우리는 P.를 제공하기 위해 워싱턴 대학 (시애틀, WA)에서 매트 PARSEK 감사합니다 녹농균 및 E. 스트림 소프트웨어에 대한 액세스를 제공하는 캔터베리 (뉴질랜드) 대학의 대장균 균주와 로저 Nokes. 이 작품은 국립 보건원, 알레르기의 국립 전염병 연구소에서 보조금 R01AI081983에 의해 지원되었다. 공 초점 영상은 노스 웨스턴 생물 이미징 시설 (BIF)에서 수행 하였다.

1. 흐름 전지 설치 및 접종 주 :.에 노래 등 기술 이중 입구 미세 유체 흐름 세포를 사용하여 2014 년 14 생물막 성장한다. 이 플로우 셀은 잘 정의 된 매끄러운 화학적 구배를 생성 할 수있다. 플로우 셀 설계는 이전에 설명 된 노래도 1에 도시 된 셀 제조되는 흐름 등., 2014 (14). 여기서는 상세히 P. 우리의 방법을 사용하여 녹농균 및 E. 대장균은 바이오 필름을 형성하지만, 다른 종은 너무 적합 할 수있다. 우리는 P. 사용 구성 적으로는 녹농균 생물막 개발 모델 생물로서, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 GFP를 PAO1-. 또한, 우리는 E.을 사용 대장균 DH5α는 P. 혼합 종 생물막 (biofilm)을 형성한다 녹농균. P. 녹농균 및 E. 콜라이 균주를 LB 아가 플레이트상에서 성장시켰다. <ol><li> 에 (PDMS) 결합 흐름 세포 사용하여 폴리 디메틸 실록산을 준비14에 기술 된 바와 같이 산소 플라즈마 처리를 통해 유리 커버 슬립. 흐름 셀 챔버의 크기는 0.24 mm (길이 × 폭 × 깊이) × 23mm × 13 mm의입니다. </li><li> 준비 FAB 성장 매체 (15)를 수정했습니다. 흐름 세포 내에서 영양 그라데이션에서 바이오 필름의 성장을 관찰하기 위해, 하나의 입구에 0.6 μM 포도당 15 매체 FAB을 수정하고, 다른 입구를 통해 어떤 탄소원없이 FAB 매체를 소개 소개합니다. 소독 필터 (기공 크기 = 0.2 μm의) FAB 매체에 추가하기 전에 글루코스 원액 (60 mm)이다. 또한주기 1 FAB 매체 오토 클레이브 (액체, 15 분 121 ° C, 17 PSI)을 사용하기 전에. </li><li> 유동 시스템을 소독. 접종하기 전에, 총 흐름 (매체 병, 튜브, 기포 트랩, 유동 세포) 플로우 셀의 상류에 위치 (일회용 및 사전 멸균) 플라스틱 삼방 밸브를 제외하고, 사이클 1을 사용하여 오토 클레이브. (방법 3 밸브는 셀 (C)을 주입하기 위해 사용된다ulture, 형광 추적 및 마이크로 비드.) 조립시 오염을 방지 알루미늄 호일 또는 고압 증기 멸균 전에 오토 클레이브 가방과 함께 모든 튜브 및 커넥터를 막지합니다. </li><li> 흐름 시스템을 연결합니다. 신중 흐름 전지 시스템의 구성 요소를 조립 (유동 시스템 어셈블리 비디오 참조)과 정밀하게 유량을 제어하는​​ 연동 펌프를 통하여 플로우 셀에 성장 배지를 제공한다. </li><li> P.의 식민지를 전송하여 접종 세포 배양을 준비 녹농균 또는 E. LB 플레이트에서 3 LB 배지 ㎖의 225 rpm으로 37 ° C에서 문화 O / N을 흔들 대장균. 최종 OD 600 멸균 수 1 ㎖ 중의 O / N 세포 배양을 희석 = 0.01로 접종. (문화 및 오염을 피하기 위해 층류 후드에서 박테리아 희석). </li><li> 등가 OD (600)를 1ml 1 = 0.01 각각의 세균에 대해 : 혼합 종 생물막으로 실험을 위해, (1)의 비율로 두 세균 배양 물을 희석. </li><li> 플로우 셀을 접종한다. 삼방 밸브로부터 플로우 셀 흡입구 균액 1ml를 주입한다. 주입 후, 균체 커버 유리에 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 흐름을 일시 정지. (흐름 세포가 일시 중단 세포가 커버 슬립에 정착 할 수 있도록 아래로 커버 슬립면이 배치되어 있는지 확인합니다.) </li><li> 1 시간 후, 흐름을 재개하고 3 일간 각 입구 0.03 ㎖ / 분의 일정한 속도로 플로우 셀에 성장 배지를 펌핑. </li></ol> 공 초점 현미경을 사용하여 영양소 그라디언트에 응답 2. 특성화 바이오 필름 개발 참고 : P. 녹농균은 구조적으로 발현 GFP 군데 있지만, E. 할 수 있습니다 혼합 종의 바이오 필름에서 대장균이 대조 염색에 의해 촬영해야합니다. <ol><li> 공 초점 현미경을 사용하여 3 일 생물막 (biofilm)을 준수하십시오. 대표 결과, 63X의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 생물막을 관찰합니다. 이미징에 앞서, 마크커버 유리 측의 격자 이중 입구 유동 셀. (이 그리드의 목적은 실험자가 플로우 셀 챔버 내에 이미징 영역을 찾을 수 있도록하는 것이다.) </li><li> 이러한 STYO (62), 990 μL에 원액 (1 ㎜)의 물을 소독 한 다음 천천히 주사기로를 사용하여 희석 얼룩을 주입 등 녹색 형광 핵산 얼룩 등의 세포 투과 적색 형광 핵산 얼룩의 10 μl를 희석, Counterstain과려면 상류 삼방 밸브로부터 플로우 셀 챔버. 정체 유동 세포를 유지하고 30 분 동안 어두운 데에서, 다음 15 분 동안 결합​​되지 않은 얼룩을 씻어 흐름을 재개. </li><li> 공 초점 이미징을 수행합니다. 여기에 대한 488 nm의 아르곤 레이저와 GFP (500-535 nm의)과 (녹색 형광 핵산 얼룩에 대한, 650 ~ 750 ㎚) 핵산 얼룩을위한 채널을 수집 방출을 활성화합니다. 밝고 깨끗한 이미지를 가지고 두 채널에 대한 이득 및 오프셋을 조정합니다. 선택 XYZ 동시 영상 모드. IDEN하기 위해 Z-컨트롤 노브를 사용하여필드 생물막의 하단과 상단을 검사에서 발견. 3-D 이미지를 취득하는 스택 0.5 ㎛ 인 Z-단계를 설정한다. (화상 취득 네 라인 평균을 사용하여 높은 화상 품질을 보장​​하기 위해). </li><li> 세 개에서 공간적 플로우 셀 내의 생물막 개발 패턴 화상 생물막 매핑 자세히 길이 (X) 흐름 세포 유입을 따라 거리를,도 1에 도시 된 바와 같이 세 개의 횡 방향 (y)에, 부과 영양 그라데이션 상대 위치 . </li></ol> 보수적 형광 추적기의 주사 3. 특성화 내부 용질 전송 참고 사항 : Cy5에 같은 보수적 형광 트레이서는, 생물막 내부 용질 수송 패턴을 특징 짓는 데에 이용 될 수있다. <ol><li> 원액으로 ㎖의 10 ㎎ / 최종 농도 Cy5에 물 (모노 반응성 NHS 에스테르) 녹인다. -20 ° C 냉장고에 Cy5의 주식 솔루션을 저장합니다. 참고 : Cy5의 빛 - sensit이기 때문에필자, 상점, 희석 어두운 Cy5의 용액을 주입. </li><li> 형광 탐침의 주사에 앞서, (63X 대물 렌즈)와 공 촛점 현미경으로 3 일 생물막의 3-D 화상을 스택. (생물막 식민지의 넓은 지역 염료 전송의 시계열 관측에 적합하다.) (그림 5A 참조) 또한 이미지에 잘 구분 식민지와 Z 평면을 선택합니다. </li><li> 각 Cy5에 주입 실험을 위해, 20 ㎍ / ml의 Cy5의 농도를 갖는 주사 용액을 수득 물을 998 μL의 멸균 Cy5의 스톡 용액 2 μl를 희석. </li><li> 흐름을 일시 중지 및 3 방향 밸브를 통해 주사기를 사용하여 플로우 셀의 상류에 Cy5의 용액을 주입하는 펌프를 중지. (이는 주입하면서 유로 들어가는 기포를 방지하는 것이 중요하다. 버블 트랩 다시 주입 동안 열려 유지되어야한다.) </li><li> Cy5의 용액을 주입 한 후, 3 방향 밸브를 조정, 거품 트랩을 닫고 다시 시작플로우 셀에 주입 Cy5의 솔루션을 제공하는 펌프. </li><li> xyt하는 공 초점 영상 모드를 전환합니다. 동시 촬영 모드에서 Cy5에와 GFP 채널을 활성화합니다. (레이저 강도 이득 및 오프셋) Cy5의 강도에 촛점 설정을 조정 정량 중요한 신호를, 포화 방지하기 위해. (높은 시간 해상도는 염료 침투를 가시화하는 것이 바람직하다. 그러나, 빠른 스캔 이미지 품질을 감소시킨다.) 이미징의 시간 해상도 및 화상 품질의 균형을 적절한 주사 속도와 라인 평균을 선택한다. 이 프로토콜을위한 네 가지의 라인 평균 0.15 Hz의 프레임 레이트를 사용한다. </li><li> (아직 0.03 ㎖ / 분의 유속으로)로 플로우 셀을 제공하는 Cy5의 흐름을 재개. 동시에 시계열 공 초점 영상을 시작합니다. </li><li> 반경 방향으로 2-D 원형 생물막 콜로니 내에 Cy5의 강도를 평균하여 Cy5의 침투를 정량화. 제 생물막 클러스터의 에지를 식별, 평균 다음 클러스터의 2-D 섹션 거리 맵을 생성그리고 최종적 Cy5의 강도의 평균 반경 패턴 침투 곡선 (도 6 참조)를 생성한다. <ol><li> 계산 3.8 단계 실현하기 위해, BioSPA (바이오 필름의 공간 패턴 분석) 소프트웨어 패키지 (게시되지 않은, 소프트웨어 패키지 및 수동 요청시 사용 가능) 또는 다른 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. </li><li> BioSPA를 사용하려면 먼저 BioSPA로 설정 이미지를 가져옵니다. 그런 다음 이진 이미지를 만들기 위해 GFP와 Cy5의 채널에 대한 적절한 임계 값을 선택합니다. 분석 / 계산 메뉴에서 고급 분석하고 확산 분석을 선택합니다. 클러스터의 에지를 정의하는 관심 영역 (ROI)의 영역으로서 하나의 클러스터를 선택하는 다각형 도구를 사용하여 GFP 채널을 사용한다. </li><li> 더블 확산 분석을 수행하기 위해 선택한 생물막 클러스터를 클릭합니다. 확산 분석 결과를 저장하고 검량선을 이용하여 Cy5의 농도와 Cy5의 강도를 교정. <ol><li> Cy5에의 conce 위에 Cy5의 강도를 측정, Cy5의 농도 검량선을 생성하려면공 초점 현미경 아래 ntration 구배. (Cy5의 강도와 농도는 선형 관계가 있습니다.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 현황 형광 발색 입자의 주변 환경 유동장 특성화 주 : 형광 마이크로 비드와 같은 형광 물질, 생물막 주위 유동장을 특성화하는데 사용될 수있다. 생물막 주위 유동장 입자 유속계 추적 소프트웨어를 사용하여 입자 위치의 시계열 관측치로부터 계산 될 수있다. 여기에 표시된 결과는 스트림 2.02 소프트웨어 패키지 (16) (소프트웨어 다운로드 및에서 사용 가능한 사용자 설명서 얻었다 <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> 0.2 %의 최종 고형분 농도 0.5 ml의 최종 부피의 멸균 형광 마이크로 비드 (직경 ~ 1 ㎛)를 희석. 소용돌이는 마이크로 비드가 있는지 확인잘 분산되어있다. </li><li> 주입 및 단계 3.3-3.5에서 절차에 따라 유동 셀에 희석 형광 마이크로 비드를 제공합니다. 입자 경로의 정확한 추적이 (이 종이 입자 조회 결과 0.01 ㎖ / 시간) 상대적으로 낮은 유속을 사용할 수있게한다. </li><li> 하나의 Z-슬라이스에서 입자의 움직임을 추적하고 시계열 이미지를 취할 모드를 xyt에 촛점 설정을 전환합니다. (1 Hz의 프레임 레이트는 본 문서에서 나타낸 대표적인 결과를 사용 하였다.) 반복 입자 주입 및 이미지를 상이한 Z 위치에서 3-D 흐름 필드를 생성한다. </li><li> 전처리 시계열 (가능한 소프트웨어 다운로드 및 사용 설명서가 ImageJ에 배경 형광 신호 (이미지 세트의 처음에서 취득 된 화상 신호)를 감산함으로써 공 초점 화상 <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">을 http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 또는 다른 프로그램. </li><li> ImageJ에에서 이미지 세트의 첫 번째 이미지를 열고 이미지 세트를 가져옵니다. 프로세스에서 / 이미지 칼슘lculator, 이미지 세트로부터 첫 번째 이미지를 뺀다. 사전 처리 된 이미지 설정을 저장합니다. </li><li> 스트림 2.02의 흐름 벡터, 수입 시계열 공 초점 이미지를 계산합니다. &quot;열기 프로세스보기&quot;에서 선택하고 &quot;입자를 식별&quot;실행합니다. 입자를 식별하기 위해 적절한 임계 값을 사용합니다. 1 μm의 입자의 최소 및 최대 직경 임계 값 0.5, 5 μm의를 사용합니다. </li><li> 그런 다음 &quot;열기 프로세스보기&quot;에서 선택하고 입자 경로를 생성하기 위해 &quot;PTV 분석 파이프 라인&quot;을 실행합니다. 그들은 입자의 움직임을 표현 있는지 확인하기 위해 입자 경로를 확인합니다. 마지막으로, 선택하고 흐름 벡터지도를 생성하기 위해 &quot;속도 필드 만들기&quot;를 실행합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

생물막 화학 그라디언트에 대한 응답으로, 주변의 흐름 미세 환경에 생물막 성장, 그리고 내부 전송 제한으로 인한 생물막 이질성의 효과 : 우리는 세 가지 중요한 바이오 필름 - 환경 상호 작용을 특성화하는 방법의 제품군을 보여 주었다. 우리는 먼저 생물막 개발 잘 정의 된 화학 구배를 부과하는 신규 한 마이크로 유체 유동 셀의 사용을 나타내었다. 플로우 셀 내에 잘 정?...

세포 외 고분자 매트릭스 1로 묶인 세포 집합체 - 미생물 표면과 형태의 바이오 필름에 부착합니다. 바이오 필름은 세포 대사 2,3 내부 용질의 전송 제한 및 공간 변화의 조합으로 인한 극적인 공간 이질성을 가지고 있기 때문에 바이오 필름은 매우 다르게 각각의 미생물 세포에서 작동합니다. 산소와 영양소 농도는 크게 바이오 필름 ​​및 유체 및 추가 생물막 2 내에 고갈 얻을 주변 사이의 인터페이스에서 감소. 생물막 호흡과 단백질 합성 공간적 변형, 국소 산소 및 영양분이 가능 여부에 대한 응답으로서 일어날 수있다. 수생 및 토양 환경에서 대부분의 박테리아는 생물막에 거. 천연 바이오 필름은 탄소와 질소 순환 및 금속 4,5 감소를 포함하여 중요한 생지 화학 과정을 수행한다. 임상, 바이오 필름 형성이 응 답이다장기간 폐 요로 감염 6 지나치지. 바이오 필름에 세포가 자신의 플랑크톤 대응 (6)에 비해 항생제에 매우 높은 저항을 가지고 있기 때문에 바이오 필름 ​​관련 감염은 매우 문제가있다. 바이오 필름은 다양한 설정에 중요하기 때문에, 연구의 상당량 생물막 활동 및 생물막 공간적 이질성 및 주변의 미세 환경을 제어하는​​ 환경 적 요인을 이해에 집중되어왔다. 이전의 연구 개발 생물막 강하게 환경 요인들에 의해 조절되는 것을 발견 하였다 : 생물막 다양한 유동 조건 하에서 상이한 모폴로지 개발; 산소와 영양소의 가용성에 영향을 미치는 바이오 필름 형태; 및 유체 전단 응력은 표면에 플랑크톤 세포의 부착과 생물막 7-9에서 세포의 분리에 영향을 미칩니다. 또한, 외부 유동 조건은 기판 INT의 전달에 영향을 미친다O 및 바이오 필름 ​​(10) 내의. 생물막의 성장은 또한 물리적 및 화학적 조건을 둘러싼 바꾼다. 예를 들어, 생물막의 성장은 산소와 영양분이 고갈의 로컬 리드; 바이오 필름은 주변 환경 (11)으로부터의 무기 및 유기 화합물을 축적; 생물막 클러스터는 흐름과 증가 표면 마찰 12,13 전환. 생물막들은 매우 복잡한 방식으로 주변 환경과 상호 작용하기 때문에, 동시에 생물막 특성 및 환경 조건에 대한 정보를 얻기 위해 중요하며, 다 분야 접근법 종합적 생물막 인바 상호 작용을 특성화하기 위해 이용 될 필요가있다. 여기에서 우리는 부과 영양 그라데이션에서 단일 종 및 듀얼 종 생물막 내 미생물 성장에 공간 패턴을 특성화하고 지역 화학 및 유체 미세 환경의 결과 수정을 관찰하기 위해 통합 된 방법의 일련을 제시한다. 우리는 전나무ST는 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰하는 최근에 개발 된 이중 입구 미세 유체 흐름 세포의 사용을 기술한다. 우리는 그 다음 영양 조건 범위 하에서 생물막 세균, 녹농균 및 대장균, 두 종의 성장을 관찰하는 미세 유체 흐름이 셀의 사용을 입증한다. 우리는 생물막 식민지에 형광 추적 전파의 현장 시각화 정량적으로 생물막 (biofilm)에 용질 수송의 패턴을 평가하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 초점 현미경 하에서 수행 마이크로 입자 추적 속도계는, 생물막의 주위에 성장하는 지역 흐름 필드를 취득 할 수있는 방법을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Pump Tubing 0.50&amp;nbsp;mm OVC, Orange/Yellow</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock w/ Swivel Male Luer lock</td><td>Smiths Medical&amp;nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Pyrex Medium Bottle, 1&amp;nbsp;L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>C-FLEX Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>1 ml TB Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Polymer Tubing</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td><td>Clay Adams</td><td>427564</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>HACH</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Syringe filters - sterile (0.2 &amp;mu;m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Flow cell setup and inoculation</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Monobasic potassium phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Magnisium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Calcium sulfate dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Iron(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Zinc sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Sodium molybdate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Growth media</td></tr><tr><td>TCS SP2 Confocal Microscopy</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Fluorescent imaging</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>Streams 2.02</td><td>University of Cantebury</td><td></td><td>Image Processing</td></tr></tbody></table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

바이오 필름은 복잡한 구조를 가지고 중요한 공간 이질성을 생산 표면에 부착 된 미생물 커뮤니티입니다. 생물막 개발이 강하게 주변 유동 및 영양 환경에 의해 조절된다. 바이오 필름 성장은 복잡한 흐름 필드와 용질 수송 패턴을 생성하여 로컬 미세 환경의 이질성을 증가시킨다. 바이오 필름 ​​및 로컬 마이크로 서식지 사이에 생물막 (biofilm)과의 상호 작용에서 이질성의 개발을 조사하기 위해, 우리는 녹농균의 모노 종의 바이오 필름 ​​및 P.의 듀얼 종의 바이오 필름을 성장 미세 유체 흐름 세포에 영양 그라디언트에서 녹농균과 대장균. 우리는 흐름 세포 내에서 영양소 그라디언트의 작성 및 성장과 이러한 조건에서 바이오 필름 개발을 시각화에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 광학적 방법의 시리즈를위한 본 프로토콜은 DISTRI 흐름, 생물막 구조에서 공간 패턴을 정량화하기시킴 주위에 바이오 필름, 대량 전송을 통한 생물막 식민지 내에서. 이러한 방법은 바이오 필름과 서식지의 이질성의 공동 개발에 대한 포괄적 조사를 지원합니다.

이중 입구 마이크로 유체 유동은 유동 셀 챔버 내에 두 용액의 혼합에 의해 형성 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰 할 수있다. 그 결과 화학 그라데이션 이전 염료 주입에 의해 관찰과 노래 등. (14)에 의해 구체적으로 분석되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이 부드러운 농도 기울기는, 횡 방향으로 형성했다. 농도 프로파일은 입구 근처 험했다 의한 확산 <s...

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Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K 조회수.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

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Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

연구

유전학

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

환경과학

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

면역학 및 감염병학

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

생체공학

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

생물학

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

In vitro에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델 시스템

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under different growth conditions and after treatment with matrix modifying molecules. To better quantitate the material properties of 3D biofilms, an experimental and computational workflow was developed and applied to examine differences between Enterococcus faecalis, Salmonella enterica serotype Typhimurium and Escherichia coli biofilms as well as the role of the amyloid curli in confirming rigidity to Enterobacteriaceae biofilms. The spatio-temporal dynamics of 1 &#181;m carboxylate beads in biofilms were tracked in 20 &#181;m 3D biofilms over 20 minutes. The 4D image stacks were processed using the Mosaic plugin in ImageJ to produce 3D trajectory data of bead movement. This trajectory data was analyzed with a newly developed Bead Evaluator toolbox, where movement data, including trajectory lifespans, bead velocities, cell densities along trajectories, and bounding box information were computed and stored in csv-files. This paper presents the workflow from experimental setup and image recording to bead trajectory computation and analysis. The structure of curli-containing biofilms resulted in more stable bead interactions and less bead movement than in curli-mutant and Enterococcal biofilms. Bead movement did not appear strongly dependent on cell density when measuring the bead velocity and trajectory bounding box volume, supporting the hypothesis that other material properties of the biofilms control the bead dynamics. This technique is widely applicable to quantitating differences in biofilms of different matrix compositions as well as biofilms before and after matrix-modifying treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>생물막 재료 이질성의 3차원 분석을 위한 비드 이동 기반 계산 프레임워크

We describe a method for analyzing and quantifying the movement pattern of 1 &#181;m carboxylate beads through heterogeneous bacterial biofilms. Comparison of the movement patterns can be used to quantitate differences in material properties of biofilms.

생물막 재료 이질성의 3차원 분석을 위한 비드 이동 기반 계산 프레임워크

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under ...

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

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