gesamtnahrungsaufnahme 20 bereitzustellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="832">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A5040-25G</td>
			<td style="width:335px;">Anesthesia for larval zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Chicken eggs</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Ultrasonic processor 3000 sonicator</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">S-3000</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Sonabox acoustic enclosure</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">432B</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">1/8&#8221; tapered microtip</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">419</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Amber vials (4 ml, glass)</td>
			<td style="width:143px;">National Scientific</td>
			<td style="width:127px;">13-425</td>
			<td>Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Incu-Shaker Mini&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Benchmark</td>
			<td style="width:127px;">1222U12</td>
			<td>Incubated shaker for feeds</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C16&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3821</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C12&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3822</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C5&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3834</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C5</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D2183</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">TopFluor cholesterol&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:127px;">810255</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0281-1G</td>
			<td>For TopFluor cholesterol solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">M0387</td>
			<td>Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">BP165-25</td>
			<td>Mounting media for live larval imaging; 22 x 30</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">VWR microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:143px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:127px;">16004-422</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Coverslips&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:127px;">12-544A</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Super glue</td>
			<td style="width:143px;">Loctite</td>
			<td style="width:127px;">LOC01-30379</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">FluoroDish (glass bottom dish)</td>
			<td style="width:143px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FD35-100</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsytems</td>
			<td style="width:127px;">SP-2, SP-5</td>
			<td>Microscope for high magnification live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:127px;">SM21500</td>
			<td>Microscope for low magnification live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Glass culture tubes&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Kimble</td>
			<td style="width:127px;">73500-13100</td>
			<td>Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Savant SpeedVac Plus&#160;</td>
			<td style="width:143px;">ThermoQuest</td>
			<td style="width:127px;">SC210A</td>
			<td>Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Channeled TLC plates</td>
			<td style="width:143px;">Whatman Scientific</td>
			<td style="width:127px;">WC4855-821</td>
			<td>Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Channeled TLC plates</td>
			<td style="width:143px;">Analtech, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">66911</td>
			<td>Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td>
			<td style="width:143px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:127px;">9410</td>
			<td>Fluorescent plate reader for food intake assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">ImageQuant software</td>
			<td style="width:143px;">GE Healthcare</td>
			<td>29000605</td>
			<td>Analysis of food intake assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">5 3/4&#8217; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Kimble</td>
			<td style="width:127px;">63A53WT</td>
			<td>Transfering larvae</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

Wenn bei 29-31 ° C auf einer Wippe zugeführt wird, wird die Mehrheit der gesunden Larven (≥95%) innerhalb von 1 Stunde essen. Nach Erhalt der Eigelb-Emulsion aufwendig, verdunkelt sich der Larvendarm in Farbe. Sehr dunkle Darm kann bei 2 Stunden (Abbildung 1) beobachtet werden. Wenn Larven unfed sind oder zu füttern fehlschlagen, bleibt der Darm klar. Die Larven gefüttert Eiweiß zeigen einen aufgeblähten Darm-Lumen, das nicht in der Farbe nicht verdunkeln. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

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High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Aufrufe.  Carnegie Institution for Science. Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques. 

Serie: High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

In Echtzeit In Vivo Aufnahme von Arabidopsis Kalziumsignale während der Fütterung mit einer fluoreszierenden Biosensor Insekt

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease transmitted through an infectious bite from the female Anopheles mosquito. Malaria control will eventually rely on a multitude of approaches, which includes ways to block transmission to, through and from mosquitoes. To study mosquito stages of malaria parasites in the laboratory, we have optimized a protocol to culture highly infectious Plasmodium falciparum gametocytes, a parasite stage required for transmission from the human host to the mosquito vector. P. falciparum gametocytes mature through five morphologically distinct steps, which takes approximately 1-2 weeks. Gametocyte culture described in this protocol is completed in 15 days and are infectious to mosquitoes from days 15-18. These protocols were developed to maintain a continuous cycle of infection competent gametocytes and to maintain uninterrupted supply of mosquito stages of the parasite. Here, we describe the methodology of gametocyte culture and how to infect mosquitoes with these parasites using glass membrane feeders.

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Detailed investigations on mosquito stages of malaria parasites are critical to design effective transmission blocking strategies. This protocol demonstrates how to effectively culture infectious gametocytes and then feed these gametocytes to mosquitoes to generate mosquito stages of P. falciparum.

Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...