우리는 행동 분석의 최적화에 도움 숀 Pelkowski 감사합니다. 이 작품은 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소, R01 HD060647 ​​및 환경 건강 과학의 국립 연구소, F32 ES021342 및 R03 ES017755에 의해 지원되었다.

1. 제브라 피쉬 배아의 수집 및 유충을 기르고, <ol><li> &quot;가짜&quot;잔디 (녹색 원사에서 만든) (그림 1) 유리 파이렉스 요리 zebrafish의 배아를 수집하기 위해 새벽에 탱크에 삽입하고 두 시간 동안 남아있을 것이다. 배아를 포함하는 유리 접시는 소형 여과기에 부어 및 탈 이온수로 세척해야한다. 배아는 다음 달걀 물에서 재배되어야한다. 계란 물은 증류수 0.25 ㎎ / 곰팡이 억제제로 사용되는 메틸렌 블루의 L있는 인스턴트 오션 60 ㎎ / L를 포함합니다. </li><li> 각 실험의 가설에 따라, 배아는 즉시 또는 독성 물질이나 약품을 사용하여 개발의 특정 단계에서 처리 할 수​​ 있습니다. 독성 물질 및 의약품은 일반적으로 DMSO에 용해 (1,000 X의 농도)와 더 계란 물을 매체에 직접 희석해야한다. </li><li> 제약 또는 독성 물질과 배아와 애벌레 치료 중들, 유충 및 배아는 7 DPF (계란 물 솔루션이 매일 적어도 세균 / 곰팡이의 성장을 방지하기 위해 변경해야의 행동 분석까지 50 ML 당 50-60 유충의 밀도에 깊은 페트리 접시에 수납 할 수 있습니다 죽은 태아부터). </li></ol> 2. 행동 분석을위한 틀을 준비 <ol><li> 특히 X 7.6 cm X 5mm은 사내에서 - 사용자 지정 내장 된 11.7 cm를 측정 플라스틱 금형을 개발했다. 금형 온도 과학에서 하나의 잘 플라스틱 접시에 부어 아가을 사용하여 차선을 만드는 데 필요합니다. 하나의 웰 플레이트 측정 12.4 cm X 8.1 cm X 1.2 cm. </li><li> 금형면을 60 °로 각도되는 다섯 개의 차선을 포함합니다. 금형의 차선 밑바닥 폭이 14mm 인 반면 넓은입니다 상단에 18mm의 기본 높은 3.5 mm이다. 금형 레인 (그림 2) 사이의 4 개 mm 간격이 있습니다. </li><li> 차선이 녹은 아가로 오스의 50 ML (탈 이온화에서 0.8 % 아가로 오스를 부어 준비하려면하나의 웰 플레이트에 60 ㎎ / L 즉시 바다)와 D 물. 형은 그 어떤 거품 형성을 제거하는 액체 아가의 상단에 아주 천천히 배치해야하고 (약 45 분 소요)를 아가로 오스가 냉각 될 때 제거 할 수 있습니다. </li><li> 행동 실험 (건조 아가을 피하기 위해) 차선은 약 36 시간에 대한 접시에 뚜껑 실온에서 최대 저장할 수 있습니다 실행될 전에 아가 레인은 그 이전보다 하루하여야한다. 아가로 오스 차선은 하나의 실험에 사용되어야하고 폐기해야합니다. </li></ol> 3. 이미지 캡처 <ol><li> 최대 20 유충은 플레이트의 각 레인에 배치 할 수 있습니다. 레인 당 일반적으로 5 유충은 수영 속도의 가장 정확한 추적을 용이하게하고 실험마다 필요한 유충의 수를 줄이기 위해 사용됩니다. 레인은 계란 물이나 실험에 따라 의약품 또는 독성 물질없이 채울 수 있습니다. 그러나 차선 F 안된다그들은 이미징 캐비닛에 배치 될 때까지 모든 방법을 illed, 이것은 오버 플로우를 방지 할 수 있습니다. 그들은 아가로 오스 금형에 배치 노트북 화면의 상단에 배치 된 후 일관성을 위해 유충 10 분의 적응 기간을 가져야한다. 효율적으로 페트리 접시에서 아가로 오스 차선 애벌레를 이동하는 애벌레 스트레스를 줄이는 데 도움이됩니다. 애벌레가 얕은 탱크 또는 페트리 접시에 보관하는 경우 이것은 가장 쉬운 방법입니다. </li><li> 영상 캐비닛은 시간 경과 사진과 노트북에 사용되는 캐논 디지털 카메라 (가) 있습니다. 카메라가 캐비닛의 상단에 배치 15.6 인치 스크린 노트북은 화면 (그림 3)를 향하도록 배치되어야 캐비닛의 바닥을 향해 목표로해야한다. 4 판은 직접 노트북 화면의 상단에 손으로 위치해야합니다. 그것은 (L의 가장자리에 그림자를 제거하기 위해 차선의 상단 수준이되도록이 시간에 차선 계란 물 또는 화학 처리를 돌파 할 수있다이미지에 마취). </li><li> PowerPoint 프레 젠 테이션은 유충에 대한 혐오 자극으로 사용됩니다. 과거 이동 빨간 공 6 또는 12 멀티 웰 플레이트 15,17,18에서 애벌레 zebrafish의을 보여 하였다. 현재 파워 포인트 판의 위쪽 (그림 4)에 이동 빨간색 막대의 15 분 뒤에 15 분에 대 한 빈 흰색 배경으로 시작됩니다. 애벌레 과열 제거하기 위해서는 28 이상 이동하지 않는 화면 ℃의 온도로 노트북을 구입하는 것이 가장 좋습니다 아가로 오스 차선 내에서 액체의 증발을 방지하기 위해 최대 영상 시간을 한 시간 이하로 유지되어야한다. </li><li> 디지털 카메라는 실험 당 300 이미지의 총 사진마다 6 초 복용 시간 경과 촬영에 프로그래밍해야합니다. 그러나 주파수와 길이는 실험과 행동 정량화에 따라 조정할 수 있습니다. 과거의 확장 된 영상 시대에 각 이미지 사이에 더 이상 간격을 사용하여 채택되었다. camer를이 동영상 속도 (초당 30 프레임)에서 이미징을위한 낮은 해상도로 설정할 수 있습니다. 낮은 해상도는 하나의 다중 웰 플레이트에 녹음을 제한하는 동안, 비디오 녹화 이미징 빠른 수영 이벤트 15에 적합합니다. </li></ol> 4. 이미지 분석 <ol><li> 이미지는 ImageJ에 함께 열리고 특히 사내에서 작성되었습니다 매크로와 함께 사용되어야한다. 매크로가 자동으로 붉은 색을 제거 할 수 있도록 색상 채널을 분할 배경을 빼고 임계 값을 적용하고, 입자 분석하여 애벌레를 식별합니다. 다섯 차선 애벌레 분석을위한 가장 최신의 매크로 Zebrafish_macro25k입니다. 이미지의 개수, 차감 할 컬러, 이미지 임계 값 등을 설정하는 매크로 프롬프트를 사용하여 </li><li> 모든 이미지는 ImageJ에 매크로를 실행 한 후 결과 파일이 표시되며 X가 포함됩니다, y는 이미지 번호와 레인 번호와 함께 각 이미지에 대한 개별 애벌레의 좌표. </리&gt; <li> 결과 파일은 엑셀 형식으로 저장 한 후 빈 배경 대 움직이는 바 배경도 수에 따라 정렬되어야합니다. Excel 서식 파일은 자동으로 우물 애벌레의 배치를 결정 내장 방정식, 유충 사이의 거리, 이동 속도, 나머지 금액을 가지고 사용되어야한다. 가장 최근의 엑셀 템플릿은 25ib 요청시 사용할 수있는, Creton 실험실에서 만들어집니다. 다양한 치료 그룹을 보여주는 그래프 치료 그룹과 통제의 비교를위한 t-테스트와 함께 엑셀 시트에 내장되어야한다. 또한 통계 분석은 SPSS를 사용하여 수행 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 지속적으로 새로운 행동 분석을 개선하는 동안, 그것은 항상 회피 zebrafish의 유충 15 thigmotaxis 동작의 검출에 유용하고있다. 많은 시련이 같은 사용 자극의 색으로, 분석의 결과를 최적화하기 위해 수행되었다, 레인 당 유충, 행동 분석의 길이 이상적인 숫자입니다. 이전에, 우리는 멀티 웰 플레이트 (6 또는 12 우물) 15,17,18를 사용했습니다. 그러나 최근에 우리는 우리가 하나의 분석 16 (그림 5)의 행동 조치의 큰 숫자를 수집 할 수 있도록 유충 큰 수영 공간을 만들 수있는 새로운 차선 형을 만들었습니다. 다른 수정은 파워 포인트 예의 B의 변형 (분석의 변경 이동이나 길이) 및 (우리는 또한 더 좁은 골목길 금형을)를 사용 레인의 크기를 이용하실 수 있습니다. 현재이 높은 처리량 자동화 시스템은 zebr의 행동의 넓은 범위를 측정 할 수있는 고유 한 기능입니다같은 속도, 회피, 다른 애벌레에 근접, 멀티 레인 접시에 thigmotaxis과 동시에 afish의 애벌레. 결과를 신속하게 얻을 수 있으며 유충의 큰 숫자는 영상의 시간에 분석 할 수 있습니다. 시스템이 설정 구축 저렴하고 빠르고 쉽게 둘 수 있습니다. 이 시스템의 한계는 3-D 움직임 zebrafish의 유충에서 평가 할 수없는 것입니다. 성인 zebrafish의 추적 자동화 시스템은 3-D 기능을 가지고 있으며 이러한 이동 또는 아래로 물 열 10,19에서와 같은 행동의 넓은 범위를 식별 할 수 있습니다. 또 다른 한계는 우리의 이미징 시스템은 현재 비디오 속도에서 높은 처리량 분석을 위해 최적화되지 않는 것입니다. 낮은 해상도 15 카메라를 설정할 때 동영상 속도 이미징이 가능하지만,이 하나의 플레이트에 분석을 제한합니다. 새로 만든 &quot;레인&quot;방법을 사용하여, 분석의 여러 부분은 정확한 방법으로 실행해야 할 필요가 있었다. T의 유충을 배치 할 때그는 차선, 그것은 플레이트는 노트북 화면의 상단에 위치 할 때까지 액체의 수준이 매우 얕은 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 차선 액체의 너무 많이 있다면, 유충 판의 주변으로 탈출합니다. 또한, 아가로 오스에 금형을 삽입 할 때,주의가 매우 느리게 형을 낮추기 위해주의해야합니다. 형이 너무 빨리 넣으면 거품 아가 형성되고 추가 유충으로 이미지 J 매크로에 의해 식별됩니다. 그것은 아가로 오스 레인도 약간 거품이 있다면, 그것은 새로운 것들을 만들기 위해 최선 것이 좋습니다. 미래에, 우리는 zebrafish의 애벌레 학습 등의 복잡한 행동을 분석하고 학습이 초기 개발에 독성 물질 및 의약품에 노출에 의해 영향을받을 수있는 방법을 조사하기 위해 행동 분석을 최적화하고 싶습니다. 우리는 현재 행동 결과 뇌 영역을 결정할 촉진 할 수있는 학습 행동을 분석하는 데 유용 할 수 있습니다 분석에 노력하고 있습니다개발하는 동안 특정 독성 물질이나 약품에 의해 영향을 미쳤다. 자동화 된 분석은 zebrafish의 유충 (20)이 분석의 동작을 배우는 것이 다 차선 접시에 강력한 회피 반응을 사용하여 높은 처리량 검사를 위해 수정할 수있는 수 있습니다 측정하기 위해 개발되었습니다. 우리는이 행동 분석은 의약품 및 독성 물질의 다수의 발달 효과를 테스트하기 위해 미래 연구에 사용될 수 있다고 제안한다. 이러한 연구는 특정 위험 요소에 대한 풍부한 정보를 제공하고 임산부와 어린이를위한 더 나은 건강 및 안전 지침을 설정에 기여하는 것이다.

제브라 피쉬는 유전 적, 발달 및 행동 과학 1-4 인기 모델이되고있다. 그들은 2-3 일 포스트 수정 (DPF)하여 chorions에서 부화 4-5 DPF에 의해 완벽하게 작동하는 기관을 개발하고, 7 DPF 5,6에 의한 행동의 큰 숫자를 나타냅니다. Zebrafish의 유충은 이상적 때문에 그들의 작은 크기 7,8의 높은 처리량 분석에 적합합니다. 소프트웨어 애벌레와 성인 zebrafish의 9-14의 행동의 자동 분석을위한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나,이 소프트웨어는 비싼 멀티 잘 접시에 zebrafish의 애벌레의 복잡한 행동을 측정하기위한 제한된 옵션이 있습니다. 우리가 설정하고 7 DPF의 zebrafish의 애벌레 15,16 다른 행동의 수를 정할 수있는 저렴 소설 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 시스템의 수에 배아 노출 후에 저희가 신속하고 효율적으로 미묘한 행동 이상을 테스트 할 수 있습니다제약 및 환경 독성 물질 16-18. 시스템 캐비닛의 상단에 집이 디지털 카메라 나무 캐비닛을 사용하여 만들어졌습니다. 카메라는 노트북이 15 위로 향하도록 화면 배치 캐비닛의 바닥에 아래로 직면 해있다. 시간 경과 영상은 차선 애벌레의 위치를​​ 캡처하는 데 사용됩니다. 애벌레는 노트북 화면의 상단에 위치하는 네 개의 멀티 잘 또는 다중 차선 번호판에 수납 할 수 있습니다. 우리는 애벌레의 가장자리 (thigmotaxis) 15,17쪽으로 멀리 이동 (회피)와 수영 응답 혐오 자극으로 파워 포인트 프레 젠 테이션을 사용합니다. 이미지는 자동 매크로, 색상 채널을 분할 배경 빼기 및 개별 유충을 식별 할 수있는 임계 값을 적용하는 데 사용되는 ImageJ에로 가져올 수 있습니다. 좌표는 각 이미지의 각 유충에 대해 나열하고 우리가 회피 thigmota을 계량하는 데 사용 엑셀 파일에 삽입 할 수 있습니다XIS 행동, 물고기 거리는 물고기, 속도, 나머지 16 량을 수영.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

우리는 다 차선 접시에 7 일짜리 zebrafish의 유충의 행동 분석을위한 새로운 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 이 시스템은 파워 포인트 프레 젠 테이션을 통해 유충에 표시됩니다 자발적 행동과 혐오 자극에 대한 반응을 측정합니다. 촬영 된 이미지는 자동으로 색상 채널을 분할 ImageJ에 매크로로 분석되는 배경을 뺀 차선의 개별 애벌레 위치를 식별하는 임계 값을 적용합니다. 우리는 그 수영 속도, 차선의 가장자리 또는 측면에 대한 선호, 휴식 행동, thigmotaxis, 유충 사이의 거리 및 회피 행동을 정량화하기 위해 엑셀 시트에 좌표를 가져올 수 있습니다. 행동의 미묘한 변화는 쉽게 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동 분석을위한 유용하고, 우리의 시스템을 사용하여 감지됩니다.

우리의 이전 분석에서, 야생형 유충은 잘 (회피 동작) 아래로 수영하고 잘 (thigmotaxis 동작) (15)의 가장자리쪽으로 이동하는 공에 응답 튀는 공 혐오 자극 치료되는 사용. 우리는 나중에이 분석에 thigmotaxis 문제가 zebrafish의 유충 17 불안 관련 행동의 측정을 확인 하였다. 빈 흰색 배경에 비해 애벌레의 움직임에 큰 차이 멀리 공을 가장자리 환경에서이 있었다. 이러한 동작은 움직이는 빨간색 막대를 사용하여 우리의 새로운 분석에서 확인 된 더욱 강력한 16아르있다. 또한, 우리는 지금 수영 속도, 휴식, 우물의 끝이나 측면에 대한 선호와 물고기 사이의 거리 (그림 5)를 포함하는 하나의 분석에서 행동의 큰 숫자를 맛보실 수 있습니다. 계란 물에 성장 제어 유충 증가 선호 요리와 차선의 가장자리에 다운하는 방법을 보여줍니다따고는 그들이 혐오 자극 (빨간색 막대를 이동)에 관한 정보들로 안내되게됩니다. 유충은 1 ㎍ / ㎖ DMSO, 일반적으로 1,000 X 주식 솔루션 등 다양한 의약품 및 독성 물질을 분해하는 데 사용되는 용매를 포함하는 계란 물에서 재배하는 경우 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 대표 결과는 계란 물과 DMSO (컨트롤)와 일반적으로 비 유기농 식품에서 발견 된 유기 인계 농약의 다양한 농도로 처리 유충의 그림 5에 표시됩니다. 같은 결과는 하나의 실험에서 샘플링입니다. 그러나 반복 할 때, 결과는 수영 속도와 thigmotaxis 동작이 인간의 음식 소비를 18 레벨을 모방 유기 인계 살충제의 낮은 농도로 변경되었음을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> 그림 1. 컬렉션 트레이. 유리 파이렉스 접시는 전자를 수집하는 데 사용됩니다성인 물고기 탱크에서 mbryos. 파이렉스 접시의 뚜껑을 잘라 플라스틱 그리드, 녹색 실이 플라스틱 격자에 놓은 된이 삽입되었다. 이 자연 환경을 모방하여 성인 zebrafish에 대한 번식 분위기를 연출합니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> 그림 2. 플라스틱 금형 및 아가 레인. A) 형은 왼쪽에 표시됩니다. 0.8 % 아가로 오스는 한 - 웰 플레이트에 붓고, 곰팡이가 천천히 삽입 아가로 오스가 냉각되면 다음 제거 B) 오른쪽의 플레이트 플라스틱 금형에 의해 아가 만든 차선을 보여줍니다.. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> 그림 3. 영상 캐비닛. 이미징 캐비닛의 speciall했다y를 우리의 실험실에서 구축하고 높은 처리량 행동 분석에 사용됩니다. 15 메가 픽셀 디지털 카메라는 노트북의 화면 상단에 배치 다 차선 접시에 애벌레의 시간 경과 이미지를 수집하기 위해 아래를 향 캐비닛의 상단에 부착되었다. 접시와 화면 사이에 수집 된 이미지에 물결 무늬 패턴을 방지하기 위해 사용되는 플라스틱 디퓨저가있다. <img alt="그림 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> 그림 4. 빈 배경 및 PowerPoint 혐오 자극.이 zebrafish의 애벌레의 행동 변화를 연상하는 데 사용되는 현재의 파워이다. 그것은 A) 빈 배경 및 B) 이동 빨간색 막대 사이의 강력한 행동의 차이를 제공합니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> 그림 5. 높은 처리량 분석에서 정량화 된 행동. 우리는 X, 유충의 Y 좌표에 사용하는 엑셀 시트에서 우리의 행동 분석에서 정량화 행동의 예. 흰색 막대가 빈 배경에 노출 빨간색 막대는 PowerPoint에서 빨간색 이동 막대에 노출 된 유충에서 데이터를 표시 애벌레에서 데이터를 표시합니다. 그래프는) B, 차선의 끝에 유생의 백분율 C) 차선의 가장자리에 애벌레의 백분율 D) 거리 사이에 차선 유충) 비율 다운 행동 분석에서 얻을 수있는 측정을 나타냅니다 물고기 (mm), E)의 유충 (mm / 분), F) 유충의 백분율 나머지 속도를 수영. 그림 그래프, 데이터 트리트에서이다DMSO 제어 및 0.001에서 0.1 μM (일반적으로 인간의 식단에서 발견 된 수준)에 이르기까지 농약의 여러 농도의 유충 후 ENT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K 조회수.  Brown University. 우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

연구

신경과학

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM 이미징 및 FIMtrack : 높은 처리량 및 비용 효율적인 로코 분석을 허용하는 두 가지 새로운 도구

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

간질의 제브라피시 모델의 행동 및 생리학적 분석

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

출혈 성 뇌졸중의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 제 브라 피시 애벌레 사용

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

제브라피시에서 장기간 고혈당증을 생산하는 포도당에 대체 침수

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

에코HIV 뇌 감염의 쥐 모델

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 TDP-43의 광유전학 적 단계 전환

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

생체 내 제브라피시 유충의 전뇌 영상

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

저자 스포트라이트: 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 In Vivo 전뇌 이미징  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...