Name: a new method for qualitative multi-scale analysis of bacterial biofilms on filamentous fungal colonies using confocal and electron microscopy
Uploaded: 2017-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy at JoVE.com

This work was supported by the French National Research Agency through the Laboratory of Excellence ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), the Plant-Microbe Interfaces Scientific Focus Area in the Genomic Science Program, and the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory is managed by UT-Battelle, LLC, for the United States Department of Energy under contract DE-AC05-00OR22725.

세균 및 진균 배양 1. 준비 <ol><li> 곰팡이 문화의 준비 <ol><li> 페트리 접시 같은 직경 셀로판 막을 준비하고, 30 분 동안 EDTA (탈 이온수 1g / L)에서 그들을 끓인다. 탈 이온수로 시트를 씻어 두 번을 오토 클레이브. </li><li> 곰팡이 한천을 접종하여 곰팡이 사전 문화를 준비는 EDTA 사전 처리 셀로판 막으로 덮여 적절한 한천 배지에 연결합니다. 콜로니를 지름 약 1cm을 얻기 위해 최적 성장 온도에서 인큐베이션. <ol><li> L. 바이에 S238N 들어 + diNH4 타르트 레이트 0.5 g, KH 2 PO4 1 g, 황산 0.5 g · 7H 2 O, 말토오스 D 5 g 이루어지는 Pachlewski P5 한천 배지 5 일 동안 25 ° C에서 부화 포도당 D + 20 g, 10 % 티아민 염산 1 ㎖, 1 희석 1/10 ml의 미량 원소 용액 (6 g / L 황산 제일철 0.27 g / 리터 몰리브덴 trioxyde; 8.45 g / L 붕산 5 g / L 남자ganese 황산; 5g / L의 구리 황산; 2.27 g / L 황산 아연)의 탈 이온수 1 L로 만들었다; 한천 20g; pH가 5.5. </li></ol></li><li> 진균 예비 배양에서 콜로니의 직경 확장을 촉진 저탄소 한천 배지를 함유하는 EDTA 전처리 셀로판 막으로 덮여 새로운 아가 플레이트에 접종. <ol><li> 페트리 접시를 접종 부드럽게 메스 예비 배양에서 곰팡이 콜로니 (셀이 같은 생리적 상태에 있음)과 새로운 한천 플레이트에 균사를 전송하는 외부 영역을 긁어. </li><li> 새로운 식민지는 직경 약 1cm가 될 때까지 최적 성장 온도에서 품어. L. 바이 컬러의 S238N를 들어, P20 한천 배지 (딘 4 타르트 레이트 0.25 g에 5 일간 25 ° C에서 그들을 품어, KH 2 PO 4 0.5 g, 황산 4 · 7H 2 O 0.25 g, 포도당 D + 1 g을 10 % 티아민 염산 0.5 ㎖; 1/10 희석 미량 용액 (CF 1.1.2 0.5ml를.1) 탈 이온수 1 L로 만들었다; 한천 20g; 산도 5.5). 참고 : 인해 셀로판에 예비 배양, 배양 제는 중앙 플러그 한천 매체를 포함하지 않을 것이다. 이 플러그는 한천과 분석에 편견을 만들 수 있습니다 영양분을 소개하기 때문에 한천 플러그는 생물막의 추가 분석을 위해 제거해야합니다. 만 진균이 단계에 대한 우려 유지 및 한천 플레이트에 전달하고,이 포자 또는 냉동 주식에서 전파되는 곰팡이 필요하지 않습니다되는 종. </li></ol></li></ol></li><li> 세균 배양의 준비 <ol><li> (사용되는 균주에 따라, 또는 임의의 다른 적절한 매질) 액체 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 25 ㎖를 적절한 한천 배지에서 배양 2-3 개별 박테리아 콜로니를 수집하고 접종 멸균 루프를 사용한다. P.가 BBc6을 fluorescens를 들어, 부드러운 흔들림 28 ° C (~ 150 RPM)에서 하룻밤 문화를 품다. 참고 : 변형을 사용하여이 현미경 관찰에 앞서 이중 염색 (곰팡이 및 박테리아)을 수행하기 때문에 이러한 회피 GFP 등의 형광 단백질, 태그, 바람직하다. 타이밍 교반 속도, 배양 온도는 사용 균주 늦은 지수 성장 배양 물을 수득되는 목적에 따라 다르다. </li></ol></li></ol> 곰팡이 식민지에 박테리아의 생체 외 바이오 필름에서 N 2. 준비 <ol><li> 원심 분리기 박테리아 3 분 5,000 XG에 문화와 멸균 0.1 M 인산 칼륨 완충액 (25 g /의 L의 KH 2 PO 4, 2.78 g / LK 2 HPO 4, 산도 5.8) 25 ㎖에 펠렛을 일시 중지합니다. 일단이 단계를 반복하고 같은 버퍼와 109 세포 / ml로 최종 세균 농도를 조정합니다. </li><li> 박테리아 현탁액 (또는 대조군 멸균 0.1 M 인산 칼륨 완충액) 5 ㎖로 6 웰 마이크로 플레이트를 채운다. </li><li> 봉 형님의 셀로판 막 컷멸균 면도날과 등 문화 각 막에 단일 곰팡이 식민지와 셀로판의 사각형을 얻었다. 조심 집게를 사용하여 고체 배지에서 균사 함유 셀로판 사각형 분리 세균 현탁액을 함유하는 마이크로 플레이트의 웰에 셀로판 함유 균사의 제곱 옮긴다. </li><li> 곰팡이의 식민지가 여전히 셀로판에 부착하는 동안 부드럽게 마이크로 흔들어; 다음 접시에 곰팡이 식민지를 떠나 셀로판 시트를 제거합니다. </li><li> 연구 된 미생물에 적합한 온도에서 교반과 (~ 60 RPM)와 마이크로 플레이트를 품어. 주의 : 항온 처리 시간을 분석 할 수있는 바이오 필름과 스테이지의 설정 속도에 의존한다. P.를 들어 BBc6 / L를 fluorescens. 바이 컬러, 초기 단계의 바이오 필름을 얻기 위해 30 분 동안 20 ° C에서 배양 16 시간까지 바이오 필름을 성숙 얻을. </li></ol> 바이오 필름 형식 3. 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 분석이온 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 강한 염 용액 (NaCl을, 17g / L) (17) 5 ㎖로 채워진 새로운 6 웰 마이크로 플레이트에 전송하여 곰팡이를 씻어, 균사에 정전 기적으로 부착 플랑크톤 세균과 박테리아를 제거하려면, 부드럽게 1 분간 흔들어. </li><li> 부드럽게 2 분간 흔들어, 멸균 0.1 M 인산 칼륨 완충액 5 ㎖를 함유하는 새로운 6 웰 마이크로 플레이트에 진균 전송하고 신선한 인산 칼륨 완충액에 곰팡이 옮긴다. </li><li> 얻어진 부분은 진균 콜로니의 절반이 포함되도록, 포타슘 포스페이트 버퍼를 유지하면서 진균 콜로니의 일부를 절단하는 메스 묘화한다. </li><li> 샘플을 염색하기 적합한 형광 염료 (분석의 목표에 따라)을 함유하는 멸균 수로 채워진 페트리 접시로 전송하고, 어둠에서 부화. <ol><li> 진균 네트워크 시각화 예를 들어, 사용 콩고 레드 (0.1 % 최종 COncentration, 배양 5 분) 형석 알렉사 633 (10 μg의 / ml의 최종 농도에 접합, 밀 배아 agglutin (WGA) 렉틴 인큐베이션 10 분) 또는 FUN1 (10 μM 최종 농도, 인큐베이션 10 분). </li><li> 시판되는 수많은 세포 투과 DNA 염료 중에서 DNA 특이 적 형광 프로브 균체 Counterstain과 비 형광 표지 된 세균을 사용하는 경우. 예를 들어, DAPI (0.25 μg의 / ml의 최종 농도, 인큐베이션 10 분)를 사용한다. </li><li> 매트릭스 단백질을 시각화하기 위해, 단백질 얼룩 (21)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 염색 후, 멸균 0.1 M 인산 칼륨 10 ㎖를 함유하는 페트리 접시 뚜껑에 전달함으로써 시료를 씻어 가볍게 1 분간 흔들어. </li><li> 반 페트리 접시 뚜껑에 슬라이드를 잠수함과 섬세 슬라이드 위에 떠하기 위해 절단면을 가지고. 그런 다음 천천히 샘플을 부드럽게 슬라이드에 정착 할 수 있도록 완충 용액에서 슬라이드를 제거합니다. <li> 마지막으로, 샘플 안티 페이드 장착 매체의 10 μL를 추가하고, 유리 커버 슬립으로 커버. 참고 : 슬라이드가 준비되면, 현미경 분석 가능한 빨리 수행되어야한다 (최대 30 분 이내) 생물막 구조에서 변형을 방지한다. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경 분석 <ol><li> 이미징 소프트웨어에 결합 된 10 배 또는 40 배 대물 렌즈와 공 초점 레이저 현미경 슬라이드를 검사합니다. 주 : 여기에서, 멀티 빔 스캐닝 공 초점 현미경 (405), 488, 및 561 nm의 여기 레이저하는 하나로 이루어질 PMT 검출기 및 10X 및 40X 0.3 NA 1.2 NA 목적 장착 사용 하였다. <ol><li> 요청 된 데이터의 유형 및 상기 시간 제약에 적합한 파라미터를 이용하여 촬상을 수행한다. 사용되는 얼룩에 제조업체의 recommendati에 따라 레이저 여기 / 방출 파장을 사용하여기능. 곰팡이 식민지와 바이오 필름의 글로벌 3D 뷰를 얻기 위해 타일 스캔 및 Z-스택 기능의 조합을 사용합니다. 주 : 그림 3의 이미지는 다음 매개 변수를 사용하여 취득한 : 8 비트 / 픽셀, 평균 = 2, = 1.58 마이크로 초는 타일 온라인 스티치 (10 % 적용, 임계 값 = 0.7)와 5 × 5 이미지의 스캔 픽셀 체류를; Z-단계 = 2 μm의. </li></ol></li><li> 3D 데이터 시각화를 들어, 많은 무료 또는 상용 소프트웨어 (이러한 3D 렌더링을위한 많은 옵션을 제공합니다) 중 하나를 사용하십시오. <ol><li> 예를 들어, 시야 채널 빼기 2D 최대 강도 돌기로서 Z 스택 데이터를 디스플레이 밝기와 콘트라스트를 조정하고, 합성 화상을 생성하는 채널을 병합. 이들이 존재하는 경우, Z-스택 말단부에서의 신호없이 슬라이스를 제거한다. 그리고, 2D 최대 강도 투영을 수행 RGB 색에 따라서 변환한다. 이미지의 페이지를 얻기 위해 ImageJ에 소프트웨어 (22)에서 &quot;Z 프로젝트&quot;기능을 사용하여2D 최대 강도 예측에 의해 여기에 분개했다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 전자 현미경 분석 <ol><li> 단계 3.1.2 제외 LSCM 기술 한 바와 같은 샘플을 준비 세정 단계 후 멸균 대신 인산 칼륨 완충액에 생물막을 전송. 이것은 SEM 영상을 교란 할 탈수 단계 동안 염 결정의 형성을 방지한다. </li><li> 샘플 홀더에 바이오 필름을 전송하고 여분의 물을 제거; 샘플 만 다루 물의 작은 펠리클을 허용한다. </li><li> 가변 압력을 주 사형 전자 현미경 (SEM-VP)의 챔버로 시료를 이동; 펠티어 냉각 단계에서 C ° -50로 동결; 그리고 천천히 동결 건조에 직접 SEM 챔버에서 15 시간 동안 설정 변수 압력 100 아빠와 함께 할 수 있습니다. </li><li> 동결 건조 종료 후, 시료를 검색하고 높은 진공 성막 시스템에 옮긴다. platinu 2 nm의 코트 샘플m 아르곤 플라즈마 (2.5 × 10 -2 mbar에서, 35mA)에서 (석영 측정). </li><li> 높은 &quot;렌즈&quot;해상도 검출기 1 kV로의 전자 높은 장력을 이용한 전계 방출 총 (FEG)가 장착 된 SEM으로 피복 된 샘플을 관찰한다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

세균 생물막이 많은 환경에서 검색하고이를 24을 분석하는 방법의 다수의 발전을 선도, 1950 년대부터 연구되고있다. 고전적 방법 정량화하고 모니터 생물막 마이크로 역가 분석하고, 가장 널리 사용되는 방법에있어서, 크리스탈 바이올렛 (CV) 염색을 포함한다. 이러한 방법은 빠르고, 낮은 비용, 및 (25) 처리가 용이하고 전체 생물막 매스 정량화 또는 생존 및 매트릭스 정량 분석을 수행하는 데 특히 유용하다. 타 한편, &quot;오 믹스&quot;방법 생물막 (26), (27)의 양적 및 기능 분석을 허용 또한 생물막 연구에 유용하다. 마이크로 타이 터 플레이트의 장점 및 &quot;오 믹스&quot;방법에도 불구하고, 생물막의 몇몇 중요한 특징은이 프로세스의 완전한 이해를 방해하고,이 기술을 포착 할 수 없다. 이러한 특징은 매트릭스 구조를 포함의, 세균성 식민지 구조, 세포 / 세포 상호 작용 및 바이오 필름의 기능과 형성의 역학 모두를 이해하는 데 중요한 자료이다 식민지 패턴. 이러한 기능을 캡처 현미경의 용량에도 불구하고, 사상균에 세균 바이오 필름의 현미경 분석은 여전히 ​​부족하다. 이것은 종종 두껍고 복잡한 삼차원 네트워크의 콜로니를 형성 사상균의 성장에 주로 기인한다. 곰팡이에 세균 바이오 필름의 형성은 다양한 환경에서 일반적인 상당히 다양한 분야 4 (예를 들어, 의학, 농업, 환경.)에 참여하고있다; 따라서, 자신의 조사를 용이하게 할 수있는 새로운 방법을 개발하는 것이 중요하다. 이를 위해 세균 생물막 현미경 이미징에 매우 얇은 진균 콜로니를 생성하는 방법을 조합. 또, 이러한 질적 생물막을 현미경 분석 도구의 세트를 제안 하였다. 방법의 성공에 의존능력 매우 얇은 균사 콜로니를 제조하고, 적절한 염료를 적용. 이 점은 아래에 설명되어 있습니다. 때문에 바이오 필름의 복잡한 구조로, 그 기능을 이해하는 것은 다중 스케일 방법 (28), (29)을 필요로한다. 바이오 필름, 세균성 식민지 아키텍처 및 매트릭스 구조와 구성의 분포 패턴은 다른 스케일 (즉, 메조 스케일과 마이크로 스케일)에서 분석된다. 또한, 나노 스케일 해상도는 셀 / 셀의 물리적 상호 작용과 매트릭스의 나노 구조에 대한 액세스를 허용한다. 따라서, 현상 방법은 쉽게 진균 콜로니 형성 세균 생물막의 다중 스케일 분석을 가능하게한다. 대부분의 연구에서, LSCM가 마이크로 규모로 제한된다 생물막 분석 일반적으로 광 간섭 단층 (30) (31)에 의해 수행되는 메소 스케일 <sup클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 32. 여기에 제시된 방법은 모두 마이크로 및 메조 스케일이 LSCM에 의해 분석 할 수 있습니다. 이 모두 높은 해상도 (도 3)와 차세대 공 초점 현미경을 사용하여 샘플의 동일한 영역에서조차 동일한 이미지 분석 조합의 유용성을 보여준다. 다른 방법은 여기를 피할 수에 따라서, 컴파일 된 데이터에 연결 문제는 서로 다른 규모에서 모였다. 분석의 조합은 곰팡이 식민지에서 생물막 다시 파티션 병용 개발 바이오 필름을 따라 세균성 식민지 구조, 매트릭스 구조를 접근했다. 메소 스케일 분석 곰팡이 콜로니 (도 2 및 3)에 대한 세균 생물막의 이종의 분포를 보였다. 이러한 관찰은 반드시 전체 식민지를 대표하지 않는 곰팡이 식민지의 작은 부분의 영상을 허용 프로토콜 불가능했을 것입니다. 따라서, 잠시종종 메조 스케일의 분석은 바이오 필름 분포 패턴에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다, 무시. 마지막으로, 현상 방법은, 주사 전자 현미경 등 다양한 현미경 기술을 가진 샘플을 분석하는데 사용될 수있다. 여기서, SEM은 나노 크기에 도달하고, 바이오 필름 내의 세균 공간 조직을 얻기 위해 사용 하였다. SEM은 표면 영상을 허용하면서는, 얇은 곰팡이 식민지 아주 잘 수행. LSCM 대조적으로, SEM은, 그러나, 필요한 샘플 탈수하고, 주로 도전성 금속으로 코팅. 이 탈수 과정이 올바르게 실행되지 않은 경우 생물학적 구조를 변경할 수 및 최적화를 필요로 할 수있다. 여기에, 느린 동결 건조를 사용하여 샘플 탈수 (33)을 사용 하였다. 그럼에도 불구하고, 샘플 LSCM와 SEM을 모두 적용하여 샘플의 동일한 위치에 상관 현미경의 성능을 허용 할 것이다. 장점에도 불구하고위에서 설명한 몇 가지 제한 사항이 존재한다. 첫째, 그것은 곰팡이의 모든 종류에 적용되지 않을 수 있습니다. 실제로,이 방법은 배양 고체 배지의 표면에 방사상으로 확산 진균류 용으로 개발되어있다. 이 방법은 주로 공중 균사를 (예를 들어, 푸사 리움 SP.)을 형성 곰팡이 또는 한천 내에서 주로 확산 마이크로 호기성 곰팡이에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한, 곰팡이의 분해 셀로판도 문제가 될 수있다 (예., 트리코더마 특검팀.). 둘째, 염색 전략이 중요한 시점이며, 얼룩은 바이오 필름을 방해하지 않아야로 얼룩의 선택은 신중하게 이루어져야 것이 중요합니다. 예를 들어, 우리는 CALCOFLUOR 화이트 인해 얼룩의 높은 pH로 (데이터는 도시하지 않음) 것으로 부분 생물막 혼란을 야기한다는 차렸다. 또한, 일부 염료 염색 불균일을 생성 (예., 콩고 레드), 다른 균일 한 염색을 제조하는 동안 (예., WGA 렉틴과 세포벽 염색), 이종 이미지 품질을 제공.또한, 일부 염료가 완전히 특정되지 않을 수도 있음을 인식하는 것이 중요하다. 예컨대, WGA 얼룩뿐만 아니라 진균 세포벽하지만 생물막의 형성 (34), (35) 중 그람 양성 세균과 -negative 제조 그램 양성 세균 세포벽 및 adhesins에도 N- 아세틸 뉴 라민 산. 따라서, 형광 단백질 태그 박테리아를 사용 및 / 또는 곰팡이 여러 얼룩을 방지하는 것이 좋습니다. 다수의 염료가 사용되는 경우, 화학적으로 방해하지 않아야하고, 그 발광 스펙트럼이 서로 겹쳐 있지 않도록하는 것이 필요하다. 메소 스케일 큰 스캔 영역을 필요로 분석하고, 따라서 LSCM 시간 소모적 (40 분 샘플 두께에 따라 시간, 1) 일 샘플의 다수의 분석 병목있다. 그럼에도 불구하고, 조정이 요구되는 데이터의 유형에 따라 제조 될 수있다. 이는 이미지 품질을 변경함으로써 획득 시간 및 이미지 사이즈를 감소시킬 수있다. 예를 들어, 높은 해상도생물막 일반 다시 분할을 분석 할 필요가 없습니다. 마지막으로, 몇 가지 제한은 2D 또는 3D 돌기로서 Z- 스택 데이터를 표시하도록 선택할 때 고려 될 필요가있다. 두 차원 예측은 데이터를 요약하는 좋은 방법이지만, 깊이 정보가 손실되고, 중첩 구조는 숨겨진된다. 한편, 3 차원 예측은 다른 관점에서 시각화를 허용하지만, 종종 공간 복잡성 경우 제대로 렌더링. 결론적 구조 수준에서 균사의 세균 생물막의 특성화하기위한 방법을보고 하였다. 방법론은 다른 애플리케이션으로 확장 될 수있다. 사실,이 방법은 곰팡이 균사에 형성 세균 바이오 필름의 기능 또는 화학적 특성의 성능을 할 수 있습니다. 인해 기존 형광 리포터 시스템의 큰 다양성에 LSCM 분석은 다양한 목적 (29)에 사용될 수있다. 예를 들어, 형광 MICroscopy는 생물막 (37)의 pH 구배 36 분자의 확산을 모니터링하는데 사용될 수있다. 또한,이 방법은 multispecies 생물막에서 사회 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 세균 집단을 대상으로 현장 하이브리드에 형광, 39 multispecies 특정 세균 다시 분할을 공부에 특히 유용하다 (38) 생물막. 마지막으로, 많은 형광 염료는 생물막 (21)의 매트릭스 조성물을 특성화하는데 사용될 수있다. 여기서, 단백질은 이들 기질 단백질 간의 단백질의 넓은 범위, 얼룩 Sypro (도 4)를 사용하여 타겟팅되었지만, 다른 염료 등의 엑소 폴리 사카 라이드 또는 세포 외 DNA 등의 다른 중요한 매트릭스 성분의 시각화를 허용한다. 흥미롭게도, 이러한 모든 분석은 전술 한 방법을 사용하여 메소 규모에서 수행 될 수있다. LSCM가 살아있는 샘플들에 수행 될 수 있으므로,예를 들어, 얇은 진균 콜로니 특히 적합한 챔버를 coverwell 사용 경과 이미징을 달성 할 수있다. 바이오 필름 형성이 복잡하고 역동적 인 과정이기 때문에이 옵션은 특히 흥미 롭다. 마지막으로, 정량적 목적을 위해보고 된 방법은 메소 스케일 이미지에서 정량이 가능하여, 자동 정량 분석의 정확성을 향상시킬 수있다. 이 생물막 이질성과 통계 문제 (29)을 극복 할 수 있습니다.

곰팡이 균은 대부분의 환경에서 지상파 동거 때문에 서로 상호 작용할 수있는 기회가있다. 그들의 다양성과 편재성으로 인해, 이러한 상호 작용은 생명 공학, 농업, 식품 가공, 의학 1, 2 등 많은 생물 분야에서 중요하다. 분자 상호 작용 파트너 사이에서 교환 할 수 있도록 근접 어느 정도 필요하고, 경우에 따라 파트너의 물리적 연합은 상호 작용 3 필요하다. 박테리아와 균류 사이의 일반적인 물리적 협회는 곰팡이 표면 4에 세균 바이오 필름의 형성이다. 박테리아 세포와 곰팡이 균사 간의 직접 접촉은 다양한 생물학적 과정에 관여하는 친밀한 상호 작용을 허용합니다. 예를 들어, 의학의 oppor에 녹농균의 생물막 형성의 연구에서tunistic 곰팡이 병원균 칸디다 알비 칸스는 biofilm 형성 및 독성 (5) 사이의 링크에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 농업에서의 연구는 혼합 된 바이오 필름에 곰팡이와 관련된 때 식물 성장 촉진 rhizobacteria 및 생물 방제 세균이 증가 효율이 좋습니다. 혼합 생물막 6 느타리과 연관된 예를 들어, Bradyrhizobium의 elkanii는 N이 -fixing 활성을 강화하고있다. 마지막으로, 생물학적으로, 세균 곰팡이 혼합 된 바이오 필름은 오염 된 사이트 (7)의 치료, 8 사용되었다. LSCM는 최소 전처리 수화 생물막 생활함으로써 바이오 필름의 구조와 구성을 유지할 입체 관찰 수 있기 때문에 바이오 필름을 연구하기에 특히 적합하다. 따라서, LSCM에 의해 생물막 분석은 특히 탐지하기 위해 매우 유익하다성숙한 생물막의 발전에 접착 단계에서 바이오 필름 형성의 시간 경과와 특징 단계 9, 10의 검출 족제비. 또한, 특히 바이오 필름 구조 매트릭스 (11) (12)를 시각화 또는 생물막 크기 13, 14 계량하도록 구성된다. 이 방법은 곰팡이 사상 식민지에 박테리아 바이오 필름을 공부하고, 비 생물 적 또는 얇은 생물 표면에 생물막을 연구하기에 적합하지만 여전히 매우 도전이다. 사실, 대부분의 사상 균류는 문화의 두께, 복잡한 삼차원 네트워크를 구축 할 수 있습니다. 두꺼운 개체가 초점 현미경에 의해 촬영 될 수있다하더라도, 레이저 투과성의 감쇠 및 형광 방출은 종종 50 내지 15㎛의 깊이를 통해 최종 이미지의 품질을 감소시킨다. 또한, 곰팡이 식민지 경직되지 않기 때문에, 나는t는 생물막을 방해하지 않고 미생물을 처리하기 어렵다. 인해 샘플의 두께, 진균 균사의 세균 생물막의 몇 현미경 분석은 보통 따라서 단 몇 균사 16, 17, 18을 포함하는, 진균 콜로니의 작은 부분에서 수행된다. 이 모든 진균 콜로니 내의 생물막의 이종의 분포의 경우에 대한 분석에 바이어스를 가져올 수있는, 따라서 진균 콜로니에 생물막 분포를 설명 할 수있는 능력을 제한하고. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 우리는 성장 및 진균 균사의 세균 생물막을 분석하는 방법을보고한다. 이 방법은 슈도모나스 ectomycorrhizal 담자균 Laccaria 바이 S238N의 균사에 BBc6을 fluorescens에서 바이오 필름 형성을 연구하기 위해 적용 하였다. 이 두 숲 토양 미생물는 이전에 혼합 형성 설명했다바이오 필름 형상의 구조체들 (19), (20). 이 방법은 더 용이하게 다른 사상 진균 / 박테리아 시스템에 적용될 수있다. 여기에 제시된 방법은 LSCM 및 SEM 촬상 매우 얇은 진균 콜로니의 성장을 허용 진균 배양 방법의 결합에 기초한다. 이 바이오 필름의 질적 특성을 허용, 두 미생물 사이의 상호 작용의 전망을 확장 마이크로 (㎛의 범위)를 획득하고 (mm 범위) 중간 - 우리를 허용. 또한 샘플을 나노 스케일 레벨 (㎚ 범위)에서 바이오 필름의 구조 분석을 허용, SEM으로 관찰 될 수 있다는 것을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>6 well Falcon Tissue Culture Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-33</td><td>Used in 2.2 &amp;amp; 3.1</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Fisher Scientific</td><td>C580-25</td><td>Used in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>FUN 1 Cell Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F7030</td><td>Used in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W21404</td><td>Used in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>DAPI solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td>Used in 3.1.4.2</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>Used in 3.1.4.3</td></tr><tr><td>FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10318</td><td>Used in 3.1.4.4</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>Used in 3.1.7</td></tr><tr><td>LSM780 Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used in 3.2.1</td></tr><tr><td>ZEN 2.1 lite black software&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used in 3.2.1</td></tr><tr><td>High Vacuum Coater Leica EM ACE600</td><td>Leica</td><td></td><td>Used in 4</td></tr><tr><td>GeminiSEM-FEG</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used in 4</td></tr></tbody></table>

a new method for qualitative multi-scale analysis of bacterial biofilms on filamentous fungal colonies using confocal and electron microscopy

세균 바이오 필름이 자주 곰팡이 표면에 형성 및 신진 대사 협력, 경쟁, 또는 포식 수많은 세균 곰팡이 상호 작용 과정에 참여 할 수있다. 바이오 필름의 연구는 환경 과학, 식품 생산, 의학 등 많은 생물 분야에서 중요하다. 그러나, 몇 가지 연구는 부분적으로이를 조사의 어려움, 이러한 세균 바이오 필름에 초점을 맞추고있다. 문헌에 기재된 분석 정량적 생물막위한 방법의 대부분은 비 생물 표면 또는 상피 세포의 단층으로서 균일하고 얇은 생물 표면에 생물막 형성에 대해서만 적합하다. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (LSCM)가 종종 현장 및 생체 생물막으로 분석하는 데 사용되지만 진균 균사의 세균 바이오 필름에 적용 할 때,이 기술로 인해 두께 및 균사 네트워의 입체적으로 매우 도전진다오크. 이러한 단점을 극복하기 위해, 우리는 진균 콜로니의 균사 층의 축적을 제한하는 방식으로 현미경을 조합하는 프로토콜을 개발했다. 이 방법을 사용하여, 우리는 두 LSCM 및 주사 전자 현미경 (SEM)을 이용하여 다수의 규모에서 진균 균사의 세균 바이오 필름의 개발에 대해 조사 할 수 있었다. 이 보고서는 미생물 배양, 세균 바이오 필름의 형성 조건, 생물막 염색 및 LSCM 및 SEM 시각화를 포함하여 프로토콜을 설명합니다.

곰팡이 문화와 생물막 준비의 전체 개략적 인 절차는 그림 1에 제시되어있다. 배양 방법은 우리가 두꺼운 마이크로 및 메소 스케일을 허용 균사 몇 층을 포함하는 20 내지 50 ㎛의은을 사용하여 수화 LSCM 거실 생물막 분석 진균 콜로니를 수득 할 수 있었다. 상기 방법의 적용은 P. 고품질 영상의 획득이 생물막 (- 4,도 2)의 형성에 따라 L. 바이 균사 BBc6에 생물막을 허용 fluorescens. 바이오 필름의 메조 스케일 분석 P.의 바이오 필름의 이종의 분포는 L. 바이 컬러 S238N의 균사 (그림 2, 3)에 BBc6을 fluorescens 보여 주었다. 메소 스케일의 분석은 시간에 따른 바이오 필름 형성의 추적 (도 허용3) 일부 세균 균사 (도 3a에 부착 된 상기 초기 단계)에서) 두꺼운 성숙한 생물막 (도 3b의 형성. 메소 스케일 이미지의 높은 해상도 우리 콜로니 아키텍처 (- D도 3c)을 얻기 위하여 동일한 이미지에 마이크로 스케일의 분석을 수행 할 수 있었다. 특정 라벨과 결합 된 마이크로 스케일의 분석은 바이오 필름의 특성에서 한 단계 더 이동 할 수있게. 여기서, 대부분의 단백질 클래스 라벨 SYPRO 루비 (23)는 상기 샘플들 (도 4)를 도포하고, 매트릭스 단백질의 존재를 도시한다. 마지막으로, 생물막 구조의 자세한 내용은 탈수 및 코팅 (그림 5) 후 동일한 샘플의 SEM 영상에 의해 얻어졌다. SEM 영상 제공나노 레벨로 액세스 따라서, 매트릭스 구조에 대한 액세스를 제공. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig1.jpg" /> 그림 1 : 곰팡이 문화와 생물막 준비의 전체 개략적 인 절차. 이 그림은 분석 샘플 미생물 배양에서, 방법의 주요 단계를 설명합니다. 더 자세한 내용은 프로토콜에 제시되어있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig2.jpg" /> 그림 2 : 곰팡이 식민지에 BBc6 생물막 재분할. 샘플은 10 배 배율에서 상호 작용의 18 시간 후 몇 군데 있었다. 이미지는 3D 공 촛점 현미경 이미지 2D 최대 강도 투영을 통해 얻었다. figu에 회색 격자다시는 모자이크 위치를 보여줍니다. L. 바이 컬러의 균사 콩고 레드 (빨간색)와 박테리아와 GFP - 태그 (녹색)입니다 염색된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig3.jpg" /> 그림 3 : L. 바이 컬러의 균사에 BBc6의 biofilm 형성의 초기와 후기 단계. 이 이미지는 3D 공 촛점 현미경 이미지 2D 최대 강도 투영을 통해 얻었다. 이미징 40X 배율로 수행 하였다. (가) 상호 작용의 2 시간 후 다시 분할을 생물막. 상호 작용의 14 시간 후 (b)는 바이오 필름의 재분할. (c)의 흰색 사각형의 확대 (a). (D)에 흰 사각형의 확대 (b). GFP-TA 곰팡이 균사가 콩고 레드 (빨간색)와 박테리아로 염색되어 있습니다gged (녹색). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig4.jpg" /> 그림 4 : L. 바이 컬러의 균사에 BBc6의 바이오 필름의 매트릭스 염색. (a) 상호 작용의 16 시간 후 생물막. (b)의 흰색 사각형의 확대 (a). 이미징 40X 배율에서 수행되고, 이러한 이미지는 3D 공 촛점 현미경 이미지 2D 최대 강도 투영을 통해 얻어졌다. 박테리아는 GFP - 태그 (녹색), 곰팡이가 Fun1 (짙은 녹색)으로 염색되어 있으며, 단백질은 S. 루비 (적색)로 염색된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 5 : L. 바이 컬러의 균사에 BBc6의 바이오 필름의 SEM 영상. SEM 이미징 EHT, 2360X 수행 하였다 1kV의. 촬상 전에, 샘플을 천천히 SEM 챔버 내에서 동결 건조 된 백금 코팅. 녹색 화살표는 세균 바이오 필름을 가리과 노란색 화살표는 곰팡이 균사를 가리 킵니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

a-new-method-for-qualitative-multi-scale-analysis-bacterial-biofilms

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.4K 조회수.  INRA Université de Lorraine.  이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다. 

비디오: A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

연구

의학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

면역학 및 감염병학

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

환경과학

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

생체공학

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

생물학

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, periodontitis, mucosal infections and, most notably, early childhood caries. In all of these conditions, the pH in the biofilm matrix impacts microbe-host interactions and thus the disease progression. The present protocol describes a confocal microscopy-based method to monitor pH dynamics inside cross-kingdom biofilms comprising Candida albicans and Streptococcus mutans. The pH-dependent dual-emission spectrum and the staining properties of the ratiometric probe C-SNARF-4 are exploited to determine drops in pH in extracellular areas of the biofilms. Use of pH ratiometry with the probe requires a meticulous choice of imaging parameters, a thorough calibration of the dye, and careful, threshold-based post-processing of the image data. When used correctly, the technique allows for the rapid assessment of extracellular pH in different areas of a biofilm and thus the monitoring of both horizontal and vertical pH gradients over time. While the use of confocal microscopy limits Z-profiling to thin biofilms of 75 &#181;m or less, the use of pH ratiometry is ideally suited for the noninvasive study of an important virulence factor in cross-kingdom biofilms.

The protocol describes the cultivation of cross-kingdom biofilms consisting of Candida albicans and Streptococcus mutans and presents a confocal microscopy-based method for the monitoring of extracellular pH inside these biofilms.

공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://app.jove.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...