저자는 혈액에서 아질산염 측정을위한 아질산 보존 용액의 사용을 개발 박사 A. Dejam와 MM의 Pelletier의 중요한 기여를 인정합니다.

동물의 사용을 포함한 모든 프로토콜은 NIDDK 동물 관리 및 사용위원회에 의해 사용이 승인되었고, 인간의 혈액은 건강한 기증자로부터 NIH 혈액 은행에서 얻었다. 1. 샘플 준비 <ol><li> 아질산염 보존 용액의 조제 <ol><li> 890 MM의 페리 시안화 칼륨 함유 한 용액 준비 (K 3의 Fe (CN)을 6) 및 증류수에 118 밀리미터 NEM (N-에틸 말레이 미드). 그것은 현재없이 결정 노란색 선명해질 때까지 잘 녹여. 9 비율 (V / V를, NP-40 / 솔루션) : 1에서 NP-40 (옥틸 phenoxylpolyethoxylethanol)를 추가합니다. )에 대한 주 동안 4 ° C에서 발포 및 저장을 피하기 위해 부드럽게 섞는다. </li></ol></li><li> 수집 및 혈액 샘플의 제조 <ol><li> 응고 (5 U / ㎖)을 방지하기 위해 헤파린 용혈을 방지하기 위해 적어도 20 G 바늘을 사용하여 혈액을 수집한다. (4 비율 절 : 전체 혈액 샘플의 경우, 아질산염은 1에서 즉시 해결책을 유지하여 혈액을 혼합/ V 솔루션 / 혈액). </li><li> 혈장과 적혈구 샘플은 원심 분리 4 ℃에서 4,000 × g으로 5 분에 수집 된 혈액을 적혈구 (RBC) 및 혈장을 분리한다. 상층 액 (혈장)을 가지고 플라즈마 아질산염 농도의 측정에 대해 상술 한 바와 같이 아질산 용액을 유지와 함께 혼합한다. </li><li> 조심스럽게 차단 피펫 팁을 이용하여 혈액 세포의 다른 형태에 의한 오염을 방지하기 위해 관의 하단에서 샘플 피펫 RBC 샘플로부터 혈장과 버피 코트를 나머지 제거 같은 아질산염 보존 용액을 함유하는 관에 옮긴다 상기와 비율. </li><li> 1 또는 1 : 비율 1 냉 메탄올 각 샘플 (플라즈마 및 RBC)를 혼합 2 (v / V를 샘플 / 메탄올)과 단백질을 침전시켜 15 분 동안 4 ° C에서 13,000 XG에 그들을 원심 분리기. -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 필요한 경우, 상층 액을 가지고 아질산염 측정을 위해 사용하거나 준비된 샘플을 동결. 참고 : 아질산염이 빠르게 REA혈액 형성 질산에 산화 헤모글로빈 (oxyHb)와 캐럿. oxyHb 항상 아질산 이상의 과량으로 존재하기 때문에,이 반응은 10 분 ~의 시간 프레임 네이티브 혈액 아질산 거의 완전히 소멸 리드. 내인성 혈액 아질산염의 대부분을 보존하기 위해, 아질산 보존 용액은 즉시 채혈 후의 전혈 샘플에 첨가한다. 용액을 신속하게, 화학적 아질산과 반응하지 않는 헤모글로빈의 비활성 형태 적혈구 용균 및 메트 헤모글로빈 (metHb) oxyHb로 산화된다. </li></ol></li><li> 다른 유형의 체액 샘플에서의 제조 <ol><li> 적당한 용기에 시료 채취 후, 아질산 보존 솔루션, deproteinate과 잘 혼합하고 즉시 측정하거나 -80 ° C에서 동결 및 저장. </li></ol></li><li> 수집 및 조직 샘플의 제조 <ol><li> 헤파린 염수 용액 (10 U 헤파 관류 동물 조직 수집린 / ㎖). 원하는 조직의 소비세 약 1 g 및 균질화 중 하나를 수동으로 균질화 또는 자동화 된 호모 게 나이저를 사용하여. </li><li> 부드러운 균질를 달성하기 위해 필요한 솔루션을 보존 아질산염의 알려진 금액을 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 39 ° C에서 전술 한 바와 같이 (2 비 V / V 샘플 / 메탄올 : 1 또는 1) 13,000 XG에서 원심 분리 한 후 시료의 조직이 균질화되면, 냉 메탄올을 사용하여 단백질을 침전. </li><li> 뜨는 및 측정 아질산염 수준을 수집합니다. 필요한 경우, -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 대한 준비의 모든 단계에서 샘플을 동결. </li></ol></li></ol> 솔루션을 감소 2. 준비 <ol><li> 트라이 - 요오드 (I 3) 아질산염 및 R- (X) -NO 종 결정 1,3,4에 대한 솔루션을 감소 <ol><li> 물에 138 밀리미터 I 2 용액과 함께 301 mM의 KI 용액을 준비합니다. 모든 때까지 ~ 30 분 동안 자기 교반기 7 비율 (V /의 / v 용액 산) : 2 빙초산과 혼합결정을 용해시킨다. 바람직하게는 요오드화 민감한 빛으로 어두운 병에 보관하고, 제조로부터 1 주일 이내에 사용한다. 참고 :이 솔루션은 NO에 아질산염을 줄일 수 있으며 또한 R-SNO, R-NNO 및 Fe-NO 작용기 (R-(X) -NO)에서 NO 해제되지만, 질산염은 영향을받지 않습니다. 상기 NO 계 관능기로부터 신호 산성화 설파 닐 아미드 (AS) 및 AS 처리 비교 미처리 신호 샘플의 절반의 처리에 의해 참된 아질산 신호로부터 분리 될 수있다. AS 비가 역적으로 아질산으로 디아 조늄 양이온을 형성하고,이 복합체는 I 3 용액에 의해 감소 될 수 없다. 치료 AS를 들어, 1 M 염산에 설파 닐 아미드의 290 mM의 용액을 제조하고 비 1 시료의 분취 량에 추가 : 9 (v / V를 AS / 샘플). 샘플의 AS 처리 및 치료 부분에서 CL 신호를 측정한다. 샘플의 AS 처리 및 처리되지 않은 부분의 차이로 실제 아질산염 신호를 계산합니다. 아질산염은 선택적 NIT를 사용하여 측정 할 수있다라이트 저감 ​​부 2.2에 기재된 아스코르브 / 아세트산 혼합물 용액. 그러나, 본 -NO 종 R- (X)의 보통 소량 AS 미처리 샘플을 이용하여 측정 아질산 총 함량의 좋은 근사 대부분의 경우에 의한. </li></ol></li><li> 아질산염 2의 선택적 결정을위한 아스코르브 산 / 아세트산 (4A) 솔루션 <ol><li> 물에 500 밀리미터의 아스 코르 빈산을 준비합니다. 반응 혼합물을 제조 7 (V / V, 아스코르브 산 / 아세트산) 비율 1 빙초산이 용액을 혼합한다. 참고 :이 솔루션은 아질산염에 대한 특정이며, 모든 R- (X) -NO 종 또는 질산에서 NO 공개하지 않습니다. 아스코르브 산 용액에 쉽게 산화 그러나 아스코르브 아세트산 용액을 매일 측정 전에 신선하게 제조되어야한다. 아질산 환원 완료 아스코르브 산 농도에 의존한다; 적어도 50 MM의 아스 코르 빈산는 전체 R을 권장합니다플라즈마 아질산 냄. 그러나, 이전의 마지막 샘플의 측정을 기대 아질산염 농도 범위 아스코르브 산과 아질산 표준 상이한 농도로 몇 파일럿 실험을 수행 할 것을 권장한다. 아스 코르 빈산 약간 측정하는 동안 고갈 있다는 사실을 숙지, 유리 반응 챔버의 반응 혼합물을 너무 자주 변경을 권장합니다. </li></ol></li><li> 질산 판정 9 바나듐 (III) 클로라이드 환원 용액 <ol><li> 1 M 염산에 식 VC1 3의 51 mM의 솔루션을 준비합니다. 어두운 병에 200 μm의 필터와 매장을 통해 필터 솔루션은 2 주 이내에 사용한다. 참고 :이 솔루션은 질산염, 아질산염 및 모든 R- (X) -NO 종을 줄일 수 있으므로 계산하는 아질산염 또는 기타 R-의 비교 양 (X) -NO 종을 함께 질산과 존재, 최종 질산염 함량이 경우 식 VC1 3 I 얻어진 CL 신호들 간의 차이로서세 용액을 감소시킨다. </li></ol></li></ol> 3. 화학 발광 (CL) 분석기 설치 및 측정 <ol><li> 표준 용액 <ol><li> 아질산 나트륨 용액을 1 μM (에 NaNO 2)을 준비한다. 동일한 용액 아질산염 및 질산염 결정에 사용될 수있다. </li></ol></li><li> NO 분석기를 사용하지 참고 : 현재 생물학적 연구 목적으로 충분히 구분이 상업적으로 사용 가능한 분석기가 없습니다 - SIEVERS NOA와 Ecophysics CLD의 88Y이. 이들은 모두 동일한 원리로 동작; 주요 차이점은 CLD 88Y 오존 있도록 실내 공기로부터 산소를 사용하는 것이다 (O 3) NOA이 목적을 위해 외부 산소 탱크를 필요로있다. 아래의 절차는 SIEVERS NOA의 설정을 설명합니다. <ol><li> 장비 설치 <ol><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 NO 분석기의 초기 설정을 수행합니다로 그림 1에서 볼. </li><li> 악기에 연결 열기 O 2 탱크. &quot;분석&quot;을 선택하고 전면 패널의 주 메뉴에서 &quot;입력&quot;. 다음 화면에서 선택 &quot;시작&quot;을 누르면 &quot;입력합니다.&quot; 그림 1에서 볼 수 있듯이 악기 (1 M NaOH를 함유) 산 트랩을 연결합니다. </li><li> 광전자 증은 -12 ° C 이하의 온도로 냉각하고, 반응 챔버는 6 토르에 철수 될 때까지 기다립니다. 그것은 안정된 평면 기준에 도달하기 약 30 분 소요됩니다. 베이스 라인은 (1) 내에 안정 필요 - 2 MV, 공칭 값은 안정성보다 중요하다. 참고 : 질산염을 측정하는 경우, 냉각 (산, 물, 증기뿐만 냉각 트랩을 제공 4 ° C에서 설정) 수조 및 가열 수조 (주 반응 챔버, 95 ° C)를 켭니다. 식 VC1 3 용액에 질산 NO의 감소율은 온도 의존적이며, 실내 템페 매우 느리다rature는 온도 정도로 크게 증가하여 반응을 관찰 할 필요가있다. </li><li> 헬륨 탱크를 열고 그림 1에서와 같이 산 함정에 유리 반응 챔버를 연결합니다. 적절한 환원 용액과의 반응 챔버를 채우고 최소 버블을 감소시키고 산 트랩에 반응 챔버를 연결한다. 시행 착오를 사용하여 악기 흡입 속도 (Siever의 NOA에 대한 보통 ~ 200 ml / 분)와 일치하는 그는 버블 링 속도를 조정합니다. </li><li> 기기를 제어하는 ​​컴퓨터를 켜고와 LabVIEW 기반의 액체 소프트웨어를 시작합니다. 악기와 수집 소프트웨어를 누르 사이의 통신을 설정하려면 화면이 표시 될 때까지 &quot;데이터 메뉴&quot;의 &quot;출력 활성화&quot;할 때, 다음 &quot;명확한&quot;를 눌러 데이터 화면으로 다시 돌아갑니다 &quot;입력&quot;. </li><li> 화면에 안정적인베이스 라인 추적 기다린 격막을 통해 솔루션을 감소로 샘플 및 아질산염 기준을 주입 시작합니다. 항상 안정된베이스 라인 후방에 도달하는 대기피크 어. 이 2 분까지 걸릴 수 있습니다. 액상 소프트웨어는 주입의 옵션을 &quot;마크&quot;시간을 가지고 있으며, 사출 주석과 데이터 파일 (filename.data)에 유용한 보완와 같은 별도의 파일 (filename.info)에 이러한 의견을 내 보냅니다. </li><li> 시료와 표준 측정되면, 선택 액체 소프트웨어 메뉴에서 옵션을 &quot;중지&quot;-이 &quot;filename.data&quot;로 알려진 영구 파일에 임시 파일에서 데이터를 기록합니다. 누르면 &quot;중단&quot;옵션은 영구적 인 파일로 수집 된 데이터를 작성하지 않고 측정을 종료합니다. </li><li> 실험 종료 반응 용기의 상부에 콕을 해제하여 반응 용기에서 시스템을 분리하고 아세트산 트랩 반응기 튜브 사이를 분리하기 위해 (도 1 참조). 지금 NOA 분석기를 중지 -를 눌러 &quot;일반&quot;, &quot;대기 모드&quot;와 &quot;확인&quot;대기 기계를 넣어 &quot;분석&quot;로 이동합니다. 정기적으로 사용 된 경우기기는 몇 주 동안 대기 상태로 남아있을 수있다. 산소의 공급을 끕니다. 이어서, 반응 챔버로부터 단절 환원 용액을 비우고 유리 반응 용기에서 그 탱크를 닫고 반응 용기 세정을 완료. </li></ol></li><li> 표준 및 샘플 주사 <ol><li> 잘 세척 해밀턴 주사기를 이용하여 반응 혼합물에 1 μM 아질산 용액 50 ㎕를 주입한다. 피크의 좋은 분리를 달성하기 위해 주사 사이의 2 분 - 최소 1 기다립니다. 50 μL의 반복 주입은 각 데이터 포인트에 중복을 얻을 수 있습니다. 각 주사 후 탈 이온수로 주사기를 씻으십시오. </li><li> 1 μM 아질산염 용액 100, 150 μL의 중복 주사를 계속, 표준 곡선 데이터의 전체 세트를 획득하려면 (아질산염 또는 질산염의 높은 농도이 예상되는 경우 추가 200 μL 필요). 각각의 경우에, 신호가 기준으로 다시 떨어질 때까지 기다려야하는데주의를 기울여야하고 1 취득 - 2 마일베이스 라인의, n은 피크의 좋은 분리를 달성했다. 주 : 아질산염 표준은 실험하는 동안 언제든지 측정 할 수있다. 또한 기기의 기능의 독립적 체크로서 기능하지만, 이는, 데이터 측정하기 전에 표준 곡선을 취득하는 것이 바람직하다. 데이터가 수집되면, 시료의 양이 아니라 발음 봉우리로 연결되어야 주입. 그러나이 광전자 증 배관이 만 ~ 800 MV 최대 선형 있음을 명심해야한다 그래서 피크 아무도 ~ 700 MV보다 높을 수 없습니다. 이 주입 양은 시료의 감소 또는 탈 이온수를 이용하여 시료를 희석하여를 얻을 수있다. 각 점은 중복 적어도 측정해야한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
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박사 앨런있는 Schechter는 심혈관 질환의 치료를위한 아질산 염의 사용을 위해 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 발행 된 여러 특허의 공동 발명자로 표시됩니다. 그는 임상 개발하지만 다른 보상을위한 특허의 NIH 라이선스에 따라 로열티를 받는다.

프로토콜 내에서 중요한 단계 원래 샘플을 준비 희석하거나 치료하는 데 사용 (물 포함) 모든 솔루션의 분취 량을 저장해야하고 가능 아질산염 또는 (더 자주) 질산염 오염 검사. 우리는 대부분의 오염 물에서 오는 많은 화학 물질이 또한 내생 질산 결정을 방해하는 몇 가지 많이에서 질산염 오염의 상당량을 함유 샘플 (특히 페리 시안화)을 치료하는 데 사용되는 것으로 나타났...

아질산염, 그리고 덜 확장 질산에, 혈액 수준은 신체의 전반적인 상태를 NO 신진 대사를 반영하지 않습니다. 마이크로 범위 - 아질산염의 혈중 농도와 대부분의 기관 및 조직은 높은 나노 몰거나 낮은 마이크로 몰 범위에서, 질산염이 훨씬 높은 금액에 일반적으로 존재한다. 인한 질병 진행에 아질산 수준의 변화 나 식생활의 변화는 상당히 작기 때문에 단지 매우 민감한 방법을 사용하여 측정 할 수있다. 때문에 매우 다른 수준과 다른 대사 과정의, 아질산염과 질산염 수준의 별도의 결정이 필수적이다. 아질산염과 질산염이 함께 측정 아주 작은 값을 가지고있다 &quot;질소 산화물의 결정&quot;소위 없습니다. 다양한 생물학적 시료의 아질산염의 정량을위한 여러 방법이 개발되어 - 가장 일반적인 원래도 현대 modificatio와 1879에서 설명되었던은 Griess 반응을 이용한 가장 오래된 하나 인NS는은 Griess &#39;방법에 의해 달성 아질산염의 감도 한계는 낮은 마이크로 몰의 범위이다. 트리 요오드 용액을 환원 결합 화학 발광 (CL)은, 현재 아질산염 농도 1-8,10,11 낮은 나노 몰 범위의 정량화를 허용 가장 민감한 방법으로 간주된다. 바나듐 (III) 클로라이드 용액을 줄이는 조합 같은 CL에있어서, 상기 나노 몰 범위 9 정밀도, 질산 민감한 측정에 사용될 수있다. CL은 무료 가스 NO를 감지합니다. 따라서, 아질산염, 질산염, R-nitrosothiols (R-SNO)는, R-니트로 소아 민 (R-NNO) 또는 금속 NO 화합물 (이후 원고라고도 &quot;R- (X) -NO&quot;)로 변환해야 CL을 통해 원래의 양을 정량화하기 위해 NO 가스를 해제하지 않습니다. NO로 변환은 NO 대사 산물의 특성에 따라 여러 가지 환원 용액을 사용하여 달성된다. 변환 후에, 무료 NO 가스는 캐리어 가스 (그는, N에 의해 ​​반응 용기에서 제거되지이 오존 (O 3) 이산화질소를 형성 NO와 결합 CL 분석기의 반응 챔버 내로 AR) (NO 2)의 활성화 된 상태이다. 그라운드 상태로 되돌아와, NO 2 * 적외선 영역에서 방출 및 방출 광자 CL 악기의 광전자 증 배관 (PMT)에 의해 검출된다. 발광 강도는 적절한 보정 곡선을 사용하여 원래 종의 농도의 산출이 가능 반응 챔버의 NO 농도에 정비례한다. 우리의 프로토콜에서는 가장 많이 사용되는 임상 설정에서 아질산염과 질산염의 첫 번째 본 CL 기반의 결정 - 혈액과 혈장, 그리고 우리는 조직 샘플에서 이러한 이온을 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 혈액과 구획 혈장과 적혈구 등의 아질산염 - 반응성 환경에서 본래 생리 아질산염 농도를 보존하는 방법을 상세히 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:351px;">potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfanilamide; AS&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HCl</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">acetic acid, glacial</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">potassium iodide; KI</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">iodine; I2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">207772</td>
			<td>light sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">sodium nitrite; NaNO2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>563218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">vanadium(III) chloride; VCl3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208272</td>
			<td>ligt sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMac</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi</td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sievers NOA 280i</td>
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			<td height="21" style="height:21px;">CLD 88Y</td>
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</table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

산화 질소 (NO), 혈관 항상성과 같은 신경 전달 물질의 주요 조절 분자이다. 효소 생성 된 NO는 다양한 옥시 헴 (heme) 단백질 및 기타 아직 잘 알려져 있지 경로와 상호 작용에 의해 아질산염과 질산염으로 산화된다. 역방향 프로세스는 NO로 아질산염 및 질산염의 환원은 지난 10 년 포유류에서 발견되었다 그것을 방지하거나 것으로 생각된다 심혈관, 대사 및 근육 질환의 전체 범위를 완화하는 하나의 가능한 경로들 중 하나로서 주목 받고있다 NO의 감소 된 수준과 연관 될 수있다. 혈액, 체액 및 다양한 조직 - 다른 신체 구획 NO 및 대사 물질의 양을 추정하는 것이 중요하다. 혈액 의한 쉬운 접근성, NO 대사 추정을 위해 사용되는 것이 바람직 함이다. 그것의 짧은 수명 (밀리 초)과 낮은 서브 나노 몰 농도, NO 혈액의 직접 신뢰할 수있는 측정에 &lt;EM&gt; 생체 본 큰 기술적 인 문제입니다. 따라서 예약 가능한 보통의 산화 생성물, 아질산, 질산의 양에 기초하여 추정되지 않는다. 이 두 대사는 항상 개별적으로 측정된다. 생물학적 체액 및 조직에서 자신의 농도를 결정하기 위해 몇 가지 잘 확립 된 방법이 있습니다. 여기에서 우리는 각각 트리 요오드 또는 바나듐 (III) 클로라이드 솔루션에 의해 아질산염이나 질산염 감소 후 NO의 spectrophotometrical 검출에 기초하여, 화학 발광 법 (CL)에 대한 프로토콜을 제시한다. 아질산염 및 질산염 검출 감도는 NO 대사 경로의 변화를 결정하기 위해 현재 이용 가능한 가장 민감한 방법으로 CL 설정 낮은 나노 몰 범위이다. 우리의 샘플에서 각각의 양을 결정하는 방법과 수집시 아질산염 및 질산염 본 원래 양을 보존하기 위해 생물학적 유체 및 조직으로부터 샘플을 준비하는 방법을 상세히 설명한다. CL 기술의 한계도 특급lained.

그림 2는 표준과 다섯 가지의 샘플에서 수집 한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 도면에 도시 된 바와 같이, 광전자 전압 증가 아질산염 - 함유 용액 (표준 또는 샘플) 용액을 감소 주입 직후의 기준 값으로 복귀 주입에 한꺼번에 아질산 본 (주사 시간은 적색 곡선 아래의 화살표로 표시된다) 용액을 감소시켰다. 또한 정확한 부피 측정 재현성 높은 데이터를 얻?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method at JoVE.com

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

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22.4K 조회수.  NIDDK, NIH. Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

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Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

연구

생물학

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

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Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

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