이 작품 미국 생식 의학 협회와 찰스와 요한 나 부시 기념 기금 Rutgers에 연구 보조금에 의해 지원 되었다에 주립 대학 뉴저지 K.S. A.L.N.에 N.I.H. (F31 HD0989597)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 분자 클로닝
<ol><li>관심과 전사 (pIVT) 벡터11 생체 외에서 플라스 미드의 유전자의 전체 길이 코딩 시퀀스를 가져옵니다. 참고: 전장 cDNA 클론 상업적으로 다양 한 공급 업체에서 제공 또는 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR)을 통해 생성 될 수 있습니다. 생물 공학 정보 (NCBI) 온라인 리소스에 대 한 국립 센터는 뉴클레오티드에서 유전자에 대 한 사본을 시퀀스를 제공 합니다 및 명시적 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스. 단백질의 용이성에 대 한 시각화 및 분석 식 수준, 녹색 형광 단백질 (Gfp)를 융합 또는 다른 적합 한 형광 태그의 복제 전략에 원하는 수 있습니다.</li>
	<li>유효한 복제 전략을 사용 하 여, pIVT의 다중 복제 영역에 관심사의 유전자의 코딩 순서를 삽입 합니다. 분자 클로닝의 자세한 설명 및 필요한 단계는 이전 설명된 12왔다 합니다. 참고: 유전자 융합 제품 생성 해야 하는 복제를 사용 하는 경우 적절 한 독서 프레임입니다.</li>
	<li>순서를 올바른 유전자 삽입, 적절 한 프레임에 융합, 그리고 아무 중 합 효소 유도 점 돌연변이 생성 된 Globin 뇌관을 사용 하 여 구문. 참고: 생어 DNA 시퀀싱 장비를 사용할 수 없는 경우 많은 기업 저가 DNA 시퀀싱 옵션을 제공 합니다.</li>
	<li>단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 또는 삽입/삭제 (INDELS) 생성 하는 경우 DNA를 mutagenize. DNA mutagenesis 단계 1.5-1.7 아래에 설명 되어 있습니다. 야생-타입 구문에 대 한 선형화 단계 1.7 진행.</li>
	<li>Mutagenesis 뇌관을 디자인 하 고 제조 업체의 프로토콜 당 돌연변이 구문을 생성 하 mutagenesis PCR 반응 완료. 사이트 감독 mutagenesis PCR 중재는 앞에서 설명한 13되었습니다. 또한, 많은 회사는 프로토콜을 포함 하는 사이트 지시 된 mutagenesis 키트를 제공 합니다.</li>
	<li>Mutagenized DNA 세균성 호스트 변환. 분리 하 고 순화 하는 플라스 미드. 참고: 많은 회사 확인 키트 쉽게 격리 하 고 플라스 미드 DNA를 정화 하는 데 사용할 수 있습니다. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다. 대장균같은 그램 음성 세균성 긴장을 사용 하는 경우 독을 제거 하는 키트를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>표준 생어 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 원하는 SNP 나 INDEL의 소개를 확인 하는 세균성 transformants에서 고립 된 DNA 순서.</li>
	<li>순화 된 DNA의 단일 제한 효소 소화를 사용 하 여 최종 제품 선형화 참고: pIVT 벡터에는 여러 단일 효소 Addgene 14에 플라스 미드 지도에 나열 된 사이트 컷이 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>제품 agarose 젤 전기 이동 법을 통해 선형 인지 확인 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법에 대 한 방법론 이전 정의 14되었습니다. 참고: 모든 나머지 단계를 사용 하 여 장벽 (필터) 피펫으로 팁과 RNase 자유 자재 안정적이 고 높은 품질 RNA의 생산을 위해.</li>
	<li>유효성이 검사 된 DNA 정리 프로토콜 또는 키트를 사용 하 여 소화 제품을 정화 하 고 30 µ L RNase/DNase 무료 물에 elute. 참고: 열 기반 장비 높은 품질을 위해 권장 하는 실리 카 매트릭스 스핀 DNA 정화. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>
시험관에서 DNA 제조 업체의 프로토콜을 따르고 T7 중 합 효소를 사용 하 여 녹음.</li>
	<li>정화 하 고 RNA RNase/DNase 무료 물 실리 카 매트릭스의 스핀 열 기반 핵 산 정화 키트 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 30 µ L에 elute.</li>
	<li>변성 agarose 젤 전기 이동 법 최종 RNA 제품 크기를 확인 하는 포름알데히드를 사용 하 여 수행 합니다. 1.13-1.22 14아래 단계를 참조 하십시오. (그림 1)입니다.</li>
	<li>해산 때까지 물 72 mL에 1 g agarose를가 열 하 여 젤을 준비 다음 60 ° c에 냉각</li>
	<li>10 X MOPS 0.4 M MOPS (pH 7.0), 아세트산 나트륨 0.1 M, 0.01 M EDTA를 추가 하 여 버퍼를 실행을 준비 합니다.</li>
	<li>10 X MOPS 실행 버퍼, 그리고 37% 포름알데히드 (12.3 M)의 18 mL 냉각된 agarose 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>젤 젤 형성 컨테이너에 agarose 솔루션을 붓는 의해 계급. 충분히 10 µ L 큰 빗을 사용 합니다. 젤 설정 터치 회사를 후 부드럽게 빗을 제거 합니다.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 탱크에 조립 하 고 충분 한 1 X MOPS 버퍼, 실행 젤 완전히 덮여 보장을 추가 합니다.</li>
	<li>0.5 X 양의 포름알데히드 포함 된 로드 염료에 RNA의 1 µ g을 추가 하 여 RNA 샘플을 준비 합니다.</li>
	<li>10 µ g/mL의 농도에서 RNA 솔루션 ethidium 평범한 사람을 추가 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 70 ° C에서 RNA 샘플 솔루션 변성</li>
	<li>살 균을 사용 하 여, 10 µ L 필터 팁, 분자량 마커의 5 µ L을 로드 하 고 RNA의 5 µ L 젤의 별도 우물으로 sample(s) 될 때까지 염료가 젤의 길이의 2/3 이상 5 V/cm에 electrophorese.</li>
	<li>UV 트랜스 조명 기에 젤에 RNA를 시각화 합니다. RNA 분자 무게 마커를 비교 하 여 올바른 크기 인지 확인 합니다.</li>
	<li>농도 및 RNA의 순도 측정, UV 분 광 광도 계에 무 균 10 µ L 필터 팁을 사용 하 여 순화 된 RNA의 1.2 µ L를 전송 합니다. 참고 높은 품질 RNA A260/280 (1.8-2.2)와 260/230의 흡 광도 비율 있어야 (> 1.7) 각각.</li>
	<li>살 균 0.5 µ L 원심 분리기 튜브 (3-5 µ L/튜브)로 10 µ L 필터 팁, aliquot 잔여 순화 된 RNA를 사용합니다. Microinjection에 대 한 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다. 참고: 500 ng / µ L의 최종 주입 농도 최적의 출발점입니다. 1:2 RNase H20 microinjection microinjection 피 펫에서 RNA의 끈 적 거 림을 줄이기 위해 이전 무료 RNA를 희석 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. kinetochore-Microtubule 첨부 파일 분석 결과
<ol><li>Microinjection에 대 한 동등한 그룹으로 oocytes를 나눕니다. 참고: Oocyte 수집, 전송, microinjection, 및 meiotic 성숙 설명 하고있다 정돈에 자세히 이전 15.</li>
	<li>실험적인 mRNA와 하나의 그룹과 WT 제어 및 PBS 또는 Gfp 다른 그룹 microinject mRNA. 참고: 500 ng / µ L 10권장된 주입 농도 이다. 주입 양을 제어 하는 picoinjector는 사용할 수 있습니다. 5-10 pL의 주입 볼륨 15것이 좋습니다.</li>
	<li>손 또는 입 어디 유리 플라스틱 개방 운영된 pipetting 기구는 약간 사용 하는 oocyte (100-150 µ m), 페 트리 접시에 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭으로 전송 oocytes의 직경 보다 큰 덮여 배아 품질 미네랄 오일 그리고 5% C02 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록에서 37 ° C에서 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 15.</li>
	<li>위의 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 부 화 후 잘 센터에 미리 냉장된 최소 필수 미디어 (MEM) 컬렉션 매체의 700 µ L 500 µ H L20 외부 반지에서 포함 된 센터 잘 기관 문화 접시에 oocytes를 전송 및 7 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다. 참고: 미리 진정 MEM 미디어 센터 oocytes의 치료 전에 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 기관 문화 요리 잘 하 추천 된다.</li>
	<li>실 온에서 20 분에 대 한 1 X PBS에 2 %paraformaldehyde 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여는 oocytes를 수정.</li>
	<li>플라스틱 장치, 전송에 oocytes 다른 잘으로 400 µ L 차단 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.01% 트윈 20 + 0.02% 할머니3) 및 저장소를 포함 하는 자리 접시에 동일을 사용 하 여 immunostaining을 처리할 준비가 될 때까지 4 ° C에서. 참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장.</li>
	<li>동일한 피 펫 장치를 사용 하 여, 전송 oocytes 자리에 새로운 우물을 포함 400 µ L permeabilization 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.1 %TritonX-100 + 0.02% 할머니3) 플레이트와 3를 통해 신속 하 게 전송 oocytes 20 분에 대 한 실 온에서 품 어 400 µ L의 삭제 차단 어떤 잔류 세제를 제거 하는 솔루션. 참고: 9-잘 분명 유리 자리 접시 (2.4-2.5 단계) 한 접시에 여러 치료를 통해 그룹을 이동 하기 위한 잘 작동 합니다.</li>
	<li>실 온에서 빛 으로부터 보호 습도 챔버에 나머지 immunocytochemistry 절차를 수행. 중간 크기의 플라스틱 용기를 사용 하 여 젖은 종이 수건 및 알루미늄 호 일 커버 늘어서 있다.</li>
	<li>30 µ L oocytes 전송 피 펫 장치를 사용 하 여 10 분 동안 습도 챔버 내에서 장소와 96 잘 접시의 뚜껑에 솔루션을 차단. 참고: 방울은 접시에 원형 들여쓰기에 배치 됩니다.</li>
	<li>Centromeres 및 스핀 들, 피 펫 장치를 사용 하 여, 30 µ L에 oocytes를 전송 차단 항 centromeric 항 원 (ACA, 크레스트)를 포함 하는 솔루션 (1:30) 및 안티 acetylated tubulin (1:1000) 및 적어도 1 시간에 대 한 품 어.</li>
	<li>10 분에 대 한 솔루션을 차단의 세 가지 30 µ L 획득 옮겨서 oocytes를 씻어.</li>
	<li>피 펫 장치, 전송 oocytes를 사용 하 여 30 µ L을 포함 하는 2 차 항 체 항 체 (반대로 인간 IgG 1: 200, 반대로 마우스 IgG 1: 200) 위에 사용 무료 차단 솔루션의 드롭하고 1 시간에 품 어.</li>
	<li>30 µ L 3, 10 분 헹 구는 단계를 반복 단계 2.11에에서 설명 된 대로 솔루션을 차단.</li>
	<li>Oocytes, 3-5 µ L 중간 포함 DAPI 장착으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 (5.9 µ g / µ L) 유리 현미경 슬라이드에서.</li>
	<li>석유 젤리의 4 작은 방울 (핀 머리의 크기)는 oocytes의 분쇄를 방지 하기 위해 커버 슬립의 모서리에 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드에 커버 슬립 석유 젤리 측면 아래로 부드럽게 장소.</li>
	<li>가장자리를 매니큐어를 취소 하 고 5 분 동안 말리는 것을 허용 하는 coverslip 인감.</li>
	<li>4 ° C, confocal 현미경 검사 법을 통해 처리까지 빛에서 보호에 슬라이드를 저장 합니다. 참고: 설치 매체 및 coverslip, 일치의 굴절률 널리 사용 되 고 현미경 목표를 확인 합니다. 자료 이전 되었습니다 권장된 장착 설명 15.</li>
	<li>Oocytes confocal 현미경, 작은 단계를 캡처에 40-63 x 목표를 사용 하 여 이미지 (≤ 1 µ m) z-평면에서 작업 목적과 이미지 분열 스핀 들의 전체 영역에 대 한 최적화. 참고: 단계 2.11에서에서 사용 하는 특정 이차 항 체에 따라 모든 3 채널의 이미지를 확인 하십시오. 평균 ≥ 4와 3의 확대/축소 하는 이미지는 적절 한 해상도 이상적입니다. 1 µ m 스텝 크기 microtubules 마우스 oocytes에서 kinetochores의 명확한 시각화를 제공합니다. 이미지 캡처를 위한 절차 현미경 현미경에서 달라질 수 있습니다. 현미경 설정을 구성 하는 방법에 대 한 특정 단계에 대 한 제조 업체 confocal 사용자 가이드를 참조 하십시오.</li>
	<li>다음 단계 2.21-2.23 아래 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 kinetochore microtubule 첨부 파일 상태를 식별 합니다. 그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 첨부 파일 상태 유형 되었습니다 이전 16 정의.</li>
	<li>오픈 이미지 이미지 J 도구 모음에 파일을 드래그 하 여.</li>
	<li>열린된 z 시리즈에서 모든 채널 표시 (DNA, kinetochore, 및 스핀 들) "병합 채널", "이미지" 메뉴에서 사용할 수 있는 "색상" 하위 탭에서 클릭 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>이미지의 하단에 토글을 사용 하 여, 각 z 슬라이스를 통해 이동 하 고 kinetochore microtubule 첨부 파일을 결정 합니다. 설명 이전 되었습니다 자세한 첨부 파일 설명 16
</li>
</ol>3. 염색체 맞춤 도전 분석 결과
<ol><li>2.3 단계에서 설명한 대로 피 펫 장치를 사용 하 여, 기름에서 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭에 oocytes 전송과 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 2.3 17 단계에서 앞에서 설명한 . 참고: Oocyte 컬렉션, microinjection, 및 성숙 절차 설명 했다 이전 15. 2.1-2.2 컨트롤에 대 한 단계와 단계에서 RNA microinjection 농도 대 한 첨부 파일 분석 결과 프로토콜을 참조 하십시오.</li>
	<li>동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 oocytes 센터 잘 기관 문화 접시 포함 700 µ L 문화 매체 센터 잘하고 400 µ L H20 주변 링에서 monastrol [100 µ M]를 포함 하 고 2 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>Monastrol oocytes를 100 µ L CZB 문화 매체의 3 드랍 스를 통해 위의 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여 밖으로 헹 구 고 700 µ L 문화 매체 + MG132를 포함 하는 새로운 센터 잘 기관 문화 접시 oocytes 전송 [5 µ M] 센터에서 3 h 링입니다. 외부 반지에 400 µ H L20을 추가 합니다.</li>
	<li>피 펫 장치를 사용 하 여 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에 400 µ L 2 %paraformaldehyde 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물에 그들을 전송 하 여는 oocytes를 수정.</li>
	<li>고정, 후에 oocytes, 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 판의 새로운 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 차단 솔루션 및 저장소까지 4 ° C에서 immunostaining에 대 한 처리. 참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장.</li>
	<li>Permeabilize 및 단계 2.6 2.16에에서 설명 된 대로 immunocytochemistry 통해 oocytes를 레이블.</li>
	<li>Oocytes는 confocal 현미경에 40-63 x 목표를 사용 하 여, 캡처 이미지 < 분열 스핀 들의 전체 영역을 이미지를 확인 하 고 z-평면에서 1 µ m 단계.</li>
	<li>염색체 맞춤 식별 하려면 상태 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다. 그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>이미지 J 컨트롤 패널에 이미지를 드래그 합니다.</li>
	<li>열린된 z 시리즈에서 (이미지 J 컨트롤 바에는 도구 아이콘을 클릭 하 여 사용 가능) 포인트 도구 사용 하 여 이미지에서 스핀 들 극 위에 도구를 배치 하 고 이미지를 클릭 하 여 그들의 각 z 슬라이스 각 스핀 들 장 대의 끝에 포인트를 표시. 명령 + t를 눌러 키보드에 관심 (ROI) 관리자의 지역에이 포인트를 추가 합니다.</li>
	<li>각 위치 단계 3.10에서에서 ROI 관리자에서 특정 시점을 강조 표시 하 고 측정값 단추를 클릭 하 여 설정에 대 한 특정 좌표를 결정 합니다. 이 결과 제공할 것입니다 x 테이블을 포함 하 고 각 포인트에 대 한 y 좌표. 이들은 각각 X1, Y1, X1, Y2, 포인트를 될 것입니다.</li>
	<li>다음으로, 진정한 Z 좌표를 결정 합니다. 이 스핀 들 극 확인 되었다 z 스택의 특정 z 슬라이스 조각 수를 곱하여 이루어집니다 (즉, # 2의 조각 6) 각 개별 포인트에 있는 스택 두께 (즉, 1 µ m)에 의해 (예: 슬라이스 2 x 1 µ m = 2). 이들은 각각 Z1 그리고 Z2 포인트 될 것입니다.</li>
	<li>피타고라스의 정리 방정식을 사용 하 여 스핀 들 길이 결정 (2 + b2 c2를 =) 사용 하 여 이전에 정의 된 x, y 및 z 좌표 단계 3.11 3.13에서에서. 각 스핀 들에 대 한 최종 길이 동일 하: √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>스핀 들 midzone을 확인 합니다. 이 스핀 들의 길이 1/2로 계산 됩니다. 이미지 J에 선 도구를 사용 하 여, 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 하나의 스핀 들 극에서 스핀 들 midzone 하는 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다.</li>
	<li>선 측정 도구를 사용 하 여 스핀 들 midzone에서 염색체 거리를 평가 하 여 염색체 정렬 상태를 확인 합니다. 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 사용할 수 있는 선 도구를 사용 하 여, 염색체에 스핀 들 midzone에서 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다. 스핀 들 midzone에서 4 µ m 보다 큰 염색체 정렬된 18간주 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thoma, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+infertility+in+the+United+States+as+estimated+by+the+current+duration+approach+and+a+traditional+constructed+approach.">Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach.</a> Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).</li><li>Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+estimates+of+infertility+prevalence+and+treatment-seeking:+potential+need+and+demand+for+infertility+medical+care.">International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care.</a> Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).</li><li>Treff, N. R., Zimmerman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Preimplantation+Genetic+Testing+for+Monogenic+Disease+and+Aneuploidy.">Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).</li><li>Franasiak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+aneuploidy+with+increasing+age+of+the+female+partner:+a+review+of+15,169+consecutive+trophectoderm+biopsies+evaluated+with+comprehensive+chromosomal+screening.">The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening.</a> Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Scott, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+biopsy+with+comprehensive+chromosome+screening+and+fresh+embryo+transfer+significantly+increases+in+vitro+fertilization+implantation+and+delivery+rates:+a+randomized+controlled+trial.">Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).</li><li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not:+a+randomized+and+paired+clinical+trial.">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+single+blastocysts+for+fresh+transfer+via+standard+morphology+assessment+alone+and+with+array+CGH+for+good+prognosis+IVF+patients:+results+from+a+randomized+pilot+study.">Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study.</a> Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).</li><li>Rubio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+preimplantation+genetic+diagnosis+for+aneuploidies+in+advanced+maternal+age:+a+randomized,+controlled+study.">In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study.</a> Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).</li><li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Aurora+Kinase+B+and+C+variants+associated+with+maternal+aneuploidy.">Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy.</a> Mol Hum Reprod. , (2017).</li><li>Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+PLCbeta1+in+mouse+eggs+change+calcium+oscillatory+behavior+following+fertilization.">Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization.</a> Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).</li><li>Armstrong, J. A., Schulz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometry+and+force+behind+kinetochore+orientation:+lessons+from+meiosis.">Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).</li><li>Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+B+modulates+chromosome+alignment+in+mouse+oocytes.">Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes.</a> Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).</li><li>Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+anaphase-promoting+complex+activation+in+mouse+oocytes+is+predicted+by+microtubule-kinetochore+attachment+but+not+by+bivalent+alignment+or+tension.">Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension.</a> Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).</li><li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+threonine+3+on+histone+H3+by+haspin+kinase+is+required+for+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).</li><li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol,+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin,+Eg5.">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes.">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li><li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells.">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li><li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes,+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase.">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

질병과 관련 된 인간의 유전 이체의 신속 하 고 증가 식별, 때문에 그들의 생물 학적 중요성을 평가 하기 위해 시스템 설립은 필수적 이다. 때문에 인간의 oocytes 소중한 희귀 하 고 인간의 정자는 의무가 유전자 조작 인간 감수 분열 포즈 특정 과제에서 단백질 기능을 이해. 마우스 oocytes는 인간의 meiotic 유전자 기능 10,23를 평가 하기 위한 귀중 한 포유류 ...

불 임은 재생산 나이 1에서 거의 절반 추구 치료 2인간의 인구의 10-15%에 영향을 미치는 조건이 다. 많은 경우 multifactorial 및 불 임 증의 병 인은 다양 한 인간에서 가장 흔한 유전 이상이 배아 이수성 3입니다. 이수성은 염색체 셀에 올바른 수의 편차 (이득 또는 손실)로 정의 됩니다. 인간 태아의 이수성의 현상 일반적 이며 진보 된 임산부 나이 4,5증가. 이 전략 증가 주입 속도, 낮은 유산 률과에 대 한 짧은 시간에 결과 때문에 자 궁 전송만 chromosomally 정상 (euploid) 배아 선택의 혜택을 강조 하는 4 개의 무작위 통제 실험 임신 6,7,,89를 달성. 따라서, 도움된을 재생산에 중요 한 의미를 가질 수 있습니다 인간의 이수성의 병 인을 이해.
Aneuploidies에 대 한 사전 주입 유전자 검사 하는 것이 불 임 치료에 도움이 있지만 aneuploidies 시작 하는 방법에 대 한 철저 한 이해는 여전히 부족 한. 그러나 Meiotic aneuploidies (생식 체 생산 동안 유래)와 산 모 나이,, 일부 여성 현재 배아 이수성 속도 그들의 주어진된 나이 4에 대 한 평균 속도에서 이탈 하는 긍정적인 상관관계가 있다는 것을 널리 받아들여진다. 이러한 경우는 혼자 나이 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측 하지 것이 좋습니다. 다른 요인 배아 이수성, 유전자 변형 등의 위험 증가에 역할을 재생할 수 있습니다.
빠르게 meiotic 유전자 기능을 평가 하는 시스템 설계 조사 oocyte 감수 분열 동안 이수성을 유전자 이체의 잠재적인 기여의 핵심 요소가입니다. 윤리적 제약 및 제한 된 액세스, 인간의 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하는 실용적입니다. 마우스 oocytes를 사용 하 여 이러한 문제를 피할 수 있으며 여기 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 분석 실험의 시리즈 나 설명. 관심사의 유전자 변형에 대 한 코딩 하는 메신저 RNA (mRNA) microinjecting에 의해 마우스 달걀에서 인간 단백질의 지역화 시각 고 수 경우는 야생 형 및 돌연변이 인간 단백질의 소성 식에서 결과 확인 하는 데 사용 이수성 이어질 수 있는 phenotypic 변경 Kinetochore 그리고 중요 한 것은 감수 분열 나의 분열에서 염색체 맞춤 지원 못하는 동생에 게 부적 절 한에 연결 하는 microtubules에 증가 포함 하는이 고기, 이득 및 기능의 상실을 조사 하이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 도전 oocyte 감수 분열의 키 이벤트와 같은 특정 실험 조건 설정 하 여 유전 이체는 건물 및 염색체 정렬 10스핀 들.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1602-4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA loading Dye</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well glass spot plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7812G17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21050</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21091</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA0356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-vibration table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corp</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td>1:100 diution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td>
			<td>Antibodies Incorportated</td>
			<td>15-234</td>
			<td>1:30 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier (Filter) Pipette tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM12635</td>
			<td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0445-07-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-07-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B100-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center Well organ culture dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25381-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (With cooling ability)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>any standard model&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 11 x 22 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6663F10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6663-F10</td>
			<td>thickness will vary for particular microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC H20</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>888700001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600400</td>
			<td>For DNA cloning&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes for linearizing pIVT</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>NdeI or KasI can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Fluorescent microscope may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>9311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde RNA loading dye</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>8552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Length cDNA Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#39;.&#160; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#39; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td>Vacutip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tupperware can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>27925901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Any Standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (NIH) Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lid of 96 well plate</td>
			<td>Nalgene Nunc International</td>
			<td>263339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacVector&#160;</td>
			<td>MacVector</td>
			<td></td>
			<td>Sequence analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4659</td>
			<td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5310</td>
			<td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monastrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8515</td>
			<td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouthpiece</td>
			<td>Biodiseno</td>
			<td>MP-001-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 tank</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for antivibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish; Clear</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any clear nailpolish can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NorthernMax 10X Running buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>Thermo Scnentific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ Culture Dish 60x15mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>08-772-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.&#160;</td>
			<td>577773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 139 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>501V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>121V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 mm</td>
			<td>Falcon BD</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoinjector</td>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Flaming-Brown Micropipette puller</td>
			<td>Model P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVT plasmid</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>32374</td>
			<td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>493-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>200523</td>
			<td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>210512</td>
			<td>mutagenesis kit for single site changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Fine point)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors (Medium point)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>WP114225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Warmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Bioscienes</td>
			<td>309623</td>
			<td>1 ml, 27G(1/2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>x-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>274348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>SN.743.12.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP UV/White lite transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UV95041501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

배아 이수성은 인간에서 불모의 주요 유전 원인입니다. 이러한 이벤트의 대부분 여성 감수 분열 동안 시작 하며 나이 혼자 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측은 긍정적으로 산 모 나이 상관, 이기는 하지만. 따라서, 유전자 변형 oogenesis 동안 잘못 된 염색체 분리에 대 한 계정 수 있습니다. 인간의 oocytes에 대 한 액세스는 제한 된 연구 목적을 위해, 분석 실험의 시리즈 마우스 oocytes를 사용 하 여 내가 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 공부에 개발 되었다. 첫째, 유전자 및 유전자 변형 관심의 메신저 RNA (mRNA) 의향 나 체포 마우스 oocytes에 microinjected 있다. 후 식에 대 한 시간을 허용, oocytes 동기적으로 감수 분열을 완료 meiotic 성숙에 출시 되 나. 형광 기자, 녹색 형광 단백질 (Gfp) 등의 순서로 mRNA에 태그를 추가 하 여 인간의 단백질의 지역화 phenotypic 변경 뿐만 아니라 평가 수 있습니다. 예를 들어 이득 또는 기능의 손실 meiotic 오류를 해결 하기 위해 유전자 제품에 도전 하는 실험 조건을 설정 하 여 조사 수 있습니다. 이 시스템은 유리한 oogenesis 동안 인간의 단백질 기능을 조사, 결과의 적절 한 해석 이루어져야 한다 단백질 표정은 내 생 수준에서 그에 주어진 고 (즉, 절에 대 한 제어 하지 않는 한 밖으로 또는 아래로), murine homologs 시스템에 있습니다.

생체 외에서 후 전사 고품질 RNA (1.8-2.2) A260/A280 비율과 A260/A230 비율 ≥1.7은 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 있을 것 이다. 그림 1 에서 그림 보여준다 생체 외에서의 마이그레이션-변성 agarose 젤 전기 이동 법 후 RNA 생성. 패턴 또는 여러 크기의 밴드는 샘플에 얼룩져 밴드 오염 또는 샘플의 저하를 나타낼 수 있습니다. 또는, 여러...

Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K 조회수.  IVI-RMA New Jersey. 인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

연구

유전학

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse splenocytes with the pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826, and heat-killed Listeria monocytogenes and examine their effect on the molecular circadian clock. Previously, studies have focused on examining the influence of LPS on the molecular clock using a variety of in vivo and ex vivo approaches from an assortment of models (e.g., mouse, rat, and human). This protocol describes the isolation and challenge of splenocytes, as well as the methodology to assess clock gene expression post-challenge via quantitative PCR. This approach can be used to assess not only the influence of microbial components on the molecular clock but other molecules as well that may alter expression of the clock. This approach could be utilized to tease apart the molecular mechanism of how PAMP-Toll-like receptor interaction influences clock expression.

This protocol describes a technique using mouse splenocytes to discover pathogen-associated molecular patterns that alter molecular clock gene expression.

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, the data obtained from rodent islets are often not fully reproduced in or applicable to human islets due to well-known differences in islet structure and function between the species. Currently, techniques that are available to manipulate gene expression of human islets are very limited. Introduction of transgene into intact islets by adenovirus, plasmid, and oligonucleotides often suffers from low efficiency and high toxicity. Low efficiency is especially problematic in gene downregulation studies in intact islets, which require high efficiency. It has been known that enzymatically-dispersed islet cells reaggregate in culture forming spheroids termed pseudoislets. Size-controlled reaggregation of human islet cells creates pseudoislets that maintain dynamic first phase insulin secretion after prolonged culture and provide a window to efficiently introduce lentiviral short hairpin RNA (shRNA) with low toxicity. Here, a detailed protocol for the creation of human pseudoislets after lentiviral transduction using two commercially available multiwell plates is described. The protocol can be easily performed and allows for efficient downregulation of genes and assessment of dynamism of insulin secretion using human islet cells. Thus, human pseudoislets with lentiviral mediated gene modulation provide a powerful and versatile model to assess gene function within human islet cells.

A protocol to create gene modified human pseudoislets from dispersed human islet cells that are transduced by lentivirus carrying short hairpin RNA (shRNA) is presented. This protocol utilizes readily available enzyme and culture vessels, can be performed easily, and produces genetically modified human pseudoislets suitable for functional and morphological studies.

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

각막 상피 창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

병원 체 관련 된 분자 패턴 시계 유전자 발현에 영향을 평가 하기 위해 마우스 Splenocytes 사용 하 여

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

각막 상피 창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사