저자는 혈액에서 아질산염 측정을위한 아질산 보존 용액의 사용을 개발 박사 A. Dejam와 MM의 Pelletier의 중요한 기여를 인정합니다.

동물의 사용을 포함한 모든 프로토콜은 NIDDK 동물 관리 및 사용위원회에 의해 사용이 승인되었고, 인간의 혈액은 건강한 기증자로부터 NIH 혈액 은행에서 얻었다. 1. 샘플 준비 <ol><li> 아질산염 보존 용액의 조제 <ol><li> 890 MM의 페리 시안화 칼륨 함유 한 용액 준비 (K 3의 Fe (CN)을 6) 및 증류수에 118 밀리미터 NEM (N-에틸 말레이 미드). 그것은 현재없이 결정 노란색 선명해질 때까지 잘 녹여. 9 비율 (V / V를, NP-40 / 솔루션) : 1에서 NP-40 (옥틸 phenoxylpolyethoxylethanol)를 추가합니다. )에 대한 주 동안 4 ° C에서 발포 및 저장을 피하기 위해 부드럽게 섞는다. </li></ol></li><li> 수집 및 혈액 샘플의 제조 <ol><li> 응고 (5 U / ㎖)을 방지하기 위해 헤파린 용혈을 방지하기 위해 적어도 20 G 바늘을 사용하여 혈액을 수집한다. (4 비율 절 : 전체 혈액 샘플의 경우, 아질산염은 1에서 즉시 해결책을 유지하여 혈액을 혼합/ V 솔루션 / 혈액). </li><li> 혈장과 적혈구 샘플은 원심 분리 4 ℃에서 4,000 × g으로 5 분에 수집 된 혈액을 적혈구 (RBC) 및 혈장을 분리한다. 상층 액 (혈장)을 가지고 플라즈마 아질산염 농도의 측정에 대해 상술 한 바와 같이 아질산 용액을 유지와 함께 혼합한다. </li><li> 조심스럽게 차단 피펫 팁을 이용하여 혈액 세포의 다른 형태에 의한 오염을 방지하기 위해 관의 하단에서 샘플 피펫 RBC 샘플로부터 혈장과 버피 코트를 나머지 제거 같은 아질산염 보존 용액을 함유하는 관에 옮긴다 상기와 비율. </li><li> 1 또는 1 : 비율 1 냉 메탄올 각 샘플 (플라즈마 및 RBC)를 혼합 2 (v / V를 샘플 / 메탄올)과 단백질을 침전시켜 15 분 동안 4 ° C에서 13,000 XG에 그들을 원심 분리기. -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 필요한 경우, 상층 액을 가지고 아질산염 측정을 위해 사용하거나 준비된 샘플을 동결. 참고 : 아질산염이 빠르게 REA혈액 형성 질산에 산화 헤모글로빈 (oxyHb)와 캐럿. oxyHb 항상 아질산 이상의 과량으로 존재하기 때문에,이 반응은 10 분 ~의 시간 프레임 네이티브 혈액 아질산 거의 완전히 소멸 리드. 내인성 혈액 아질산염의 대부분을 보존하기 위해, 아질산 보존 용액은 즉시 채혈 후의 전혈 샘플에 첨가한다. 용액을 신속하게, 화학적 아질산과 반응하지 않는 헤모글로빈의 비활성 형태 적혈구 용균 및 메트 헤모글로빈 (metHb) oxyHb로 산화된다. </li></ol></li><li> 다른 유형의 체액 샘플에서의 제조 <ol><li> 적당한 용기에 시료 채취 후, 아질산 보존 솔루션, deproteinate과 잘 혼합하고 즉시 측정하거나 -80 ° C에서 동결 및 저장. </li></ol></li><li> 수집 및 조직 샘플의 제조 <ol><li> 헤파린 염수 용액 (10 U 헤파 관류 동물 조직 수집린 / ㎖). 원하는 조직의 소비세 약 1 g 및 균질화 중 하나를 수동으로 균질화 또는 자동화 된 호모 게 나이저를 사용하여. </li><li> 부드러운 균질를 달성하기 위해 필요한 솔루션을 보존 아질산염의 알려진 금액을 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 39 ° C에서 전술 한 바와 같이 (2 비 V / V 샘플 / 메탄올 : 1 또는 1) 13,000 XG에서 원심 분리 한 후 시료의 조직이 균질화되면, 냉 메탄올을 사용하여 단백질을 침전. </li><li> 뜨는 및 측정 아질산염 수준을 수집합니다. 필요한 경우, -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 대한 준비의 모든 단계에서 샘플을 동결. </li></ol></li></ol> 솔루션을 감소 2. 준비 <ol><li> 트라이 - 요오드 (I 3) 아질산염 및 R- (X) -NO 종 결정 1,3,4에 대한 솔루션을 감소 <ol><li> 물에 138 밀리미터 I 2 용액과 함께 301 mM의 KI 용액을 준비합니다. 모든 때까지 ~ 30 분 동안 자기 교반기 7 비율 (V /의 / v 용액 산) : 2 빙초산과 혼합결정을 용해시킨다. 바람직하게는 요오드화 민감한 빛으로 어두운 병에 보관하고, 제조로부터 1 주일 이내에 사용한다. 참고 :이 솔루션은 NO에 아질산염을 줄일 수 있으며 또한 R-SNO, R-NNO 및 Fe-NO 작용기 (R-(X) -NO)에서 NO 해제되지만, 질산염은 영향을받지 않습니다. 상기 NO 계 관능기로부터 신호 산성화 설파 닐 아미드 (AS) 및 AS 처리 비교 미처리 신호 샘플의 절반의 처리에 의해 참된 아질산 신호로부터 분리 될 수있다. AS 비가 역적으로 아질산으로 디아 조늄 양이온을 형성하고,이 복합체는 I 3 용액에 의해 감소 될 수 없다. 치료 AS를 들어, 1 M 염산에 설파 닐 아미드의 290 mM의 용액을 제조하고 비 1 시료의 분취 량에 추가 : 9 (v / V를 AS / 샘플). 샘플의 AS 처리 및 치료 부분에서 CL 신호를 측정한다. 샘플의 AS 처리 및 처리되지 않은 부분의 차이로 실제 아질산염 신호를 계산합니다. 아질산염은 선택적 NIT를 사용하여 측정 할 수있다라이트 저감 ​​부 2.2에 기재된 아스코르브 / 아세트산 혼합물 용액. 그러나, 본 -NO 종 R- (X)의 보통 소량 AS 미처리 샘플을 이용하여 측정 아질산 총 함량의 좋은 근사 대부분의 경우에 의한. </li></ol></li><li> 아질산염 2의 선택적 결정을위한 아스코르브 산 / 아세트산 (4A) 솔루션 <ol><li> 물에 500 밀리미터의 아스 코르 빈산을 준비합니다. 반응 혼합물을 제조 7 (V / V, 아스코르브 산 / 아세트산) 비율 1 빙초산이 용액을 혼합한다. 참고 :이 솔루션은 아질산염에 대한 특정이며, 모든 R- (X) -NO 종 또는 질산에서 NO 공개하지 않습니다. 아스코르브 산 용액에 쉽게 산화 그러나 아스코르브 아세트산 용액을 매일 측정 전에 신선하게 제조되어야한다. 아질산 환원 완료 아스코르브 산 농도에 의존한다; 적어도 50 MM의 아스 코르 빈산는 전체 R을 권장합니다플라즈마 아질산 냄. 그러나, 이전의 마지막 샘플의 측정을 기대 아질산염 농도 범위 아스코르브 산과 아질산 표준 상이한 농도로 몇 파일럿 실험을 수행 할 것을 권장한다. 아스 코르 빈산 약간 측정하는 동안 고갈 있다는 사실을 숙지, 유리 반응 챔버의 반응 혼합물을 너무 자주 변경을 권장합니다. </li></ol></li><li> 질산 판정 9 바나듐 (III) 클로라이드 환원 용액 <ol><li> 1 M 염산에 식 VC1 3의 51 mM의 솔루션을 준비합니다. 어두운 병에 200 μm의 필터와 매장을 통해 필터 솔루션은 2 주 이내에 사용한다. 참고 :이 솔루션은 질산염, 아질산염 및 모든 R- (X) -NO 종을 줄일 수 있으므로 계산하는 아질산염 또는 기타 R-의 비교 양 (X) -NO 종을 함께 질산과 존재, 최종 질산염 함량이 경우 식 VC1 3 I 얻어진 CL 신호들 간의 차이로서세 용액을 감소시킨다. </li></ol></li></ol> 3. 화학 발광 (CL) 분석기 설치 및 측정 <ol><li> 표준 용액 <ol><li> 아질산 나트륨 용액을 1 μM (에 NaNO 2)을 준비한다. 동일한 용액 아질산염 및 질산염 결정에 사용될 수있다. </li></ol></li><li> NO 분석기를 사용하지 참고 : 현재 생물학적 연구 목적으로 충분히 구분이 상업적으로 사용 가능한 분석기가 없습니다 - SIEVERS NOA와 Ecophysics CLD의 88Y이. 이들은 모두 동일한 원리로 동작; 주요 차이점은 CLD 88Y 오존 있도록 실내 공기로부터 산소를 사용하는 것이다 (O 3) NOA이 목적을 위해 외부 산소 탱크를 필요로있다. 아래의 절차는 SIEVERS NOA의 설정을 설명합니다. <ol><li> 장비 설치 <ol><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 NO 분석기의 초기 설정을 수행합니다로 그림 1에서 볼. </li><li> 악기에 연결 열기 O 2 탱크. &quot;분석&quot;을 선택하고 전면 패널의 주 메뉴에서 &quot;입력&quot;. 다음 화면에서 선택 &quot;시작&quot;을 누르면 &quot;입력합니다.&quot; 그림 1에서 볼 수 있듯이 악기 (1 M NaOH를 함유) 산 트랩을 연결합니다. </li><li> 광전자 증은 -12 ° C 이하의 온도로 냉각하고, 반응 챔버는 6 토르에 철수 될 때까지 기다립니다. 그것은 안정된 평면 기준에 도달하기 약 30 분 소요됩니다. 베이스 라인은 (1) 내에 안정 필요 - 2 MV, 공칭 값은 안정성보다 중요하다. 참고 : 질산염을 측정하는 경우, 냉각 (산, 물, 증기뿐만 냉각 트랩을 제공 4 ° C에서 설정) 수조 및 가열 수조 (주 반응 챔버, 95 ° C)를 켭니다. 식 VC1 3 용액에 질산 NO의 감소율은 온도 의존적이며, 실내 템페 매우 느리다rature는 온도 정도로 크게 증가하여 반응을 관찰 할 필요가있다. </li><li> 헬륨 탱크를 열고 그림 1에서와 같이 산 함정에 유리 반응 챔버를 연결합니다. 적절한 환원 용액과의 반응 챔버를 채우고 최소 버블을 감소시키고 산 트랩에 반응 챔버를 연결한다. 시행 착오를 사용하여 악기 흡입 속도 (Siever의 NOA에 대한 보통 ~ 200 ml / 분)와 일치하는 그는 버블 링 속도를 조정합니다. </li><li> 기기를 제어하는 ​​컴퓨터를 켜고와 LabVIEW 기반의 액체 소프트웨어를 시작합니다. 악기와 수집 소프트웨어를 누르 사이의 통신을 설정하려면 화면이 표시 될 때까지 &quot;데이터 메뉴&quot;의 &quot;출력 활성화&quot;할 때, 다음 &quot;명확한&quot;를 눌러 데이터 화면으로 다시 돌아갑니다 &quot;입력&quot;. </li><li> 화면에 안정적인베이스 라인 추적 기다린 격막을 통해 솔루션을 감소로 샘플 및 아질산염 기준을 주입 시작합니다. 항상 안정된베이스 라인 후방에 도달하는 대기피크 어. 이 2 분까지 걸릴 수 있습니다. 액상 소프트웨어는 주입의 옵션을 &quot;마크&quot;시간을 가지고 있으며, 사출 주석과 데이터 파일 (filename.data)에 유용한 보완와 같은 별도의 파일 (filename.info)에 이러한 의견을 내 보냅니다. </li><li> 시료와 표준 측정되면, 선택 액체 소프트웨어 메뉴에서 옵션을 &quot;중지&quot;-이 &quot;filename.data&quot;로 알려진 영구 파일에 임시 파일에서 데이터를 기록합니다. 누르면 &quot;중단&quot;옵션은 영구적 인 파일로 수집 된 데이터를 작성하지 않고 측정을 종료합니다. </li><li> 실험 종료 반응 용기의 상부에 콕을 해제하여 반응 용기에서 시스템을 분리하고 아세트산 트랩 반응기 튜브 사이를 분리하기 위해 (도 1 참조). 지금 NOA 분석기를 중지 -를 눌러 &quot;일반&quot;, &quot;대기 모드&quot;와 &quot;확인&quot;대기 기계를 넣어 &quot;분석&quot;로 이동합니다. 정기적으로 사용 된 경우기기는 몇 주 동안 대기 상태로 남아있을 수있다. 산소의 공급을 끕니다. 이어서, 반응 챔버로부터 단절 환원 용액을 비우고 유리 반응 용기에서 그 탱크를 닫고 반응 용기 세정을 완료. </li></ol></li><li> 표준 및 샘플 주사 <ol><li> 잘 세척 해밀턴 주사기를 이용하여 반응 혼합물에 1 μM 아질산 용액 50 ㎕를 주입한다. 피크의 좋은 분리를 달성하기 위해 주사 사이의 2 분 - 최소 1 기다립니다. 50 μL의 반복 주입은 각 데이터 포인트에 중복을 얻을 수 있습니다. 각 주사 후 탈 이온수로 주사기를 씻으십시오. </li><li> 1 μM 아질산염 용액 100, 150 μL의 중복 주사를 계속, 표준 곡선 데이터의 전체 세트를 획득하려면 (아질산염 또는 질산염의 높은 농도이 예상되는 경우 추가 200 μL 필요). 각각의 경우에, 신호가 기준으로 다시 떨어질 때까지 기다려야하는데주의를 기울여야하고 1 취득 - 2 마일베이스 라인의, n은 피크의 좋은 분리를 달성했다. 주 : 아질산염 표준은 실험하는 동안 언제든지 측정 할 수있다. 또한 기기의 기능의 독립적 체크로서 기능하지만, 이는, 데이터 측정하기 전에 표준 곡선을 취득하는 것이 바람직하다. 데이터가 수집되면, 시료의 양이 아니라 발음 봉우리로 연결되어야 주입. 그러나이 광전자 증 배관이 만 ~ 800 MV 최대 선형 있음을 명심해야한다 그래서 피크 아무도 ~ 700 MV보다 높을 수 없습니다. 이 주입 양은 시료의 감소 또는 탈 이온수를 이용하여 시료를 희석하여를 얻을 수있다. 각 점은 중복 적어도 측정해야한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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박사 앨런있는 Schechter는 심혈관 질환의 치료를위한 아질산 염의 사용을 위해 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 발행 된 여러 특허의 공동 발명자로 표시됩니다. 그는 임상 개발하지만 다른 보상을위한 특허의 NIH 라이선스에 따라 로열티를 받는다.

프로토콜 내에서 중요한 단계 원래 샘플을 준비 희석하거나 치료하는 데 사용 (물 포함) 모든 솔루션의 분취 량을 저장해야하고 가능 아질산염 또는 (더 자주) 질산염 오염 검사. 우리는 대부분의 오염 물에서 오는 많은 화학 물질이 또한 내생 질산 결정을 방해하는 몇 가지 많이에서 질산염 오염의 상당량을 함유 샘플 (특히 페리 시안화)을 치료하는 데 사용되는 것으로 나타났...

아질산염, 그리고 덜 확장 질산에, 혈액 수준은 신체의 전반적인 상태를 NO 신진 대사를 반영하지 않습니다. 마이크로 범위 - 아질산염의 혈중 농도와 대부분의 기관 및 조직은 높은 나노 몰거나 낮은 마이크로 몰 범위에서, 질산염이 훨씬 높은 금액에 일반적으로 존재한다. 인한 질병 진행에 아질산 수준의 변화 나 식생활의 변화는 상당히 작기 때문에 단지 매우 민감한 방법을 사용하여 측정 할 수있다. 때문에 매우 다른 수준과 다른 대사 과정의, 아질산염과 질산염 수준의 별도의 결정이 필수적이다. 아질산염과 질산염이 함께 측정 아주 작은 값을 가지고있다 &quot;질소 산화물의 결정&quot;소위 없습니다. 다양한 생물학적 시료의 아질산염의 정량을위한 여러 방법이 개발되어 - 가장 일반적인 원래도 현대 modificatio와 1879에서 설명되었던은 Griess 반응을 이용한 가장 오래된 하나 인NS는은 Griess &#39;방법에 의해 달성 아질산염의 감도 한계는 낮은 마이크로 몰의 범위이다. 트리 요오드 용액을 환원 결합 화학 발광 (CL)은, 현재 아질산염 농도 1-8,10,11 낮은 나노 몰 범위의 정량화를 허용 가장 민감한 방법으로 간주된다. 바나듐 (III) 클로라이드 용액을 줄이는 조합 같은 CL에있어서, 상기 나노 몰 범위 9 정밀도, 질산 민감한 측정에 사용될 수있다. CL은 무료 가스 NO를 감지합니다. 따라서, 아질산염, 질산염, R-nitrosothiols (R-SNO)는, R-니트로 소아 민 (R-NNO) 또는 금속 NO 화합물 (이후 원고라고도 &quot;R- (X) -NO&quot;)로 변환해야 CL을 통해 원래의 양을 정량화하기 위해 NO 가스를 해제하지 않습니다. NO로 변환은 NO 대사 산물의 특성에 따라 여러 가지 환원 용액을 사용하여 달성된다. 변환 후에, 무료 NO 가스는 캐리어 가스 (그는, N에 의해 ​​반응 용기에서 제거되지이 오존 (O 3) 이산화질소를 형성 NO와 결합 CL 분석기의 반응 챔버 내로 AR) (NO 2)의 활성화 된 상태이다. 그라운드 상태로 되돌아와, NO 2 * 적외선 영역에서 방출 및 방출 광자 CL 악기의 광전자 증 배관 (PMT)에 의해 검출된다. 발광 강도는 적절한 보정 곡선을 사용하여 원래 종의 농도의 산출이 가능 반응 챔버의 NO 농도에 정비례한다. 우리의 프로토콜에서는 가장 많이 사용되는 임상 설정에서 아질산염과 질산염의 첫 번째 본 CL 기반의 결정 - 혈액과 혈장, 그리고 우리는 조직 샘플에서 이러한 이온을 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 혈액과 구획 혈장과 적혈구 등의 아질산염 - 반응성 환경에서 본래 생리 아질산염 농도를 보존하는 방법을 상세히 설명한다.

<table><tbody><tr><td>potassium ferricyanide; K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide; AS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid, glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>potassium iodide; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iodine; I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>light sensitive, toxic</td></tr><tr><td>sodium nitrite; NaNO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>vanadium(III) chloride; VCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>ligt sensitive, toxic</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&amp;nbsp;Ecophysics&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

산화 질소 (NO), 혈관 항상성과 같은 신경 전달 물질의 주요 조절 분자이다. 효소 생성 된 NO는 다양한 옥시 헴 (heme) 단백질 및 기타 아직 잘 알려져 있지 경로와 상호 작용에 의해 아질산염과 질산염으로 산화된다. 역방향 프로세스는 NO로 아질산염 및 질산염의 환원은 지난 10 년 포유류에서 발견되었다 그것을 방지하거나 것으로 생각된다 심혈관, 대사 및 근육 질환의 전체 범위를 완화하는 하나의 가능한 경로들 중 하나로서 주목 받고있다 NO의 감소 된 수준과 연관 될 수있다. 혈액, 체액 및 다양한 조직 - 다른 신체 구획 NO 및 대사 물질의 양을 추정하는 것이 중요하다. 혈액 의한 쉬운 접근성, NO 대사 추정을 위해 사용되는 것이 바람직 함이다. 그것의 짧은 수명 (밀리 초)과 낮은 서브 나노 몰 농도, NO 혈액의 직접 신뢰할 수있는 측정에 &lt;EM&gt; 생체 본 큰 기술적 인 문제입니다. 따라서 예약 가능한 보통의 산화 생성물, 아질산, 질산의 양에 기초하여 추정되지 않는다. 이 두 대사는 항상 개별적으로 측정된다. 생물학적 체액 및 조직에서 자신의 농도를 결정하기 위해 몇 가지 잘 확립 된 방법이 있습니다. 여기에서 우리는 각각 트리 요오드 또는 바나듐 (III) 클로라이드 솔루션에 의해 아질산염이나 질산염 감소 후 NO의 spectrophotometrical 검출에 기초하여, 화학 발광 법 (CL)에 대한 프로토콜을 제시한다. 아질산염 및 질산염 검출 감도는 NO 대사 경로의 변화를 결정하기 위해 현재 이용 가능한 가장 민감한 방법으로 CL 설정 낮은 나노 몰 범위이다. 우리의 샘플에서 각각의 양을 결정하는 방법과 수집시 아질산염 및 질산염 본 원래 양을 보존하기 위해 생물학적 유체 및 조직으로부터 샘플을 준비하는 방법을 상세히 설명한다. CL 기술의 한계도 특급lained.

그림 2는 표준과 다섯 가지의 샘플에서 수집 한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 도면에 도시 된 바와 같이, 광전자 전압 증가 아질산염 - 함유 용액 (표준 또는 샘플) 용액을 감소 주입 직후의 기준 값으로 복귀 주입에 한꺼번에 아질산 본 (주사 시간은 적색 곡선 아래의 화살표로 표시된다) 용액을 감소시켰다. 또한 정확한 부피 측정 재현성 높은 데이터를 얻?...

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Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

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Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

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22.4K 조회수.  NIDDK, NIH. Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

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A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

연구

암 연구학

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

산화 질소 가스와 해충에 대 한 훈 증 실험실의 절차

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

환경과학

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

의학

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH oxidase has critical signaling functions that modulate the inflammatory response 1. Thus, the development of a method to measure in "real-time" the kinetics of NADPH oxidase-derived ROS generation is expected to be a valuable research tool to understand mechanisms relevant to host defense, inflammation, and injury.
Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the NADPH oxidase characterized by severe infections and excessive inflammation. Activation of the phagocyte NADPH oxidase requires translocation of its cytosolic subunits (p47phox, p67phox, and p40phox) and Rac to a membrane-bound flavocytochrome (composed of a gp91phox and p22phox heterodimer). Loss of function mutations in any of these NADPH oxidase components result in CGD. Similar to patients with CGD, gp91phox -deficient mice and p47phox-deficient mice have defective phagocyte NADPH oxidase activity and impaired host defense 2, 13. In addition to phagocytes, which contain the NADPH oxidase components described above, a variety of other cell types express different isoforms of NADPH oxidase.
Here, we describe a method to quantify ROS production in living mice and to delineate the contribution of NADPH oxidase to ROS generation in models of inflammation and injury. This method is based on ROS reacting with L-012 (an analogue of luminol) to emit luminescence that is recorded by a charge-coupled device (CCD). In the original description of the L-012 probe, L-012-dependent chemiluminescence was completely abolished by superoxide dismutase, indicating that the main ROS detected in this reaction was superoxide anion 14. Subsequent studies have shown that L-012 can detect other free radicals, including reactive nitrogen species 15, 16. Kielland et al. 16 showed that topical application of phorbol myristate acetate, a potent activator of NADPH oxidase, led to NADPH oxidase-dependent ROS generation that could be detected in mice using the luminescent probe L-012. In this model, they showed that L-012-dependent luminescence was abolished in p47phox-deficient mice.
We compared ROS generation in wildtype mice and NADPH oxidase-deficient p47phox-/- mice 2 in the following three models: 1) intratracheal administration of zymosan, a pro-inflammatory fungal cell wall-derived product that can activate NADPH oxidase; 2) cecal ligation and puncture (CLP), a model of intra-abdominal sepsis with secondary acute lung inflammation and injury; and 3) oral carbon tetrachloride (CCl4), a model of ROS-dependent hepatic injury. These models were specifically selected to evaluate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the context of non-infectious inflammation, polymicrobial sepsis, and toxin-induced organ injury, respectively. Comparing bioluminescence in wildtype mice to p47phox-/- mice enables us to delineate the specific contribution of ROS generated by p47phox-containing NADPH oxidase to the bioluminescent signal in these models.
Bioluminescence imaging results that demonstrated increased ROS levels in wildtype mice compared to p47phox-/- mice indicated that NADPH oxidase is the major source of ROS generation in response to inflammatory stimuli. This method provides a minimally invasive approach for "real-time" monitoring of ROS generation during inflammation in vivo.

NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in phagocytes. Because of the ephemeral nature of ROS, it is difficult to measure and monitor ROS levels in living animals. A minimally invasive method for serial quantification of ROS in living mice is described.

다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

면역학 및 감염병학

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

생체공학

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

생물학

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

유전자 인코딩 된 형광 산화 질소의 응용 프로그램 (• NO) 단일 세포에서 NO • 신호의 실시간 이미징을위한 프로브의 geNOps,

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...