This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

모든 동물 실험은 프랑스 농업 장관과 유럽 연합 (EU)의 지침에 따라 파스퇴르 연구소 안전위원회의 승인되었습니다. 1. 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 준비합니다 <ol><li> 구체적인 역 전사 완충액 5.0 ㎕의 낮은 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) TE 완충액 (10 mM의 TE 용액의 pH 8, 0.1 mM의 EDTA 용액 13 μl를 첨가하여 1.5 ㎖의 튜브에 미리 증폭 믹스 준비 0.2 μM 여과 )과의 Taq DNA 중합 효소 웰 당 (도 1a 0.2 μL). </li><li> 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에 미리 증폭 믹스의 6.5 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 판을 96 웰 단일 셀 정렬 판이다. 참고 : 전자 피펫을 사용하여이 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 정확하고 재현성있는 볼륨 측정을 가능하게하고 시간을 절약 할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig1.jpg" /> <stroNG&gt; 그림 1 : 96 웰 플레이트 장착 절차. 이 실험의 나머지 부분에 영향을 미칠로 96 웰 플레이트의 로딩은 매우 신중하게 이루어져야한다. (a) 판을 정렬 96 웰 단일 셀에서 미리 증폭 믹스는 0.2X 분석 혼합 한 후, 제 분배된다. (b) 각 단일 셀의 위치의 기록은 스프레드 시트에 유지되어야한다. 잘없이 셀은 &quot;아니오 입력&quot;음이라고하는 제어로 사용될 수있다. 두 행은 cDNA를 희석 (하나의 셀에 105 세포의 당량 순차 하나 인 열 희석)와 프라이머 효율을 제어하기 위해 절약 할 수있다. 96- 웰 분석 플레이트에서 (c)는, 상기 분석 로딩 시약은 프라이머를 첨가 한 후, 우선 분배된다. 각각의 프라이머 위치의 레이아웃을 유지하는 것을 잊지 마십시오. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </A&gt; <ol start="3"><li> 프라이머 각 1.4 μl를 첨가하여 1.5 ㎖의 튜브에서 0.2X 검정 믹스 준비 (프라이머를 20 배, 최대 48 개의 상이한 프로브를 표 1 참조). 낮은 EDTA TE 버퍼 140 μL에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 프리 앰프 믹스를 함유하는 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트의 48 웰에 0.2X 검정 믹스 2.5 μl를 배포한다. 주 : 9 μL되어야 96- 웰 샘플 플레이트의 각 웰의 최종 부피. </li><li> 커버 필름과 판을 밀봉합니다. 판 와동 45 초 동안 280 XG에 그것을 스핀 다운. -20 ° C에서 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 단일 세포 해리 <ol><li> 공동이 전달 시스템을 사용하여, 저산소증 마우스를 안락사. 해부 접시에 마우스를 수정하고 가위를 사용하여 길이 방향으로 복강을 엽니 다. </li><li> 간에서 ILCs을 복구 할 수 있습니다. <ol><li> 간 분리에 앞서, 플러시 리브세포를 어 순환. <ol><li> 간문맥을 가지고, 작은 마우스의 왼쪽 대장 이동; 포털 정맥은 복강에서 가장 큰 정맥으로 나타납니다. </li><li> 10 mL의 주사기 및 0.45 mm의 바늘로, 문맥을 통해 인산염 완충 식염수 매체 (PBS)로 세척 간. 간 세척을 용이하게하기 위해, 가위로 위 동맥을 잘라. </li><li> 담낭을 제거하려면 집게로 담낭의 기본 끼와 가위로 간에서 분리. </li><li> 간을 분리하려면 집게로 간의 기반을 꼬집어, 가위를 사용하여 복강의 나머지 간을 구분합니다. </li><li> 로스웰 파크 메모리얼 연구소 배지 5 ㎖ (RPMI) 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 도공 튜브 간을 이동. </li></ol></li></ol></li><li> 유봉을 사용하여 정비사 해리와 간을 떼어 놓다. 15 ML 튜브에 매체를 전송합니다. 전체 볼륨을 가져와RPMI 2 % FCS 14 ㎖의에. 간세포를 가만히 따르다하는 15 ~ 20 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 둡니다. </li><li> 1 ml의 피펫을 사용하여 새로운 15ml의 튜브 (간세포)없이 상등액을 회수 (상등액 12 mL를 기대할 수있다). 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. 원심 분리 후 상층 액을 버린다. </li><li> 밀도 구배 배지 14 ㎖에 2.4 단계에서 얻어진 펠렛을 재현 탁 (예 퍼콜 40 %). 20 ° C에서 20 분 동안 600 XG에 스핀 다운. 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li><li> 아세트산 칼륨의 1 ㎖ (ACK)에 펠렛을 재현 탁. 1 분 동안 실온에서 떠난다. 1 분 후, 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 2 % FCS 14 ㎖의에 총 볼륨을 가지고. 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. 상층 액을 버린다. </li><li> 세포를 염색. <ol><li> 비오틴 항체 믹스 (재료 표를 참조하십시오 300 μL에 펠렛을 재현 탁, 모든 비오틴 항체가 언급 추가ED) 및 1.5 ml의 튜브에 세포를 전송합니다. 4 ° C에서 20 분 동안 어둠 속에서 그것을 둡니다. </li><li> HBSS 2 % FCS 1 ml의에 총 볼륨을 가져옵니다. 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. (재료 표를 참조; 언급 된 모든 형광 색소 결합 항체를 추가) 형광 색소 결합 항체 믹스와 형광 색소 접합 된 스트렙 타비 딘의 300 μL에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 20 분 동안 어둠 속에서 그것을 둡니다. </li></ol></li><li> HBSS 2 % FCS 1 ml의에 총 볼륨을 가져옵니다. 10 ° C에서 7 분 동안 120 XG에 스핀 다운. 1 ML의 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 1 ㎖의 HBSS 및 프로피 듐 요오다 이드의 펠릿을 재현 탁 (PI를 1 : 4000 참조). 참고 : 널리 표현 ILC 세포 표면 마커를 사용하는 경우, 세 인구가 정의됩니다 NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα +, 및 NKp46 - IL-7Rα +를. 모든 인구 계보를 분류되어 있습니다 - CD3 - CD4 - CD45.2 +. </li></ol> 3. 단일 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) <ol><li> 하나의 셀 (13)을 정렬 FACS를 사용합니다. 참고 : 다른 세포 유형이 동일한 96 웰 단일 셀 정렬 판에 정렬 할 수 있습니다 (그림 2). <ol><li> 물론 0.2 배씩 분석 믹스와 96 - 웰 단일 셀 정렬 접시에 사전 증폭 혼합을 포함 당 하나의 셀을 정렬 FACS를 사용합니다. 갓 준비 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 사용하거나 -20 ° C에 저장된 경우를 해동. <ol><li> FACS 판 홀더에 밀봉 된 96 웰 플레이트를 넣습니다. 테스트로 빈 96 웰 플레이트를 사용합니다. 와 플레이트를 위치 A1-아니라 왼쪽과 실험으로. </li><li> 검증 비즈와 A1 웰의 중앙에 방울을 얻기 위해 판 홀더를 조정한다. </li><li> 라인 A. 모든 우물과 단계를 반복 3.1.1.2 </li><li> 상기 96 웰 플레이트에서 실하고 잘 따라 정렬 100 검증 구슬을 제거합니다. D 확인웰의 중심에 형성 ROP. </li><li> 제대로 조정하면, 판 홀더에 96 웰 단일 셀 정렬 판을 놓습니다. 플레이트 레이아웃과 잘 당 정렬 한 셀을 그립니다. 참고 : 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트의 각 셀의 적절한 위치 결정이 필수적이다. 접시 레이아웃은 스프레드 시트 소프트웨어에 보관해야합니다. 플레이트 레이아웃은 다음의 여러 단계 (도 1B) (14)에 사용된다. 세포없이 96 웰 샘플 접시에 하나 잘 포함하여 0.2 배씩 분석 믹스와 프리 앰프 믹스를 남겨주세요. 이 웰 노 입력 제어로서 사용된다. cDNA의 희석 6 우물의 두 행을 둡니다. 이 우물은 프라이머 효율 (그림 1b)에 대한 컨트롤로 사용된다. </li><li> -20 ° C에서 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 사전 증폭 <ol><li> 신선한 또는 96 웰 해동 단일 셀 정렬 판 OBT를 사용하여단계 3.1.1.6에서 ained. (45 초 280 XG) 판 와동과 스핀 다운. </li><li> 열 순환기에 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 놓습니다. 그림 3 및 표 2에 언급 된 프로그램에 따라 역전사 및 사전 증폭을 수행합니다. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig3.jpg" /> 그림 3 : 사전 증폭 프로그램입니다. 충분한 재료를 갖기 위해, 정렬 된 단일 세포에 대한 표적 유전자의 프리 앰프가 필요하다. 96- 웰 단일 셀 정렬 판은 사전 증폭 프로그램을 수행하기 위하여 열 순환기에로드된다. 전치 증폭 생성물은 낮은 EDTA TE 완충액으로 희석 한 즉시 사용하거나 -20 ℃에서 냉동 될 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 프리 앰프 희석각 웰에 둘러 EDTA TE 완충액 36 μl를 첨가하여 샘플을 lified. </li><li> 커버 필름과 판을 밀봉합니다. (45 초 280 g)을 판 와동과 스핀 다운. -20 ° C에서 미리 증폭 96- 웰 단일 셀 정렬 판을 보관하거나 즉시 사용한다. </li></ol> 5. 96 웰 샘플 플레이트를 준비 <ol><li> qPCR에 마스터 믹스 175 μL 및 샘플 로딩 시약의 17.5 μl를 추가하여 마스터 믹스 191 μl를 준비합니다. </li><li> 새로운 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에서 마스터 믹스의 3.6 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 96- 웰 플레이트의 샘플이다. </li><li> 새로운 96 웰 플레이트에 96 웰 샘플 플레이트에서 미리 증폭 된 cDNA의 2.9 μl를 전송합니다. 96 번의 세포 정렬 플레이트와 96- 웰 샘플 플레이트 사이의 각 샘플에 대해 같은 위치를 유지한다. </li><li> 커버 필름과 판을 밀봉합니다. (45 초 280 XG) 판 와동과 스핀 다운. 빛으로부터 보호 얼음에 새로운 96 웰 플레이트를 놓습니다. 96 웰의 보관-20 ℃에서 충분한 플레이트 즉시 사용하거나. </li></ol> 6. 96 웰 분석 플레이트를 준비 <ol><li> 새로운 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에서 분석 로딩 시약의 3 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 판은 96- 웰 분석 플레이트라고한다. </li><li> 각 웰에 프라이머의 3 μl를 추가합니다. 스프레드 시트 소프트웨어에 레이아웃 유지 (도 1C 및 표 1] 표 1에 열거 된 모든 프라이머를 사용). 96- 웰 분석 플레이트의 각 프라이머의 적절한 위치 설정은 다음과 같이 여러 가지 필수적이다. <ol><li> 샘플의 수가 48 미만이면, 미 웰 물 대신에 프라이머를 추가한다. </li></ol></li><li> 커버 필름과 판을 밀봉합니다. (45 초 280 XG) 판 와동과 스핀 다운. -20 ° C에서 96 웰 분석 플레이트를 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다. 주 : 프라이머의 반복 동결 융해를 방지 사전 증폭 믹스의 프라이머를 배포하고 96 아에 대한하려면동시에 L 개의 분석 플레이트. </li></ol> 7. 단일 세포 유전자 발현 칩 <ol><li> 벤치에 통합 된 미세 유체 회로 (IFC)를 놓고 출장 주사기를 사용하여 밸브를 확인하십시오. , 주사기를 열고 밸브에 수직으로 배치, 단단히 누르십시오. O 링이 이동해야합니다. 제어 라인 유체 칩 (투베르쿨린 0.3 ㎖)를 입력합니다. </li><li> 제 2 밸브와 단계를 반복 7.1. 참고 : 액체가 칩을 통해 유출 될 수 없습니다. </li><li> 칩의 바닥에서 파란색 필름을 제거합니다. IFC 컨트롤러에 칩을 넣습니다. IFC 컨트롤러 화면에서 &quot;PRIME&quot;을 선택한 다음 &quot;RUN을.&quot; 미세 유체 라인의 제어는 10 분간 지속. </li><li> 칩을 꺼내고 칩의 하단에있는 파란색 필름을 다시 봉인. </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig4.jpg" /> 그림 4 : 단일 셀 다중 유전자 발현 칩로드. 이 단계는 g를 필요로특히 단일 셀 다중 유전자 발현 칩으로 96 웰 플레이트의 전송 중에 reat 정밀도. 로드 오류와 오 배치를 방지하려면, 매우 순차적으로 작동하는 것이 좋습니다. 각 전송 걸리는 부피 피펫 팅 과정을 제어한다. 마지막으로, 임의의 기포를 방지하고 형성시에 제거하는 것이 중요하다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858figfourlarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="5"><li> 8- 채널 피펫, 전사 칩의 A1 측 (좌측)에서 96- 웰 분석 플레이트에서 5 μl를 사용. 도 4에 나타낸 바와 같이, 칩의 왼쪽을 채운다. 항상 조언에 동일한 볼륨을 그릴주의하십시오. <ol><li> 거품을 만들지 마십시오. 거품이 나타날 경우, 10 μl의 팁을 사용하여 제거합니다. 칩의 각 웰에 대한 변경 팁. </li></ol></li><li> 오른쪽 오 단계를 반복 7.596- 웰 샘플 플레이트 5 μL를 사용하여 F 칩. </li><li> 칩의 바닥에서 파란색 필름을 제거합니다. IFC 컨트롤러에 칩을 넣습니다. IFC 컨트롤러 화면에서 &quot;RUN SCRIPT&quot;를 선택한 다음 &quot;RUN을.&quot; 미세 유체 라인의 로딩은 45 분 동안 지속됩니다. </li><li> 칩을 꺼내고 칩의 하단에있는 파란색 필름을 다시 봉인. </li></ol> 8. 실행하여 칩 <ol><li> 미세 유체 qPCR에 컴퓨터에서 &quot;데이터 수집&quot;소프트웨어를 선택합니다. 그것이 시작되면 &quot;새 실행&quot;을 선택합니다. </li><li> 선택 &quot;꺼내기&quot;칩의 바닥에서 파란색 필름을 제거하고 칩을로드합니다. 왼쪽과 실험으로 잘 A1을 얻을 수있는 칩을 놓습니다. </li><li> 에서의 &quot;프로젝트 설정&quot;, &quot;없음&quot;을 선택한 다음 선택하지 &quot;다음.&quot; </li><li> &quot;새 칩 실행&quot;, &quot;새로운 칩 디렉토리&quot;(실험에 대한 폴더를 생성), &quot;다음을 선택합니다.&quot; </li><li> &quot;유전자 발현&quot;에서 &quot;선택; 수동 기준 = ROX &quot;(카르복시-X-로다 민) 및&quot;단일 프로브; &quot;프라이머에 따라 올바른 필터를 선택 선택합니다.&quot;다음 &quot;을. </li><li> 선택 &quot;찾아보기&quot;사용 된 프라이머에 따라 올바른 프로그램을 선택합니다. 주 : &quot;기본적으로 10 분 - Hotstart.pcl&quot;은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 대한 가장 일반적으로 사용되는 프로그램이다. </li><li> &quot;시작 실행&quot;을 선택합니다. 반응은 약 90 분 소요됩니다. </li><li> 일단 선택 완료 &quot;꺼내기-완료.&quot; </li></ol> 9. 데이터 분석 <ol><li> &quot;열기&quot;, &quot;파일&quot;을 선택하고는 &quot;실시간 PCR 분석&quot;소프트웨어를 열고 실험 폴더를 찾아 선택 &quot;ChipRun.bml 파일을.&quot; </li><li> &quot;분석보기&quot;, &quot;결과 표&quot;및 &quot;열지도보기를 클릭;&quot; 에 &quot;X&quot;로 표시된 박스 임계 검출 레벨 아래에있는 및 / 또는 잘못된 증폭 곡선을 가졌다. </li><li> 샘플의 이름을 지정합니다. &quot;샘플 설정&quot;및 셀프로 이동요법 &quot;새 SBS 96&quot; &quot;매핑&quot;을 클릭하고 &quot;...&quot;복사 및 스프레드 시트 소프트웨어에서 샘플 레이아웃 설계를 붙여 넣습니다. 로 붙여 넣은 레이아웃 정의 &quot;샘플 이름을.&quot; </li><li> 분석법의 이름을 지정합니다. 반복 단계에서 프라이머 이름을 가진 9.3 &quot;감지기 설치.&quot; 로 붙여 넣은 레이아웃 정의 &quot;감지기 이름을.&quot; </li><li> &quot;분석보기&quot;를 클릭합니다 &quot;분석;&quot; 샘플 및 프라이머 이름은 샘플과 프라이머 (그림 7)에 자동 귀속됩니다. </li><li> CT, 델타 코네티컷을 계산하고, 각 샘플에 대한 변경을 접습니다. 내부 통제 (여기, GAPDH) 등의 하우스 키핑 유전자를 사용하여 ΔCT = 코네티컷 샘플 - 코네티컷 내부 통제 (ΔCtsample - ΔCtnegative 제어) - 변경 = 2 배 <ol><li> &quot;감지기 설치&quot;를 클릭없이 입력 컨트롤로 잘 선택 (유전자 발현을 정상화하기 위해 내부 통제로 하우스 키핑 유전자를 사용). 선택 &quot;Editor &quot;,&quot;기준을 정의 &quot;와&quot;업데이트. &quot; </li><li> 위의 정의 내부 통제가 적용됩니다되는 모든 우물을 선택합니다. &quot;테스트로 정의합니다.&quot; &quot;편집기&quot;를 선택하고 적절한 참조 유전자를 선택하고 클릭 &quot;업데이트를.&quot; </li><li> 또한 음성 대조군을 선택 &quot;샘플 설치&quot;를 선택합니다. &quot;편집기&quot;를 선택하고 정의 &quot;참조.&quot; &quot;업데이트&quot;를 클릭하십시오. </li><li> &quot;분석;&quot; &quot;분석보기&quot;를 선택하고 델타 코네티컷과 배 변경이 자동으로 계산됩니다. </li></ol></li><li> 데이터를 내 보냅니다. 표 결과 &quot;로 저장, 내보내기&quot; &quot;파일&quot;을 선택하고 &quot;대상 폴더를 선택하고 히트&quot;저장 &quot;과&quot;종료합니다. &quot; </li><li> 단계를 반복 9.7, 대신 다른 이름으로 저장 &quot;표 결과&quot;의 &quot;히트 맵 결과.&quot; </li></ol>

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(109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 클론 수준에서 완전한 유전자 발현 정보를 획득하는 방법을 설명한다. 여기, 우리가 간 ILC 함 이질성을 조사 하였다. (넓게 표현 ILC 표면 마커에 기초하여) 상이한 ILC 인구 단세포 정렬 후, 샘플을 특정 사전 선택된 유전자 사전 증폭 하였다. 이어서, 수득 된 cDNA와 프라이머를 멀티 플렉스 RT-qPCR의 마이크로 유체 칩 상에 로딩 하였다. 마지막으로, 우리는 48 하나의 세포에서 48 다른 ?...

지난 몇 년 동안, 선천성 림프 세포 (ILCs)는 점점 더 조사되었다. 항원 특이 적 수용체의 부족에도 불구하고, 그들은 림프 계보에 속하는 조직 항상성 및 염증 중요한 센티넬 나타낸다. ILCs 현재 특정 전사 인자 결합의 발현과 사이토 카인 (6, 7)을 생성하는 능력에 따라 세 개의 그룹으로 분할된다. ILCs 특정 사이토 카인 생산 8, 9를 통해 다양한 기관에서 다수의 항상성 및 병태 생리 학적 상황에 기여한다. 이러한 세포의 역할을 이해 할 수있게하기 위해, 기관마다 다양한 ILC 개체군을 결정하고, 그 발달 관계를 파악하는 것이 중요하다. 또한, 서로 다른 서브 세트들 사이에서 가소성 현상은 서로 관련되어있다. 이질성을 연구하여한 기관에 존재하는 세포, 그들의 성숙 단계를 구분하고, 특정 기능을 구별 할 수있다. 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 기술을 설명하기 위해 간 ILCs는 같은 ILC 그룹 (유형 1 ILC) (10) 내 자신의 이질성에 특히 중점을두고 선택되었다. 첫째, 유동 세포 계측법을 사용하여, 세 가지 ILC 인구 간 특징 하였다. 다른 두 집단 간 희귀 ILC 인구 (선천성 이펙터의 5 % 미만) 동안 1 군 ILC는 타고난 이펙터의 약 80 %를 나타낸다. 그 인구는 ILC 인구의 널리 표현 세포 표면 마커를 사용하여 분류 하였다. 그 결과, ILC 집단 간 다른 대체로 유사 하나 볼 정렬. 싱글 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 신속하게 이러한 인구 (11)의 이질성을 조사하기 위해 가장 좋은 방법 중 하나로 떠오르고있다 </s&gt;입니다. 두 가지 특성은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 기술을 활용하여 결정된다. 우선, 클론 레벨보고함으로써, 외관상 유사한 발달 단계를 표시 셀 간의 비교를 위해 셀 고유의 유전자 발현을 복구 할 수있다. 그 후 유전자 발현의 미리 선택된 조합을 보면, 우리는 하나의 시점에서 동시의 유전자 발현 패턴에 기초하여 새로운 유전자의 서명을 결정할 것이다. 기술이 클론 레벨에서 수행되기 때문에, 이러한 측면은도 드문 인구에, 다수의 셀에 대한 발현 다양한 데이터의 수집을 허용한다. 이것에 의해, 간 ILC 이질성 적절히 평가 될 수있다. 다음으로, 글로벌 ILC 표현형의 모든 세포를 분류함으로써, 간이 ILC 인구 다중 유전자 발현의 넓은 개요가 극히 드문 인구를 나타내는 경우에도 얻어진다. 미세 유체 기반 칩도 함께 실험을 할 수 있습니다셀 재가 소량. 결과적으로, 희귀 세포 집단의 유전자 발현 프로파일을 얻을 수있다. 온라인 유전자 서명 분석 소프트웨어 세포군 및 전위 클러스터 셀의 관계를 사용하는 것이 검토된다. 결과적으로, 기능 시험은 생체 레벨에서 클러스터 데이터를 검증하기 위해 수행 될 수있다. 유전자 발현 수십 동일한 칩 (3), 11, 12에서 수백 이상의 단셀에 부수적으로 평가 될 수있다. 분석의 디자인 실험의 가장 길고 가장 중요한 부분입니다. 테스트 할 가설에 관련된 유전자의 판정이 적절한 결과를 얻기 위해 가장 중요하다. 둘째, 특정 컨트롤 (예 : 정렬에 사용 알려진 표면 마커 등) 내부 통제가 필요하다. 이 프라이머 증폭 특이성, 증폭의 효율 및 t을 테스트하기 위해 매우 중요하다프라이머 경쟁 그는 부재. 셀의 다중 유전자 발현을 동시에 평가된다 따라서, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 작업하면, 절약 해주는 기술이다. 모든 셀에 대한 시약의 동일한 칩과 믹스를 사용하여 조작 가능한 오류를 제한하고 샘플 간의 재현성 수 있습니다. 전체적으로 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 다른 측면은 샘플 및 유전자의 다양한 감도의 중대한 레벨, 클론 레벨에서 신뢰성이 높은 결과의 생산을 허용한다. 얻어진 결과는 biostatistical 테스트를위한 강력하고 견고한 데이터를 제공합니다. 이는 물질의 매우 작은 양의 작업을 허용하고 완전한 결과를 유도하는 방법의 미세 형태로 달성 될 수있다. 마지막으로, 온라인 소프트웨어를 사용하면, 목적하는 집단과 비교하는 것이 가능하다.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

유전자 발현의 이질성은 림프 인구에서 조사 할 수있는 흥미로운 기능입니다. 이들 세포에서의 유전자 발현은 세포 활성화, 스트레스, 또는 자극하는 동안 변화한다. 단일 셀 다중 유전자 발현 유전자 1, 2, 3, 수십의 동시 평가를 가능하게한다. 단일 세포 수준에서 다중 유전자 발현 인구 얼룩이 -4,5- 판정한다. 그것은 성숙 세포 사이의 다양한 전구체 단계의 가능성 혼합 또한 자극에 대한 세포 반응의 다양성을 모두 결정함으로써 인구의 이질성의 구별이 가능합니다. 선천성 림프 세포 (ILC)는 최근 면역 반응 6,7 내재 이펙터 집단으로 설명되었다. ILC 그는이 프로토콜에서, 세포 이질성상호 작용이있다 함은 항상성 동안 조사 하였다. 현재, 유전자 발현을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 RT-qPCR에있다. 이 방법은 측정의 유전자 발현 한 번에 하나의 유전자. 복수의 셀이 하나의 시험이 필요하기 때문에 또한이 방법은 유전자 발현의 이질성을 예측할 수 없다. 이는 집단의 평균 유전자 발현의 측정을 이끈다. 유전자의 다수의 평가시, RT-qPCR에이 시간이, reagent- 및 샘플이 걸리는 방법이된다. 따라서, 트레이드 오프는 글로벌 화상 누락의 위험을 증가시키는, 평가 될 수있는 유전자 또는 세포 집단의 수를 제한한다. 이 논문은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 이러한 한계를 극복 할 수있는 방법을 설명한다. 이 기술은 최근 미세 유체 기술 진보 1, 2에서 혜택을 받았다. 멀티 플렉스 RT-qPCR에 칩에서 발생하는 반응은 EXC을하지 않습니다나노 리터 수준을 EED. 따라서, 단일 세포 유전자 발현뿐만 아니라, 동시에 복수의 유전자 발현은 메가 샘플하는 reagent- 수행하고 비용 효율적인 방식으로 할 수있다. 이 5 가지 개발 단계 또는 상이한 조건 하에서 4 집단 내 세포의 서브 세트 사이의 클론 세포 수준에서 유전자 서명 이질성을 테스트 할 수있다. 단일 세포 수준에서 조건의 많은 수의 희귀 한 집단에서 작업하는 것은 더 이상 제한되지 않습니다.

림프 인구는 유전자 발현의 다양성을 표시합니다. 이 프로토콜에서, 간 ILC 실 얼룩이은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 사용하여 조사 하였다. 다른 유전자 발현 기술과는 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 동시에조차 희귀 여러 집단 작업을 허용한다. 클론 수준에서 높은 감도와 결합이 특이도는 인구 내에서 유전자 서명의 차이의 조사 및 희...

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Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

10.9K 조회수.  Institut Pasteur.  이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다. 

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Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...