JDM은 INSERM / Région Aquitaine의 PhD 펠로우쉽에 의해 후원되었으며 Mount Sinai School of Medicine의 박사후 ARC 펠로우쉽과 Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. EH는 Ministère de l&#39; Enseignement Supérieur et de la Recherche의 박사 과정에서 지원됩니다. ZE는 ANR (Agence Nationale de la Recherche)의 박사후 연구원이 후원합니다. CM은 Mount Sinai School of Medicine의 Tisch Cancer Institute에서 지원하고 JJBC는 NIH / NCI 보조금 K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund 및 Mount Sinai School of Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. 이 작업은 ANR-13-JJC-JSV1-0005의 보조금으로 지원되었습니다. FS는 &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;에 의해 지원됩니다. VM 및 FS는 &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot;및 National de Cancer Institut, INCA_8036 및 PLBio2012에서 자금을 지원받습니다.

참고 : 고정하기 전에 모든 단계는 멸균 층류 후드에서 완료됩니다. 1. 2D 매트릭스 참고 : 2D 행렬은 침입자를 형성하는 세포의 비율과 세포 당 매트릭스 분해 영역을 결정하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> 그림 1 : 프로토콜. 젤라틴 및 콜라겐 I 매트릭스를 제조하는 데 사용 된 프로토콜 요약. 젤라틴 매트릭스 만 만들거나 젤라틴과 콜라겐 혼합 매트릭스를 만들 수 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 젤라틴 매트릭스 참고 : 형광 젤라틴 매트릭스는 매트릭스 분해를 정량화하는 데 사용되며 비 형광 젤라틴은 콜라겐 I 섬유의 접착을 촉진하는 데 사용됩니다. 형광 젤라틴 매트rices는 또한 podosome 및 invadopodia 연구에 사용됩니다 ( 그림 1 참조). <ol><li> 멸균 층류 후드 아래에서 작업 영역에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓고 70 % 에탄올로 소독합니다. </li><li> 1 ㎝ 간격으로 줄 지어 1 ㎎ / mL 젤라틴의 분액 20 μL 액적; 방울 조직에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오. </li><li> 각 20 μL 젤라틴 방울을 압력솥 유리 coverslip (직경 12 mm)로 덮으십시오. </li><li> 실온에서 20 분 동안 품어 낸다. 젤라틴이 형광등 인 경우 빛으로부터 보호하십시오. </li><li> 1 분 1 초 인산염 완충 식염수 (PBS)에 0.5 % 글루 타르 알데히드 40 μL의 작은 방울을 각각 1.1.3 단계의 커버 슬립 줄 아래 약 1 cm 간격으로 배치합니다. 주의 : 글루 타르 알데히드는 독성 정착 제입니다. 장갑을 착용하고 흡입하지 마십시오. </li><li> 보석 포셉을 사용하여 각 젤라틴 코팅 coverslip을 glutaraldehyde 방울로 이동하십시오. 참고 : Itparafilm에 작은 젤라틴 물방울이 남는 것이 정상입니다. 이것을 다른 실험에 다시 사용하지 마십시오. </li><li> 실온에서 40 분 동안 품어 낸다. 형광 커버 슬립의 경우 빛으로부터 보호하십시오. </li><li> 24 잘 세포 배양 접시를 가지고 멸균 1X PBS의 500 μL로 각 우물을 작성하십시오. 각 우물에 coverslips, 젤라틴면을 올려 놓으십시오. </li><li> 5 분 각각에 대해 1x PBS로 두 번 씻으십시오. 참고 :이 단계에서 coverslips는 실험에 사용하거나 4 ° C에서 1x PBS에 저장할 수 있습니다. 비 형광 coverslips은 일주일 동안 저장할 수 있으며, 형광 coverslips은 48 시간 동안 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스 참고 : 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스는 선형인데 도좀 형성 및 관련 매트릭스 분해를 연구하는 데 사용됩니다. 형광 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 콜라겐 섬유와 invadosome 마커를 colocalize하는 데 사용됩니다 ( 예 : F - 굴지 나는원적외선 채널, 적색 채널의 콜라겐 I, 녹색 채널의 Tks5, 핵 얼룩의 Hoechst 염료). 반면에 비 형광성 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 염색 된 침입자 마커의 수를 최대화하기 위해 사용됩니다 ( 예 : 적색 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 코르 탁틴, 녹색 채널, 핵 염색을위한 Hoechst 염료). 마지막으로 형광이없는 콜라겐 I과 형광성 젤라틴 coverslips의 조합을 사용하여 젤라틴 관련 분해를 측정합니다 ( 예 : 원적외선 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 Tks5, 녹색 채널의 Tks5 및 헴스트 염료 핵 염색을 위해) (그림 1 참조). Hoechst 염료는 핵을 염색하는데 사용되며, 또한 사용 된 세포주에서 정기적으로 수행되는 PCR 검사와 더불어 마이코 플라스마 오염을 검사합니다. <ol><li> 형광 콜라겐 I <ol><li> 0.02 N 아세트산에서 쥐 - 꼬리 힘줄에서 추출한 상업용 콜라겐을 사용하십시오.디. 콜라겐 I의 0.4mg / mL의 최종 농도에서 coverslip 당 500μL의 용액을 준비하는데 필요한 콜라겐의 양을 제거하십시오. </li><li> 콜라겐 I 용액 (nx 500 μL)의 최종 부피를 계산하여 10 μg / mL의 최종 농도로 5-carboxy x rhodamine succinimidyl ester를 첨가한다. </li><li> 위 아래로 pipetting하여 솔루션을 혼합하고 빛으로부터 보호, 실온에서 5 분 품어. </li><li> 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS)으로 최종 부피로 희석하고 직접 사용하십시오. </li></ol></li><li> 섬유소 콜라겐 나는 coverslip <ol><li> 이전에 단계 1.1에서 준비한 비 형광 또는 형광 젤라틴 coverslips를 사용하십시오. </li><li> 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X DPBS에서 0.4mg / mL의 최종 농도로 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 준비합니다. </li><li> 500 μL의 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 추가합니다coverslip 24- 웰 세포 배양 접시에. </li><li> 콜라겐 중합을 위해 37 ° C에서 4 시간 동안 인큐베이션한다. </li><li> 부화 후, 매트릭스를 손상을 피하기 위해 (물론 coverslip에 아닙니다)의 측면에 플레이트와 pipetting 기울여하여 콜라겐 과잉을 제거합니다. 참고 :이 행렬은 저장할 수 없습니다. 과잉 콜라겐을 제거한 직후에 세포에 씨를 뿌린다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 세포 파종, 배양 시간 및 고정 <ol><li> 세포 유형에 따라, 적절한 배지에 세포를 준비하고 우물 당 500 μL의 최종 볼륨에 대한 세포를 추가합니다. </li><li> 선형 invadosomes를 형성하고 매트릭스를 저하시키는 세포주의 능력을 특성화하기 위해 선형 invadosome 형성 및 관련 저하 활동의 속도론을 결정하기 위해 콜라겐 I 매트릭스에 4 시간, 12 시간 및 24 시간 동안 세포를 플레이트하십시오. 참고 : 표 1 은 세포주실험실에서 테스트되었습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 세포주 </td><td> coverslip 당 세포의 수 </td><td> 선형 invadosome 부량을위한 모체와의 접촉 시간 </td><td> 선형 invadosome 분해 활성의 정량을위한 matrix와의 접촉 시간 </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40,000 </td><td> 4 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr><tr><td> HUH7 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> 서울대 398 호 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> NIH 3T3 src </td><td> 30,000 </td><td> 4 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50,000 </td><td> 6시 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 후# 160; </td></tr><tr><td> 노골적인 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 세포 파종 및 배양 시간 참고. 이 표는 선형 invadosomes를 연구하는 데 사용되는 세포 라인의 비 포괄적 인 목록을 제공합니다. 이것은 매트릭스에 시드 할 세포의 수, 선형 침입자를 관찰하는 데 필요한 시간 및 관련 매트릭스 분해를 관찰하는 데 필요한 시간을 나타냅니다. 선형 침입자는 수명이 짧습니다. 세포의 최대 숫자에서 선형 invadosomes을 관찰 할 수 있도록, 세포는 시간이 짧은 기간 동안 콜라겐 전 매트릭스와 접촉해야합니다. 반면에,보고 된 젤라틴 분해를 시각화 할 수 있으려면 세포는 콜라겐 I 매트릭스와 위에 나열된 것보다 오랜 기간 동안 접촉해야합니다. </li><li> 세포 배양 배지를 제거한 후,1X PBS에 4 % paraformaldehyde 500 μL 10 분 coverslips을 수정. </li><li> 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 빛으로부터 보호 된 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 3. 면역 형광법 <ol><li> 신선하게 준비된 용액으로 10 분 동안 세포를 침투시킨다. 1X PBS 중 0.2 % Triton X-100. 이 솔루션을 다시 사용하지 마십시오. </li><li> coverslips를 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 벤치에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓습니다. </li><li> 재료 표 에 설명 된대로 1x PBS에 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 기본 항체를 희석합니다. </li><li> 한 줄에 1 차 항체 용액을 50 μL 나누어 각각 약 1 cm 간격으로 둡니다. </li><li> 각 coverslip을 물방울에 놓습니다. </li><li> 빛으로부터 보호 된 실온에서 40 분 동안 품어 낸다. </li><li> 잠복기 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 2 차 항체, phalloidin, Hoechst dye를 1 % BSA 4 %PBS. </li><li> 분량 50μL의 혼합 액을 각각 이전에 행한 것처럼 coverslips의 첫 번째 줄 아래 약 1cm 간격으로 배치합니다. </li><li> 각 coverslip을 물방울에 놓습니다. </li><li> 빛으로부터 보호 된 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 부화 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 증류수로 한 번 씻어서 소금을 제거하십시오. </li><li> 마운팅 매체 중합과 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재하십시오. </li><li> 현미경 검사 전에 실온에서 밤 사이에 커버 슬립을 건조시켜 빛으로부터 보호하십시오. </li></ol> 4. 수량 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> 그림 2 : 선형 침입 정량. 매크로는 F - 굴지와 Tks5 얼룩 (형식 : 1,024 X 1,024)의 공 촛점 이미지가 필요합니다. ( A ) 먼저 F-actin 그림을 열고 가면을 만드십시오. ( B ) 그런 다음, openTks5 그림과 그것을 임계 값. 매크로를 적용하십시오. ( C ) 분석 결과는 두 테이블에 나타납니다. 셀당 선형 침입자의 수와 셀의 선형 침입자가 사용하는 백분율 영역과 같은 기타 정보는 요약 테이블에 있습니다. 각 선형 침입자의 크기는 결과 테이블에 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 선형 invadosomes를 형성하는 세포의 백분율 <ol><li> 선형 invadosomes를 형성 셀을 계산, coverslip 당 약 100 세포 (기술 triplicates를 사용). n 당 3,000 개 이상의 세포를 정량화하십시오. </li><li> 세 번의 독립적 인 실험의 평균을 취하여 선형 인베 돌좀을 형성하는 세포의 백분율을 계산하면 900 개의 정량 세포가 생성됩니다. </li></ol></li><li> 세포 당 선형 침입 크기 및 수 <li> 보충 매크로와 함께 ImageJ를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 세포 당 분해 <ol><li> 조건 당 3 개의 커버 슬립을 사용하십시오. </li><li> 형광 젤라틴과 Hoechst 얼룩 핵의 coverslip 당 30 이미지를 가져 가라. </li><li> Martin KH et al. 에 설명 된대로 ImageJ 소프트웨어를 사용하십시오 . 9 . </li></ol></li></ol> 5. 3D 콜라겐 침입 분석 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> 그림 3 : 침입 분석 스키마. 침략 분석 프로토콜 요약. 콜라겐 I은 숙신 이미 딜 에스테르 염료와 가교 결합되어 37 ° C에서 1 시간 동안 중합됩니다. 세포는 혈청이없는 배지에 콜라겐 I 플러그 위에 첨가됩니다. 삽입물은 중간 크기10 % FBS. 콜라겐 I 플러그는 대조군에서 세포 파종 1 시간 후 및 실험 조건에서 세포 파종 3 일 후 세포의 침투 용량을 결정하기 위해 고정시켰다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 콜라겐 I 준비 플러그 <ol><li> 세포 유형에 따라 젤에 침략의 속도론을 결정하는 첫 번째 실험에 대한 4 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간의 시간 과정을 확인하십시오. 각 실험마다 침입이 일어나지 않을 때 기준 시점으로 1 시간 지점을 추가하십시오. </li><li> 멸균 층류 후드 아래 얼음에 콜라겐 I 솔루션을 준비합니다. 3 개의 Boyden 챔버 인서트 용 용액 500 μL를 준비하십시오. </li><li> 상업용 쥐 - 꼬리 콜라겐 1mg을 흡인하여 2mg / ml 콜라겐 I의 최종 농도를 갖는 용액을 제조하십시오. </li><li> 5- 카르복시 x 로다 민 석신 이미 딜 에스테르를콜라겐 I 용액 (이 경우, 500 μL)의 최종 부피에 대해 계산 된 1 μg / mL의 최종 농도. </li><li> 잘 섞어서 빛으로부터 보호되는 멸균 층류 후드 아래 얼음 위에서 5 분 동안 품어 라. </li><li> 얼음처럼 차가운 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)을 얼음 저온의 여과 된 10X PBS와 6.25 μL의 50 μL를 첨가한다. </li><li> 식 443.75 - x μL의 콜라겐 I에 따라 멸균 수를 추가하십시오. </li><li> Boyden chamber insert 당 100 μL의 용액을 첨가하십시오. </li><li> 중합을 허용하기 위해 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 풍부한 세포 배양 배지를 새로운 우물에 첨가한다. 이 우물에 삽입물을 넣으십시오. </li><li> 콜라겐 위에 씨앗 30,000 개의 세포를 넣고 FBS가없는 배지를 연결합니다. </li><li> 37 ° C에서 세포를 배양 후, 1X PBS에 4 % paraformaldehyde에 30 분 동안 콜라겐 제가 플러그 수정. </li><li> 다음 단계를 제외하고 3 단계에서와 같이 완전한 면역 형광법을 사용하십시오 : 투과 액30 분 동안 10 분이 아닌 1 x PBS에서 0.2 % Triton X-100으로 ze 처리; 각각 40 분 및 30 분이 아닌 1.5 시간 동안 1 차 및 2 차 항체 용액과 함께 배양하십시오. 세포를 국한시키기 위해 F- 액틴 또는 핵에 염색합니다. </li><li> immunofluorescence 후, 삽입물의 멤브레인 주위를 잘라하고 유리 바닥 접시에 콜라겐 내가 플러그를 신중하게 메스를 사용합니다. 콜라겐 I 플러그의 꼭대기가 유리와 접촉되어 있는지 확인하십시오. 플러그의 완전성을 유지하기 위해 삽입 막을 콜라겐 바닥에 붙이십시오. 참고 : 콜라겐 I 플러그는 유리 바닥 접시에 그대로 남아 있습니다. 유리 바닥과 유리 바닥을 감싸는 플라스틱 사이의 깊이는 플러그의 두께와 동일합니다. </li><li> 콜라겐 I에 coverslip을 놓고 마개가 막히는 것을 막기 위해 중합 매체를 장착합니다. </li><li> 콜라겐 I 이미지를 이미지화하기 위해 역상 공 촛점 현미경을 사용하십시오. 정상플러그가 접시의 유리 바닥과 접촉합니다. <ol><li> 세포 침입을 시각화하기 위해 연결하는 콜라겐의 상단에서 하단까지 z 스택을 얻습니다. 세포가 이미징 분야에 얼마나 깊이 침투 하는지를 조사하여 z-stack의 두께를 결정하십시오. 0.25x의 z- 스텝 크기를 가진 512x512 포맷의 40X 오일 대물 렌즈로 수집을 수행하십시오. 참고 : 참고로, MDA-MB-231 세포의 평균 z-stack은 seeding 3 일 후에 30 μm입니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

고전적으로, invadosomes는 microenvironment 및 세포가 도금되는 매트릭스에 관계없이 체외에서 공부 하고 있습니다. 젤라틴, fibronectin, vitronectin 또는 고밀도 원 섬유 콜라겐 (HDFC) 7,11을 포함하여 여러 유형의 매트릭스가 현재 사용됩니다. 그러나, 이들은 종종 세포가 존재하고 생리 학적으로 관련이없는 미세 환경을 대표하지 못한다. 여기에는 젤라틴과 섬유소 I 형 콜라겐 사이의 결합으로...

세포 외 기질 (ECM) 재 형성은 혈관 신생 및 종양 세포 침범과 같은 생리적 및 병리학 적 과정 중에 발생한다. 생리 조건에서 대부분 조혈 계통의 많은 세포 유형이 ECM 요소를 분해 할 수 있습니다. 예를 들어, 대 식세포는 조직에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘을 수 있으며 파골 세포는 칼슘 항상성을 보장하기 위해 골질을 분해합니다. 전 세계적으로 신체의 모든 매트릭스가 물리적, 화학적 특성을 유지하기 위해 갱신됩니다. 암 조직에서 종양의 미세 환경 구성이 변경됩니다. 예를 들어, 유방암과 폐암에서 I 형 콜라겐은 과발현되어 종양 주위에 축적됩니다. 더욱이,이 축적은 전이를 일으킬 위험도가 높아진다. 암 전이는 암 세포가 ECM을 저하시키고 인접 조직을 침범하는 능력에 달려 있습니다. 그만큼세포의 침입 성 활동은 침입자 (invadosome)로 알려진 특이한 액틴 풍부 구조에 기인한다. 이 용어는 정상 세포와 암 세포 ( 예 : 대 식세포, 내피 세포, MDA-MB-231 유방암 세포주와 같은 암세포)에 각각 존재하는 포도 솜 (podosomes)과 인다도 포디 아 (invadopodia)를 포함합니다. 시험 관내 에서, invadosome은 점, 집계, 또는 장미와 같은 다양한 형태로 구성 될 수 있습니다 3 . 고전적으로, invadosomes은 integrins과 vinculin 4 와 같은 접착 플라크 분자로 둘러싸인 scaffold protein Tks5와 cortactin과 같은 여러 단백질을 함유 한 F-actin 코어로 구성됩니다. 최근 Tks5와 RhoGTPase Cdc42가 기능성 침입자의 최소 분자 표지로 사용될 수 있음이 밝혀졌습니다 5 . 이러한 구조는 MT1-MMP 및 MMP-2와 같은 특정 메탈로 프로테아제 단백질의 동원 및 활성화를 통해 ECM을 분해 할 수있다. 이전 연구에서 I 형 콜라겐 원 섬유와 I 형 콜라겐 원 섬유의 특이 적 수용체 인 디스코 딘 도메인 수용체 1 (DDR1) 사이의 상호 작용이 선형 침입자라는 새로운 종류의 침입자를 형성한다고보고했습니다. Linear invadosome은 I 형 콜라겐 원 섬유에 따라 형성된다. 이러한 구조는 MT1-MMP / MMP2의 동원 및 활성화를 통해 I 형 콜라겐 섬유질을 분해 할 수 있습니다. 또한, 그들의 형성은 Tks5와 Cdc42 5 에 달려있다. 시험관 내 에서, 우리는 선형 invadosomes의 존재와 DDR1의 형성과 활동 8 의 참여를 보여 주었다 : i) 형광 젤라틴 코팅 coverslips, ii) 형광 타입 I 콜라겐 피 브릴 코팅 된 coverslips, 그리고 iii) 3D 타입 I 콜라겐 플러그. 다른 행렬의 사용으로 인해 우리는 공부할 수 있었고 성격도 좋았습니다.선형 invadosome 형성과 그들의 분해 활성을 감소시킨다. 7 , 8 . 마지막으로 침입 세포의 생물학적 특성을보다 잘 이해하기 위해 종양 미세 환경 조성의 복잡성을 모방 한 2D 및 3D 배양 시스템에서 ECM 구성 요소의 조합을 사용했습니다. 아래는 2D 및 3D 배양 시스템에서 젤라틴 / I 형 콜라겐으로 커버 슬립을 코팅하기위한 프로토콜입니다.

<table><tbody><tr><td>Gelatin solution</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td><td>Molecular probe life technologies</td><td>G13186</td><td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td></tr><tr><td>Microscope cover glasses</td><td>Marlenfeld GmbH &amp;amp; Co</td><td>111520</td><td>&amp;Oslash;12mm No.1</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td><td>Electron microscopy science</td><td>15960</td><td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td></tr><tr><td>1x PBS pH 7.4</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10010-015</td><td>Use this PBS in all steps before fixation</td></tr><tr><td>Collagen I Rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td><td>Life technologies</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x + calcium + magnesium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron microscopy science</td><td>15710</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS buffer pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td></tr><tr><td>Tks5 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td></tr><tr><td>Cortactin 4F11 antibody</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>Invadosome markers Dilution :1/100</td></tr><tr><td>DDR1 antibody</td><td>Cell signaling</td><td>5583</td><td>Linear invadosome receptor</td></tr><tr><td>Dilution :1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>Nucleus marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Secondary antibodies FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Fluoromount G mounting medium</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>Public domain</td><td></td><td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr><tr><td>Cell culture insert</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>8.0&amp;micro;m pore size / 24 wells</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

세포 접착, 이동 및 침입은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에 관여한다. 예를 들어, 전이가 형성되는 동안 종양 세포는 혈액이나 림프관에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘어 침입하고 주변 조직을 통해 이동해야합니다. 이것은 세포와 세포 외 기질 (ECM) 사이의 상호 작용을 필요로합니다. 세포 수준에서, 대부분의 암세포를 포함하여 많은 세포가 ECM을 분해 할 수있는 F- 굴지 기반 구조 인 침입자를 형성 할 수 있습니다. Invadosome은 matrix metalloproteinases (MMPs)를 모집하고 활성화시키는 돌출 액틴 구조입니다. ECM의 분자 구성, 밀도, 조직 및 강성은 침입자 형성 및 활성화를 조절하는 데 중요합니다. 시험 관내 에서, 젤라틴 분석은 침입자 분해 작용을 관찰하고 정량화하는데 사용되는 표준 분석법이다. 그러나, 변성 콜라겐 I 인 젤라틴은 생리적 매트릭스가 아니며준비. I 형 콜라겐 원 섬유를 사용하는 새로운 분석법이 개발되어이 생리 학적 매트릭스가 침입자의 강력한 유도제임을 입증합니다. 콜라겐 원 섬유를 따라 형성되는 침입자는 섬유상에서 선형 구조로 인해 선형 침입자로 알려져 있습니다. 또한, 선형 invadosomes의 분자 분석은 discoidin 도메인 수용체 1 (DDR1)은 그들의 형성에 관여 수용체임을 보여 주었다. 이러한 데이터는 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기 위해 생리 학적으로 관련이있는 매트릭스를 사용하는 것이 중요하다는 것을 분명히 보여줍니다.

젤라틴과 I 형 콜라겐의 두 가지 유형 ( 그림 1 과 4 )의 조합을 사용하여 선형 침입자로 알려진 새로운 유형의 침입자를 강조했습니다. 이러한 매트릭스의 라벨링은 콜라겐 I 섬유 및 그 분해능에 따른 선형인데 돔 형성의 관찰을 허용한다 ( 도 5 ). 침입 구조의 수는 이전에 설명한 매크로 (단계 4.2)에 의해 정량화 될 수 있으며, 분해 활...

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다.

선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K 조회수.  INSERM U1053.  이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다. 

비디오: 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

연구

암 연구학

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

의학

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

암 생물학의 3D 모델: 헤테로스페로이드의 침입 역학

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

저자 스포트라이트: 두경부암 진행 중 암과 면역 세포 사이의 누화 해독

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

생체공학

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스

요약

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모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정