Name: using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I at JoVE.com

이 작품 미국 생식 의학 협회와 찰스와 요한 나 부시 기념 기금 Rutgers에 연구 보조금에 의해 지원 되었다에 주립 대학 뉴저지 K.S. A.L.N.에 N.I.H. (F31 HD0989597)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 분자 클로닝
<ol><li>관심과 전사 (pIVT) 벡터11 생체 외에서 플라스 미드의 유전자의 전체 길이 코딩 시퀀스를 가져옵니다. 참고: 전장 cDNA 클론 상업적으로 다양 한 공급 업체에서 제공 또는 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR)을 통해 생성 될 수 있습니다. 생물 공학 정보 (NCBI) 온라인 리소스에 대 한 국립 센터는 뉴클레오티드에서 유전자에 대 한 사본을 시퀀스를 제공 합니다 및 명시적 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스. 단백질의 용이성에 대 한 시각화 및 분석 식 수준, 녹색 형광 단백질 (Gfp)를 융합 또는 다른 적합 한 형광 태그의 복제 전략에 원하는 수 있습니다.</li>
	<li>유효한 복제 전략을 사용 하 여, pIVT의 다중 복제 영역에 관심사의 유전자의 코딩 순서를 삽입 합니다. 분자 클로닝의 자세한 설명 및 필요한 단계는 이전 설명된 12왔다 합니다. 참고: 유전자 융합 제품 생성 해야 하는 복제를 사용 하는 경우 적절 한 독서 프레임입니다.</li>
	<li>순서를 올바른 유전자 삽입, 적절 한 프레임에 융합, 그리고 아무 중 합 효소 유도 점 돌연변이 생성 된 Globin 뇌관을 사용 하 여 구문. 참고: 생어 DNA 시퀀싱 장비를 사용할 수 없는 경우 많은 기업 저가 DNA 시퀀싱 옵션을 제공 합니다.</li>
	<li>단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 또는 삽입/삭제 (INDELS) 생성 하는 경우 DNA를 mutagenize. DNA mutagenesis 단계 1.5-1.7 아래에 설명 되어 있습니다. 야생-타입 구문에 대 한 선형화 단계 1.7 진행.</li>
	<li>Mutagenesis 뇌관을 디자인 하 고 제조 업체의 프로토콜 당 돌연변이 구문을 생성 하 mutagenesis PCR 반응 완료. 사이트 감독 mutagenesis PCR 중재는 앞에서 설명한 13되었습니다. 또한, 많은 회사는 프로토콜을 포함 하는 사이트 지시 된 mutagenesis 키트를 제공 합니다.</li>
	<li>Mutagenized DNA 세균성 호스트 변환. 분리 하 고 순화 하는 플라스 미드. 참고: 많은 회사 확인 키트 쉽게 격리 하 고 플라스 미드 DNA를 정화 하는 데 사용할 수 있습니다. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다. 대장균같은 그램 음성 세균성 긴장을 사용 하는 경우 독을 제거 하는 키트를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>표준 생어 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 원하는 SNP 나 INDEL의 소개를 확인 하는 세균성 transformants에서 고립 된 DNA 순서.</li>
	<li>순화 된 DNA의 단일 제한 효소 소화를 사용 하 여 최종 제품 선형화 참고: pIVT 벡터에는 여러 단일 효소 Addgene 14에 플라스 미드 지도에 나열 된 사이트 컷이 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>제품 agarose 젤 전기 이동 법을 통해 선형 인지 확인 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법에 대 한 방법론 이전 정의 14되었습니다. 참고: 모든 나머지 단계를 사용 하 여 장벽 (필터) 피펫으로 팁과 RNase 자유 자재 안정적이 고 높은 품질 RNA의 생산을 위해.</li>
	<li>유효성이 검사 된 DNA 정리 프로토콜 또는 키트를 사용 하 여 소화 제품을 정화 하 고 30 µ L RNase/DNase 무료 물에 elute. 참고: 열 기반 장비 높은 품질을 위해 권장 하는 실리 카 매트릭스 스핀 DNA 정화. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다.</li>
	<li>
시험관에서 DNA 제조 업체의 프로토콜을 따르고 T7 중 합 효소를 사용 하 여 녹음.</li>
	<li>정화 하 고 RNA RNase/DNase 무료 물 실리 카 매트릭스의 스핀 열 기반 핵 산 정화 키트 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 30 µ L에 elute.</li>
	<li>변성 agarose 젤 전기 이동 법 최종 RNA 제품 크기를 확인 하는 포름알데히드를 사용 하 여 수행 합니다. 1.13-1.22 14아래 단계를 참조 하십시오. (그림 1)입니다.</li>
	<li>해산 때까지 물 72 mL에 1 g agarose를가 열 하 여 젤을 준비 다음 60 ° c에 냉각</li>
	<li>10 X MOPS 0.4 M MOPS (pH 7.0), 아세트산 나트륨 0.1 M, 0.01 M EDTA를 추가 하 여 버퍼를 실행을 준비 합니다.</li>
	<li>10 X MOPS 실행 버퍼, 그리고 37% 포름알데히드 (12.3 M)의 18 mL 냉각된 agarose 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>젤 젤 형성 컨테이너에 agarose 솔루션을 붓는 의해 계급. 충분히 10 µ L 큰 빗을 사용 합니다. 젤 설정 터치 회사를 후 부드럽게 빗을 제거 합니다.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 탱크에 조립 하 고 충분 한 1 X MOPS 버퍼, 실행 젤 완전히 덮여 보장을 추가 합니다.</li>
	<li>0.5 X 양의 포름알데히드 포함 된 로드 염료에 RNA의 1 µ g을 추가 하 여 RNA 샘플을 준비 합니다.</li>
	<li>10 µ g/mL의 농도에서 RNA 솔루션 ethidium 평범한 사람을 추가 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 70 ° C에서 RNA 샘플 솔루션 변성</li>
	<li>살 균을 사용 하 여, 10 µ L 필터 팁, 분자량 마커의 5 µ L을 로드 하 고 RNA의 5 µ L 젤의 별도 우물으로 sample(s) 될 때까지 염료가 젤의 길이의 2/3 이상 5 V/cm에 electrophorese.</li>
	<li>UV 트랜스 조명 기에 젤에 RNA를 시각화 합니다. RNA 분자 무게 마커를 비교 하 여 올바른 크기 인지 확인 합니다.</li>
	<li>농도 및 RNA의 순도 측정, UV 분 광 광도 계에 무 균 10 µ L 필터 팁을 사용 하 여 순화 된 RNA의 1.2 µ L를 전송 합니다. 참고 높은 품질 RNA A260/280 (1.8-2.2)와 260/230의 흡 광도 비율 있어야 (> 1.7) 각각.</li>
	<li>살 균 0.5 µ L 원심 분리기 튜브 (3-5 µ L/튜브)로 10 µ L 필터 팁, aliquot 잔여 순화 된 RNA를 사용합니다. Microinjection에 대 한 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다. 참고: 500 ng / µ L의 최종 주입 농도 최적의 출발점입니다. 1:2 RNase H20 microinjection microinjection 피 펫에서 RNA의 끈 적 거 림을 줄이기 위해 이전 무료 RNA를 희석 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. kinetochore-Microtubule 첨부 파일 분석 결과
<ol><li>Microinjection에 대 한 동등한 그룹으로 oocytes를 나눕니다. 참고: Oocyte 수집, 전송, microinjection, 및 meiotic 성숙 설명 하고있다 정돈에 자세히 이전 15.</li>
	<li>실험적인 mRNA와 하나의 그룹과 WT 제어 및 PBS 또는 Gfp 다른 그룹 microinject mRNA. 참고: 500 ng / µ L 10권장된 주입 농도 이다. 주입 양을 제어 하는 picoinjector는 사용할 수 있습니다. 5-10 pL의 주입 볼륨 15것이 좋습니다.</li>
	<li>손 또는 입 어디 유리 플라스틱 개방 운영된 pipetting 기구는 약간 사용 하는 oocyte (100-150 µ m), 페 트리 접시에 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭으로 전송 oocytes의 직경 보다 큰 덮여 배아 품질 미네랄 오일 그리고 5% C02 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록에서 37 ° C에서 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 15.</li>
	<li>위의 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 부 화 후 잘 센터에 미리 냉장된 최소 필수 미디어 (MEM) 컬렉션 매체의 700 µ L 500 µ H L20 외부 반지에서 포함 된 센터 잘 기관 문화 접시에 oocytes를 전송 및 7 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다. 참고: 미리 진정 MEM 미디어 센터 oocytes의 치료 전에 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 기관 문화 요리 잘 하 추천 된다.</li>
	<li>실 온에서 20 분에 대 한 1 X PBS에 2 %paraformaldehyde 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여는 oocytes를 수정.</li>
	<li>플라스틱 장치, 전송에 oocytes 다른 잘으로 400 µ L 차단 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.01% 트윈 20 + 0.02% 할머니3) 및 저장소를 포함 하는 자리 접시에 동일을 사용 하 여 immunostaining을 처리할 준비가 될 때까지 4 ° C에서. 참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장.</li>
	<li>동일한 피 펫 장치를 사용 하 여, 전송 oocytes 자리에 새로운 우물을 포함 400 µ L permeabilization 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.1 %TritonX-100 + 0.02% 할머니3) 플레이트와 3를 통해 신속 하 게 전송 oocytes 20 분에 대 한 실 온에서 품 어 400 µ L의 삭제 차단 어떤 잔류 세제를 제거 하는 솔루션. 참고: 9-잘 분명 유리 자리 접시 (2.4-2.5 단계) 한 접시에 여러 치료를 통해 그룹을 이동 하기 위한 잘 작동 합니다.</li>
	<li>실 온에서 빛 으로부터 보호 습도 챔버에 나머지 immunocytochemistry 절차를 수행. 중간 크기의 플라스틱 용기를 사용 하 여 젖은 종이 수건 및 알루미늄 호 일 커버 늘어서 있다.</li>
	<li>30 µ L oocytes 전송 피 펫 장치를 사용 하 여 10 분 동안 습도 챔버 내에서 장소와 96 잘 접시의 뚜껑에 솔루션을 차단. 참고: 방울은 접시에 원형 들여쓰기에 배치 됩니다.</li>
	<li>Centromeres 및 스핀 들, 피 펫 장치를 사용 하 여, 30 µ L에 oocytes를 전송 차단 항 centromeric 항 원 (ACA, 크레스트)를 포함 하는 솔루션 (1:30) 및 안티 acetylated tubulin (1:1000) 및 적어도 1 시간에 대 한 품 어.</li>
	<li>10 분에 대 한 솔루션을 차단의 세 가지 30 µ L 획득 옮겨서 oocytes를 씻어.</li>
	<li>피 펫 장치, 전송 oocytes를 사용 하 여 30 µ L을 포함 하는 2 차 항 체 항 체 (반대로 인간 IgG 1: 200, 반대로 마우스 IgG 1: 200) 위에 사용 무료 차단 솔루션의 드롭하고 1 시간에 품 어.</li>
	<li>30 µ L 3, 10 분 헹 구는 단계를 반복 단계 2.11에에서 설명 된 대로 솔루션을 차단.</li>
	<li>Oocytes, 3-5 µ L 중간 포함 DAPI 장착으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 (5.9 µ g / µ L) 유리 현미경 슬라이드에서.</li>
	<li>석유 젤리의 4 작은 방울 (핀 머리의 크기)는 oocytes의 분쇄를 방지 하기 위해 커버 슬립의 모서리에 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드에 커버 슬립 석유 젤리 측면 아래로 부드럽게 장소.</li>
	<li>가장자리를 매니큐어를 취소 하 고 5 분 동안 말리는 것을 허용 하는 coverslip 인감.</li>
	<li>4 ° C, confocal 현미경 검사 법을 통해 처리까지 빛에서 보호에 슬라이드를 저장 합니다. 참고: 설치 매체 및 coverslip, 일치의 굴절률 널리 사용 되 고 현미경 목표를 확인 합니다. 자료 이전 되었습니다 권장된 장착 설명 15.</li>
	<li>Oocytes confocal 현미경, 작은 단계를 캡처에 40-63 x 목표를 사용 하 여 이미지 (≤ 1 µ m) z-평면에서 작업 목적과 이미지 분열 스핀 들의 전체 영역에 대 한 최적화. 참고: 단계 2.11에서에서 사용 하는 특정 이차 항 체에 따라 모든 3 채널의 이미지를 확인 하십시오. 평균 ≥ 4와 3의 확대/축소 하는 이미지는 적절 한 해상도 이상적입니다. 1 µ m 스텝 크기 microtubules 마우스 oocytes에서 kinetochores의 명확한 시각화를 제공합니다. 이미지 캡처를 위한 절차 현미경 현미경에서 달라질 수 있습니다. 현미경 설정을 구성 하는 방법에 대 한 특정 단계에 대 한 제조 업체 confocal 사용자 가이드를 참조 하십시오.</li>
	<li>다음 단계 2.21-2.23 아래 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 kinetochore microtubule 첨부 파일 상태를 식별 합니다. 그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 첨부 파일 상태 유형 되었습니다 이전 16 정의.</li>
	<li>오픈 이미지 이미지 J 도구 모음에 파일을 드래그 하 여.</li>
	<li>열린된 z 시리즈에서 모든 채널 표시 (DNA, kinetochore, 및 스핀 들) "병합 채널", "이미지" 메뉴에서 사용할 수 있는 "색상" 하위 탭에서 클릭 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>이미지의 하단에 토글을 사용 하 여, 각 z 슬라이스를 통해 이동 하 고 kinetochore microtubule 첨부 파일을 결정 합니다. 설명 이전 되었습니다 자세한 첨부 파일 설명 16
</li>
</ol>3. 염색체 맞춤 도전 분석 결과
<ol><li>2.3 단계에서 설명한 대로 피 펫 장치를 사용 하 여, 기름에서 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭에 oocytes 전송과 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 2.3 17 단계에서 앞에서 설명한 . 참고: Oocyte 컬렉션, microinjection, 및 성숙 절차 설명 했다 이전 15. 2.1-2.2 컨트롤에 대 한 단계와 단계에서 RNA microinjection 농도 대 한 첨부 파일 분석 결과 프로토콜을 참조 하십시오.</li>
	<li>동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 oocytes 센터 잘 기관 문화 접시 포함 700 µ L 문화 매체 센터 잘하고 400 µ L H20 주변 링에서 monastrol [100 µ M]를 포함 하 고 2 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>Monastrol oocytes를 100 µ L CZB 문화 매체의 3 드랍 스를 통해 위의 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여 밖으로 헹 구 고 700 µ L 문화 매체 + MG132를 포함 하는 새로운 센터 잘 기관 문화 접시 oocytes 전송 [5 µ M] 센터에서 3 h 링입니다. 외부 반지에 400 µ H L20을 추가 합니다.</li>
	<li>피 펫 장치를 사용 하 여 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에 400 µ L 2 %paraformaldehyde 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물에 그들을 전송 하 여는 oocytes를 수정.</li>
	<li>고정, 후에 oocytes, 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 판의 새로운 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 차단 솔루션 및 저장소까지 4 ° C에서 immunostaining에 대 한 처리. 참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장.</li>
	<li>Permeabilize 및 단계 2.6 2.16에에서 설명 된 대로 immunocytochemistry 통해 oocytes를 레이블.</li>
	<li>Oocytes는 confocal 현미경에 40-63 x 목표를 사용 하 여, 캡처 이미지 < 분열 스핀 들의 전체 영역을 이미지를 확인 하 고 z-평면에서 1 µ m 단계.</li>
	<li>염색체 맞춤 식별 하려면 상태 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다. 그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>이미지 J 컨트롤 패널에 이미지를 드래그 합니다.</li>
	<li>열린된 z 시리즈에서 (이미지 J 컨트롤 바에는 도구 아이콘을 클릭 하 여 사용 가능) 포인트 도구 사용 하 여 이미지에서 스핀 들 극 위에 도구를 배치 하 고 이미지를 클릭 하 여 그들의 각 z 슬라이스 각 스핀 들 장 대의 끝에 포인트를 표시. 명령 + t를 눌러 키보드에 관심 (ROI) 관리자의 지역에이 포인트를 추가 합니다.</li>
	<li>각 위치 단계 3.10에서에서 ROI 관리자에서 특정 시점을 강조 표시 하 고 측정값 단추를 클릭 하 여 설정에 대 한 특정 좌표를 결정 합니다. 이 결과 제공할 것입니다 x 테이블을 포함 하 고 각 포인트에 대 한 y 좌표. 이들은 각각 X1, Y1, X1, Y2, 포인트를 될 것입니다.</li>
	<li>다음으로, 진정한 Z 좌표를 결정 합니다. 이 스핀 들 극 확인 되었다 z 스택의 특정 z 슬라이스 조각 수를 곱하여 이루어집니다 (즉, # 2의 조각 6) 각 개별 포인트에 있는 스택 두께 (즉, 1 µ m)에 의해 (예: 슬라이스 2 x 1 µ m = 2). 이들은 각각 Z1 그리고 Z2 포인트 될 것입니다.</li>
	<li>피타고라스의 정리 방정식을 사용 하 여 스핀 들 길이 결정 (2 + b2 c2를 =) 사용 하 여 이전에 정의 된 x, y 및 z 좌표 단계 3.11 3.13에서에서. 각 스핀 들에 대 한 최종 길이 동일 하: √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>스핀 들 midzone을 확인 합니다. 이 스핀 들의 길이 1/2로 계산 됩니다. 이미지 J에 선 도구를 사용 하 여, 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 하나의 스핀 들 극에서 스핀 들 midzone 하는 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다.</li>
	<li>선 측정 도구를 사용 하 여 스핀 들 midzone에서 염색체 거리를 평가 하 여 염색체 정렬 상태를 확인 합니다. 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 사용할 수 있는 선 도구를 사용 하 여, 염색체에 스핀 들 midzone에서 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다. 스핀 들 midzone에서 4 µ m 보다 큰 염색체 정렬된 18간주 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li><li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs.">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li><li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes.">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li><li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells.">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li><li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes,+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase.">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li><li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

질병과 관련 된 인간의 유전 이체의 신속 하 고 증가 식별, 때문에 그들의 생물 학적 중요성을 평가 하기 위해 시스템 설립은 필수적 이다. 때문에 인간의 oocytes 소중한 희귀 하 고 인간의 정자는 의무가 유전자 조작 인간 감수 분열 포즈 특정 과제에서 단백질 기능을 이해. 마우스 oocytes는 인간의 meiotic 유전자 기능 10,23를 평가 하기 위한 귀중 한 포유류 ...

불 임은 재생산 나이 1에서 거의 절반 추구 치료 2인간의 인구의 10-15%에 영향을 미치는 조건이 다. 많은 경우 multifactorial 및 불 임 증의 병 인은 다양 한 인간에서 가장 흔한 유전 이상이 배아 이수성 3입니다. 이수성은 염색체 셀에 올바른 수의 편차 (이득 또는 손실)로 정의 됩니다. 인간 태아의 이수성의 현상 일반적 이며 진보 된 임산부 나이 4,5증가. 이 전략 증가 주입 속도, 낮은 유산 률과에 대 한 짧은 시간에 결과 때문에 자 궁 전송만 chromosomally 정상 (euploid) 배아 선택의 혜택을 강조 하는 4 개의 무작위 통제 실험 임신 6,7,,89를 달성. 따라서, 도움된을 재생산에 중요 한 의미를 가질 수 있습니다 인간의 이수성의 병 인을 이해.
Aneuploidies에 대 한 사전 주입 유전자 검사 하는 것이 불 임 치료에 도움이 있지만 aneuploidies 시작 하는 방법에 대 한 철저 한 이해는 여전히 부족 한. 그러나 Meiotic aneuploidies (생식 체 생산 동안 유래)와 산 모 나이,, 일부 여성 현재 배아 이수성 속도 그들의 주어진된 나이 4에 대 한 평균 속도에서 이탈 하는 긍정적인 상관관계가 있다는 것을 널리 받아들여진다. 이러한 경우는 혼자 나이 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측 하지 것이 좋습니다. 다른 요인 배아 이수성, 유전자 변형 등의 위험 증가에 역할을 재생할 수 있습니다.
빠르게 meiotic 유전자 기능을 평가 하는 시스템 설계 조사 oocyte 감수 분열 동안 이수성을 유전자 이체의 잠재적인 기여의 핵심 요소가입니다. 윤리적 제약 및 제한 된 액세스, 인간의 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하는 실용적입니다. 마우스 oocytes를 사용 하 여 이러한 문제를 피할 수 있으며 여기 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 분석 실험의 시리즈 나 설명. 관심사의 유전자 변형에 대 한 코딩 하는 메신저 RNA (mRNA) microinjecting에 의해 마우스 달걀에서 인간 단백질의 지역화 시각 고 수 경우는 야생 형 및 돌연변이 인간 단백질의 소성 식에서 결과 확인 하는 데 사용 이수성 이어질 수 있는 phenotypic 변경 Kinetochore 그리고 중요 한 것은 감수 분열 나의 분열에서 염색체 맞춤 지원 못하는 동생에 게 부적 절 한에 연결 하는 microtubules에 증가 포함 하는이 고기, 이득 및 기능의 상실을 조사 하이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 도전 oocyte 감수 분열의 키 이벤트와 같은 특정 실험 조건 설정 하 여 유전 이체는 건물 및 염색체 정렬 10스핀 들.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Seal-Rite PCR tube</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass spot plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration table</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Anti-Acetylated Tubulin antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>Anti-centromeric (CREST) antibody</td><td>Antibodies Incorportated</td><td>15-234</td><td>1:30 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well organ culture dish</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td>For incubator</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Centrifuge (With cooling ability)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>any standard model&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cover Glass 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>thickness will vary for particular microscopes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high fidelity cloning enzyme</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>For DNA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Enzymes for linearizing pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI or KasI can be used</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Any Fluorescent microscope may be used</td></tr><tr><td>Formaldehyde (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde RNA loading dye</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Full Length cDNA Clones</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3&#039;.&amp;nbsp; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5&#039;- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3&#039; Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides</td></tr><tr><td>Holding pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber</td><td></td><td></td><td>Tupperware can be used</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>any standard model with CO2 and water jacketed technology</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Any Standard model</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Analysis software</td></tr><tr><td>Lid of 96 well plate</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&amp;nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Sequence analysis software</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA Markers-Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspend in DMSO at 2.5mM</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Only used embryo-tested, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspend in DMSO at 100 mM</td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tank</td><td></td><td></td><td>for antivibration table</td></tr><tr><td>Nail Polish; Clear</td><td></td><td></td><td>Any clear nailpolish can be used</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Organ Culture Dish 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>XenoWorks Digital Microinjector</td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Flaming-Brown Micropipette puller</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT plasmid</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Empty vector suitable for oocyte expression.</td></tr><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purification of up to 20 uL of plasmid DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>200523</td><td>mutagenesis kit for insertions and deletions</td></tr><tr><td>Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>210512</td><td>mutagenesis kit for single site changes</td></tr><tr><td>Scissors (Fine point)</td><td>Fine science tools</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (Medium point)</td><td>Fine science tools</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>any standard model</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer (Fine point- Size 5)</td><td>Fine science tools</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis i

배아 이수성은 인간에서 불모의 주요 유전 원인입니다. 이러한 이벤트의 대부분 여성 감수 분열 동안 시작 하며 나이 혼자 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측은 긍정적으로 산 모 나이 상관, 이기는 하지만. 따라서, 유전자 변형 oogenesis 동안 잘못 된 염색체 분리에 대 한 계정 수 있습니다. 인간의 oocytes에 대 한 액세스는 제한 된 연구 목적을 위해, 분석 실험의 시리즈 마우스 oocytes를 사용 하 여 내가 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 공부에 개발 되었다. 첫째, 유전자 및 유전자 변형 관심의 메신저 RNA (mRNA) 의향 나 체포 마우스 oocytes에 microinjected 있다. 후 식에 대 한 시간을 허용, oocytes 동기적으로 감수 분열을 완료 meiotic 성숙에 출시 되 나. 형광 기자, 녹색 형광 단백질 (Gfp) 등의 순서로 mRNA에 태그를 추가 하 여 인간의 단백질의 지역화 phenotypic 변경 뿐만 아니라 평가 수 있습니다. 예를 들어 이득 또는 기능의 손실 meiotic 오류를 해결 하기 위해 유전자 제품에 도전 하는 실험 조건을 설정 하 여 조사 수 있습니다. 이 시스템은 유리한 oogenesis 동안 인간의 단백질 기능을 조사, 결과의 적절 한 해석 이루어져야 한다 단백질 표정은 내 생 수준에서 그에 주어진 고 (즉, 절에 대 한 제어 하지 않는 한 밖으로 또는 아래로), murine homologs 시스템에 있습니다.

생체 외에서 후 전사 고품질 RNA (1.8-2.2) A260/A280 비율과 A260/A230 비율 ≥1.7은 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 있을 것 이다. 그림 1 에서 그림 보여준다 생체 외에서의 마이그레이션-변성 agarose 젤 전기 이동 법 후 RNA 생성. 패턴 또는 여러 크기의 밴드는 샘플에 얼룩져 밴드 오염 또는 샘플의 저하를 나타낼 수 있습니다. 또는, 여러...

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Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

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비디오: Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

연구

유전학

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

발생학

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

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마우스의 Prophase-Arrested 난모세포에서 DNA 손상 확인

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

저자 스포트라이트: 포유류 난모세포와 착상 전 배아의 DNA 손상 반응 이해 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

생물학

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

요약

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마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

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마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

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