우리는 P.를 제공하기 위해 워싱턴 대학 (시애틀, WA)에서 매트 PARSEK 감사합니다 녹농균 및 E. 스트림 소프트웨어에 대한 액세스를 제공하는 캔터베리 (뉴질랜드) 대학의 대장균 균주와 로저 Nokes. 이 작품은 국립 보건원, 알레르기의 국립 전염병 연구소에서 보조금 R01AI081983에 의해 지원되었다. 공 초점 영상은 노스 웨스턴 생물 이미징 시설 (BIF)에서 수행 하였다.

1. 흐름 전지 설치 및 접종 주 :.에 노래 등 기술 이중 입구 미세 유체 흐름 세포를 사용하여 2014 년 14 생물막 성장한다. 이 플로우 셀은 잘 정의 된 매끄러운 화학적 구배를 생성 할 수있다. 플로우 셀 설계는 이전에 설명 된 노래도 1에 도시 된 셀 제조되는 흐름 등., 2014 (14). 여기서는 상세히 P. 우리의 방법을 사용하여 녹농균 및 E. 대장균은 바이오 필름을 형성하지만, 다른 종은 너무 적합 할 수있다. 우리는 P. 사용 구성 적으로는 녹농균 생물막 개발 모델 생물로서, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 GFP를 PAO1-. 또한, 우리는 E.을 사용 대장균 DH5α는 P. 혼합 종 생물막 (biofilm)을 형성한다 녹농균. P. 녹농균 및 E. 콜라이 균주를 LB 아가 플레이트상에서 성장시켰다. <ol><li> 에 (PDMS) 결합 흐름 세포 사용하여 폴리 디메틸 실록산을 준비14에 기술 된 바와 같이 산소 플라즈마 처리를 통해 유리 커버 슬립. 흐름 셀 챔버의 크기는 0.24 mm (길이 × 폭 × 깊이) × 23mm × 13 mm의입니다. </li><li> 준비 FAB 성장 매체 (15)를 수정했습니다. 흐름 세포 내에서 영양 그라데이션에서 바이오 필름의 성장을 관찰하기 위해, 하나의 입구에 0.6 μM 포도당 15 매체 FAB을 수정하고, 다른 입구를 통해 어떤 탄소원없이 FAB 매체를 소개 소개합니다. 소독 필터 (기공 크기 = 0.2 μm의) FAB 매체에 추가하기 전에 글루코스 원액 (60 mm)이다. 또한주기 1 FAB 매체 오토 클레이브 (액체, 15 분 121 ° C, 17 PSI)을 사용하기 전에. </li><li> 유동 시스템을 소독. 접종하기 전에, 총 흐름 (매체 병, 튜브, 기포 트랩, 유동 세포) 플로우 셀의 상류에 위치 (일회용 및 사전 멸균) 플라스틱 삼방 밸브를 제외하고, 사이클 1을 사용하여 오토 클레이브. (방법 3 밸브는 셀 (C)을 주입하기 위해 사용된다ulture, 형광 추적 및 마이크로 비드.) 조립시 오염을 방지 알루미늄 호일 또는 고압 증기 멸균 전에 오토 클레이브 가방과 함께 모든 튜브 및 커넥터를 막지합니다. </li><li> 흐름 시스템을 연결합니다. 신중 흐름 전지 시스템의 구성 요소를 조립 (유동 시스템 어셈블리 비디오 참조)과 정밀하게 유량을 제어하는​​ 연동 펌프를 통하여 플로우 셀에 성장 배지를 제공한다. </li><li> P.의 식민지를 전송하여 접종 세포 배양을 준비 녹농균 또는 E. LB 플레이트에서 3 LB 배지 ㎖의 225 rpm으로 37 ° C에서 문화 O / N을 흔들 대장균. 최종 OD 600 멸균 수 1 ㎖ 중의 O / N 세포 배양을 희석 = 0.01로 접종. (문화 및 오염을 피하기 위해 층류 후드에서 박테리아 희석). </li><li> 등가 OD (600)를 1ml 1 = 0.01 각각의 세균에 대해 : 혼합 종 생물막으로 실험을 위해, (1)의 비율로 두 세균 배양 물을 희석. </li><li> 플로우 셀을 접종한다. 삼방 밸브로부터 플로우 셀 흡입구 균액 1ml를 주입한다. 주입 후, 균체 커버 유리에 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 흐름을 일시 정지. (흐름 세포가 일시 중단 세포가 커버 슬립에 정착 할 수 있도록 아래로 커버 슬립면이 배치되어 있는지 확인합니다.) </li><li> 1 시간 후, 흐름을 재개하고 3 일간 각 입구 0.03 ㎖ / 분의 일정한 속도로 플로우 셀에 성장 배지를 펌핑. </li></ol> 공 초점 현미경을 사용하여 영양소 그라디언트에 응답 2. 특성화 바이오 필름 개발 참고 : P. 녹농균은 구조적으로 발현 GFP 군데 있지만, E. 할 수 있습니다 혼합 종의 바이오 필름에서 대장균이 대조 염색에 의해 촬영해야합니다. <ol><li> 공 초점 현미경을 사용하여 3 일 생물막 (biofilm)을 준수하십시오. 대표 결과, 63X의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 생물막을 관찰합니다. 이미징에 앞서, 마크커버 유리 측의 격자 이중 입구 유동 셀. (이 그리드의 목적은 실험자가 플로우 셀 챔버 내에 이미징 영역을 찾을 수 있도록하는 것이다.) </li><li> 이러한 STYO (62), 990 μL에 원액 (1 ㎜)의 물을 소독 한 다음 천천히 주사기로를 사용하여 희석 얼룩을 주입 등 녹색 형광 핵산 얼룩 등의 세포 투과 적색 형광 핵산 얼룩의 10 μl를 희석, Counterstain과려면 상류 삼방 밸브로부터 플로우 셀 챔버. 정체 유동 세포를 유지하고 30 분 동안 어두운 데에서, 다음 15 분 동안 결합​​되지 않은 얼룩을 씻어 흐름을 재개. </li><li> 공 초점 이미징을 수행합니다. 여기에 대한 488 nm의 아르곤 레이저와 GFP (500-535 nm의)과 (녹색 형광 핵산 얼룩에 대한, 650 ~ 750 ㎚) 핵산 얼룩을위한 채널을 수집 방출을 활성화합니다. 밝고 깨끗한 이미지를 가지고 두 채널에 대한 이득 및 오프셋을 조정합니다. 선택 XYZ 동시 영상 모드. IDEN하기 위해 Z-컨트롤 노브를 사용하여필드 생물막의 하단과 상단을 검사에서 발견. 3-D 이미지를 취득하는 스택 0.5 ㎛ 인 Z-단계를 설정한다. (화상 취득 네 라인 평균을 사용하여 높은 화상 품질을 보장​​하기 위해). </li><li> 세 개에서 공간적 플로우 셀 내의 생물막 개발 패턴 화상 생물막 매핑 자세히 길이 (X) 흐름 세포 유입을 따라 거리를,도 1에 도시 된 바와 같이 세 개의 횡 방향 (y)에, 부과 영양 그라데이션 상대 위치 . </li></ol> 보수적 형광 추적기의 주사 3. 특성화 내부 용질 전송 참고 사항 : Cy5에 같은 보수적 형광 트레이서는, 생물막 내부 용질 수송 패턴을 특징 짓는 데에 이용 될 수있다. <ol><li> 원액으로 ㎖의 10 ㎎ / 최종 농도 Cy5에 물 (모노 반응성 NHS 에스테르) 녹인다. -20 ° C 냉장고에 Cy5의 주식 솔루션을 저장합니다. 참고 : Cy5의 빛 - sensit이기 때문에필자, 상점, 희석 어두운 Cy5의 용액을 주입. </li><li> 형광 탐침의 주사에 앞서, (63X 대물 렌즈)와 공 촛점 현미경으로 3 일 생물막의 3-D 화상을 스택. (생물막 식민지의 넓은 지역 염료 전송의 시계열 관측에 적합하다.) (그림 5A 참조) 또한 이미지에 잘 구분 식민지와 Z 평면을 선택합니다. </li><li> 각 Cy5에 주입 실험을 위해, 20 ㎍ / ml의 Cy5의 농도를 갖는 주사 용액을 수득 물을 998 μL의 멸균 Cy5의 스톡 용액 2 μl를 희석. </li><li> 흐름을 일시 중지 및 3 방향 밸브를 통해 주사기를 사용하여 플로우 셀의 상류에 Cy5의 용액을 주입하는 펌프를 중지. (이는 주입하면서 유로 들어가는 기포를 방지하는 것이 중요하다. 버블 트랩 다시 주입 동안 열려 유지되어야한다.) </li><li> Cy5의 용액을 주입 한 후, 3 방향 밸브를 조정, 거품 트랩을 닫고 다시 시작플로우 셀에 주입 Cy5의 솔루션을 제공하는 펌프. </li><li> xyt하는 공 초점 영상 모드를 전환합니다. 동시 촬영 모드에서 Cy5에와 GFP 채널을 활성화합니다. (레이저 강도 이득 및 오프셋) Cy5의 강도에 촛점 설정을 조정 정량 중요한 신호를, 포화 방지하기 위해. (높은 시간 해상도는 염료 침투를 가시화하는 것이 바람직하다. 그러나, 빠른 스캔 이미지 품질을 감소시킨다.) 이미징의 시간 해상도 및 화상 품질의 균형을 적절한 주사 속도와 라인 평균을 선택한다. 이 프로토콜을위한 네 가지의 라인 평균 0.15 Hz의 프레임 레이트를 사용한다. </li><li> (아직 0.03 ㎖ / 분의 유속으로)로 플로우 셀을 제공하는 Cy5의 흐름을 재개. 동시에 시계열 공 초점 영상을 시작합니다. </li><li> 반경 방향으로 2-D 원형 생물막 콜로니 내에 Cy5의 강도를 평균하여 Cy5의 침투를 정량화. 제 생물막 클러스터의 에지를 식별, 평균 다음 클러스터의 2-D 섹션 거리 맵을 생성그리고 최종적 Cy5의 강도의 평균 반경 패턴 침투 곡선 (도 6 참조)를 생성한다. <ol><li> 계산 3.8 단계 실현하기 위해, BioSPA (바이오 필름의 공간 패턴 분석) 소프트웨어 패키지 (게시되지 않은, 소프트웨어 패키지 및 수동 요청시 사용 가능) 또는 다른 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. </li><li> BioSPA를 사용하려면 먼저 BioSPA로 설정 이미지를 가져옵니다. 그런 다음 이진 이미지를 만들기 위해 GFP와 Cy5의 채널에 대한 적절한 임계 값을 선택합니다. 분석 / 계산 메뉴에서 고급 분석하고 확산 분석을 선택합니다. 클러스터의 에지를 정의하는 관심 영역 (ROI)의 영역으로서 하나의 클러스터를 선택하는 다각형 도구를 사용하여 GFP 채널을 사용한다. </li><li> 더블 확산 분석을 수행하기 위해 선택한 생물막 클러스터를 클릭합니다. 확산 분석 결과를 저장하고 검량선을 이용하여 Cy5의 농도와 Cy5의 강도를 교정. <ol><li> Cy5에의 conce 위에 Cy5의 강도를 측정, Cy5의 농도 검량선을 생성하려면공 초점 현미경 아래 ntration 구배. (Cy5의 강도와 농도는 선형 관계가 있습니다.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 현황 형광 발색 입자의 주변 환경 유동장 특성화 주 : 형광 마이크로 비드와 같은 형광 물질, 생물막 주위 유동장을 특성화하는데 사용될 수있다. 생물막 주위 유동장 입자 유속계 추적 소프트웨어를 사용하여 입자 위치의 시계열 관측치로부터 계산 될 수있다. 여기에 표시된 결과는 스트림 2.02 소프트웨어 패키지 (16) (소프트웨어 다운로드 및에서 사용 가능한 사용자 설명서 얻었다 <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> 0.2 %의 최종 고형분 농도 0.5 ml의 최종 부피의 멸균 형광 마이크로 비드 (직경 ~ 1 ㎛)를 희석. 소용돌이는 마이크로 비드가 있는지 확인잘 분산되어있다. </li><li> 주입 및 단계 3.3-3.5에서 절차에 따라 유동 셀에 희석 형광 마이크로 비드를 제공합니다. 입자 경로의 정확한 추적이 (이 종이 입자 조회 결과 0.01 ㎖ / 시간) 상대적으로 낮은 유속을 사용할 수있게한다. </li><li> 하나의 Z-슬라이스에서 입자의 움직임을 추적하고 시계열 이미지를 취할 모드를 xyt에 촛점 설정을 전환합니다. (1 Hz의 프레임 레이트는 본 문서에서 나타낸 대표적인 결과를 사용 하였다.) 반복 입자 주입 및 이미지를 상이한 Z 위치에서 3-D 흐름 필드를 생성한다. </li><li> 전처리 시계열 (가능한 소프트웨어 다운로드 및 사용 설명서가 ImageJ에 배경 형광 신호 (이미지 세트의 처음에서 취득 된 화상 신호)를 감산함으로써 공 초점 화상 <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">을 http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 또는 다른 프로그램. </li><li> ImageJ에에서 이미지 세트의 첫 번째 이미지를 열고 이미지 세트를 가져옵니다. 프로세스에서 / 이미지 칼슘lculator, 이미지 세트로부터 첫 번째 이미지를 뺀다. 사전 처리 된 이미지 설정을 저장합니다. </li><li> 스트림 2.02의 흐름 벡터, 수입 시계열 공 초점 이미지를 계산합니다. &quot;열기 프로세스보기&quot;에서 선택하고 &quot;입자를 식별&quot;실행합니다. 입자를 식별하기 위해 적절한 임계 값을 사용합니다. 1 μm의 입자의 최소 및 최대 직경 임계 값 0.5, 5 μm의를 사용합니다. </li><li> 그런 다음 &quot;열기 프로세스보기&quot;에서 선택하고 입자 경로를 생성하기 위해 &quot;PTV 분석 파이프 라인&quot;을 실행합니다. 그들은 입자의 움직임을 표현 있는지 확인하기 위해 입자 경로를 확인합니다. 마지막으로, 선택하고 흐름 벡터지도를 생성하기 위해 &quot;속도 필드 만들기&quot;를 실행합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

생물막 화학 그라디언트에 대한 응답으로, 주변의 흐름 미세 환경에 생물막 성장, 그리고 내부 전송 제한으로 인한 생물막 이질성의 효과 : 우리는 세 가지 중요한 바이오 필름 - 환경 상호 작용을 특성화하는 방법의 제품군을 보여 주었다. 우리는 먼저 생물막 개발 잘 정의 된 화학 구배를 부과하는 신규 한 마이크로 유체 유동 셀의 사용을 나타내었다. 플로우 셀 내에 잘 정?...

세포 외 고분자 매트릭스 1로 묶인 세포 집합체 - 미생물 표면과 형태의 바이오 필름에 부착합니다. 바이오 필름은 세포 대사 2,3 내부 용질의 전송 제한 및 공간 변화의 조합으로 인한 극적인 공간 이질성을 가지고 있기 때문에 바이오 필름은 매우 다르게 각각의 미생물 세포에서 작동합니다. 산소와 영양소 농도는 크게 바이오 필름 ​​및 유체 및 추가 생물막 2 내에 고갈 얻을 주변 사이의 인터페이스에서 감소. 생물막 호흡과 단백질 합성 공간적 변형, 국소 산소 및 영양분이 가능 여부에 대한 응답으로서 일어날 수있다. 수생 및 토양 환경에서 대부분의 박테리아는 생물막에 거. 천연 바이오 필름은 탄소와 질소 순환 및 금속 4,5 감소를 포함하여 중요한 생지 화학 과정을 수행한다. 임상, 바이오 필름 형성이 응 답이다장기간 폐 요로 감염 6 지나치지. 바이오 필름에 세포가 자신의 플랑크톤 대응 (6)에 비해 항생제에 매우 높은 저항을 가지고 있기 때문에 바이오 필름 ​​관련 감염은 매우 문제가있다. 바이오 필름은 다양한 설정에 중요하기 때문에, 연구의 상당량 생물막 활동 및 생물막 공간적 이질성 및 주변의 미세 환경을 제어하는​​ 환경 적 요인을 이해에 집중되어왔다. 이전의 연구 개발 생물막 강하게 환경 요인들에 의해 조절되는 것을 발견 하였다 : 생물막 다양한 유동 조건 하에서 상이한 모폴로지 개발; 산소와 영양소의 가용성에 영향을 미치는 바이오 필름 형태; 및 유체 전단 응력은 표면에 플랑크톤 세포의 부착과 생물막 7-9에서 세포의 분리에 영향을 미칩니다. 또한, 외부 유동 조건은 기판 INT의 전달에 영향을 미친다O 및 바이오 필름 ​​(10) 내의. 생물막의 성장은 또한 물리적 및 화학적 조건을 둘러싼 바꾼다. 예를 들어, 생물막의 성장은 산소와 영양분이 고갈의 로컬 리드; 바이오 필름은 주변 환경 (11)으로부터의 무기 및 유기 화합물을 축적; 생물막 클러스터는 흐름과 증가 표면 마찰 12,13 전환. 생물막들은 매우 복잡한 방식으로 주변 환경과 상호 작용하기 때문에, 동시에 생물막 특성 및 환경 조건에 대한 정보를 얻기 위해 중요하며, 다 분야 접근법 종합적 생물막 인바 상호 작용을 특성화하기 위해 이용 될 필요가있다. 여기에서 우리는 부과 영양 그라데이션에서 단일 종 및 듀얼 종 생물막 내 미생물 성장에 공간 패턴을 특성화하고 지역 화학 및 유체 미세 환경의 결과 수정을 관찰하기 위해 통합 된 방법의 일련을 제시한다. 우리는 전나무ST는 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰하는 최근에 개발 된 이중 입구 미세 유체 흐름 세포의 사용을 기술한다. 우리는 그 다음 영양 조건 범위 하에서 생물막 세균, 녹농균 및 대장균, 두 종의 성장을 관찰하는 미세 유체 흐름이 셀의 사용을 입증한다. 우리는 생물막 식민지에 형광 추적 전파의 현장 시각화 정량적으로 생물막 (biofilm)에 용질 수송의 패턴을 평가하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 초점 현미경 하에서 수행 마이크로 입자 추적 속도계는, 생물막의 주위에 성장하는 지역 흐름 필드를 취득 할 수있는 방법을 보여준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

바이오 필름은 복잡한 구조를 가지고 중요한 공간 이질성을 생산 표면에 부착 된 미생물 커뮤니티입니다. 생물막 개발이 강하게 주변 유동 및 영양 환경에 의해 조절된다. 바이오 필름 성장은 복잡한 흐름 필드와 용질 수송 패턴을 생성하여 로컬 미세 환경의 이질성을 증가시킨다. 바이오 필름 ​​및 로컬 마이크로 서식지 사이에 생물막 (biofilm)과의 상호 작용에서 이질성의 개발을 조사하기 위해, 우리는 녹농균의 모노 종의 바이오 필름 ​​및 P.의 듀얼 종의 바이오 필름을 성장 미세 유체 흐름 세포에 영양 그라디언트에서 녹농균과 대장균. 우리는 흐름 세포 내에서 영양소 그라디언트의 작성 및 성장과 이러한 조건에서 바이오 필름 개발을 시각화에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 광학적 방법의 시리즈를위한 본 프로토콜은 DISTRI 흐름, 생물막 구조에서 공간 패턴을 정량화하기시킴 주위에 바이오 필름, 대량 전송을 통한 생물막 식민지 내에서. 이러한 방법은 바이오 필름과 서식지의 이질성의 공동 개발에 대한 포괄적 조사를 지원합니다.

이중 입구 마이크로 유체 유동은 유동 셀 챔버 내에 두 용액의 혼합에 의해 형성 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰 할 수있다. 그 결과 화학 그라데이션 이전 염료 주입에 의해 관찰과 노래 등. (14)에 의해 구체적으로 분석되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이 부드러운 농도 기울기는, 횡 방향으로 형성했다. 농도 프로파일은 입구 근처 험했다 의한 확산 <s...

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Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K 조회수.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

연구

생체공학

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

건조 공기-LC 인터페이스에 Megamolecular 생체 고분자의 자체 통합을위한 방법

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...