Name: 2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
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JDM wurde von einem Doktorandenstipendium von INSERM / Région Aquitaine unterstützt und wird nun von einem Post-Doktoranden-ARC-Stipendium und dem Tisch-Krebs-Institut am Berg Sinai School of Medicine unterstützt. EH wird von einem Doktorat des Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche unterstützt. ZE wird von einem Postdoc-Stipendium von Agence Nationale de la Recherche (ANR) unterstützt. CM wird vom Tisch-Krebs-Institut am Berg Sinai School of Medicine unterstützt und JJBC wird von der NIH / NCI Grant K22CA196750, dem TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund und dem Tisch Cancer Institute an der Mount Sinai School of Medicine unterstützt. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von ANR-13-JJC-JSV1-0005 unterstützt. FS wird von der &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot; unterstützt. VM und FS werden durch die Finanzierung von &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; und Institut National du Cancer, INCA_8036 und PLBio2012 unterstützt.

HINWEIS: Vor der Fixierung werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömungshaube durchgeführt. 1. 2D Matrix ANMERKUNG: 2D Matrizen werden verwendet, um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die Invadosomen bilden, und der Matrixabbaubereich pro Zelle. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Abbildung 1: Protokoll. Zusammenfassung des Protokolls zur Herstellung von Gelatine- und Kollagen-I-Matrizen. Es ist möglich, die Gelatine-Matrix nur oder eine Gelatine und Kollagen I gemischte Matrix zu machen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Gelatine-Matrix ANMERKUNG: Fluoreszierende Gelatine-Matrizen werden verwendet, um den Matrixabbau zu quantifizieren, und nicht-fluoreszierende Gelatine wird verwendet, um die Adhäsion von Kollagen-I-Fasern zu fördern. Fluoreszierende Gelatine-MatteRizes werden auch für Podosomen- und Invadopodien-Studien verwendet (siehe Abbildung 1 ). <ol><li> Unter einer sterilen laminaren Strömungshaube legen Sie ein Stück Parafilm (20 cm x 15 cm) auf den Arbeitsbereich und desinfizieren es mit 70% Ethanol. </li><li> Aliquotieren von 20 &amp; mgr; l Tröpfchen von 1 mg / ml Gelatine in einer Linie, die etwa 1 cm voneinander entfernt ist; Siehe Abbildung 1 für Tröpfchenorganisation. </li><li> Bedecken Sie jedes 20 μl Gelatine-Tröpfchen mit einem Autoklaven-Glasdeckel (12 mm Durchmesser). </li><li> 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn die Gelatine fluoreszierend ist, schützen sie vor Licht. </li><li> Aliquotieren Sie 40 μl Tröpfchen von 0,5% Glutaraldehyd in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Linie, die jeweils etwa 1 cm unterhalb der Linie der Deckgläser aus Schritt 1.1.3 liegen. ACHTUNG: Glutaraldehyd ist ein toxisches Fixiermittel. Handschuhe benutzen und nicht einatmen. </li><li> Mit der geschmiedeten Pinzette, jedes Gelatine-beschichtete Deckglas auf ein Glutaraldehyd-Tröpfchen übertragen. Notiere esIst normal, dass ein kleines Gelatine-Tröpfchen auf dem Parafilm bleibt. Wiederholen Sie das nicht für ein anderes Experiment. </li><li> 40 min bei Raumtemperatur inkubieren. Für fluoreszierende Deckgläser schützen sie vor Licht. </li><li> Nehmen Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit 500 μl sterilem 1x PBS. Legen Sie die Deckgläser, Gelatine Seite nach oben, in jede Vertiefung. </li><li> Waschen Sie zweimal in 1x PBS für jeweils 5 min. HINWEIS: Bei diesem Schritt können die Deckgläser zum Experimentieren verwendet oder in 1x PBS bei 4 ° C gelagert werden. Nicht fluoreszierende Deckgläser können für eine Woche gelagert werden, und fluoreszierende Deckgläser können für 48 h gelagert werden. </li></ol></li><li> Fibrilläre Kollagen Typ I Matrix HINWEIS: Die Fibrillar-Kollagen-Typ-I-Matrix wird verwendet, um die lineare Invadosomenbildung und den damit verbundenen Matrixabbau zu untersuchen. Eine Kombination von fluoreszierendem Kollagen I und nicht-fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen wird verwendet, um Invadosomenmarker mit Kollagenfasern zu kolokalisieren ( z. B. F-Aktin iN der weit-rote Kanal, Kollagen I im roten Kanal, Tks5 im grünen Kanal und Hoechst Farbstoff für einen Kernfleck). Auf der anderen Seite wird eine Kombination von nicht-fluoreszierendem Kollagen I mit nicht-fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen verwendet, um die Anzahl der gefärbten Invadosomen-Marker zu maximieren ( z. B. F-Aktin im weit-roten Kanal, Cortactin im roten Kanal, Tks5 in Der grüne Kanal und Hoechst Farbstoff für einen Kernfleck). Schließlich wird eine Kombination von nicht-fluoreszierendem Kollagen I mit fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen verwendet, um den Gelatine-assoziierten Abbau zu quantifizieren ( z. B. F-Aktin im weit-roten Kanal, Tks5 im roten Kanal, im grünen Kanal und Hoechst-Farbstoff Für einen Kernfleck) (siehe Abbildung 1). Hoechst-Farbstoff wird verwendet, um den Kern zu färben, und es prüft auch auf Mycoplasma-Kontamination, zusätzlich zu einem PCR-Test, der regelmäßig auf den verwendeten Zelllinien durchgeführt wird. <ol><li> Fluoreszierendes Kollagen I <ol><li> Verwenden Sie kommerzielles Kollagen, das ich aus Rattenschwanzsehne in 0,02 N Essigsäure extrahiert habeD. Ziehen Sie die Menge an Kollagen, die notwendig ist, um 500 μl Lösung pro Deckglas bei einer Endkonzentration von 0,4 mg / ml Kollagen I herzustellen. </li><li> Füge 5-Carboxy-x-Rhodamin-succinimidylester in einer Endkonzentration von 10 μg / ml hinzu, berechnet für das Endvolumen der Kollagen-I-Lösung (nx 500 μL). </li><li> Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren auf und ab und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. </li><li> Verdünnen Sie das endgültige Volumen mit 1X Dulbecco&#39;s Phosphat-gepufferter Salzlösung (DPBS), die Calcium und Magnesium enthält, und verwenden Sie direkt. </li></ol></li><li> Fibrillar Kollagen I Deckglas <ol><li> Verwenden Sie die zuvor in Schritt 1.1 hergestellten nicht-fluoreszierenden oder fluoreszierenden Gelatine-Deckgläser. </li><li> Vorbereitung einer Lösung von fluoreszierendem oder nicht-fluoreszierendem Kollagen I bei einer Endkonzentration von 0,4 mg / ml in 1X DPBS, enthaltend Calcium und Magnesium. </li><li> Füge 500 μl fluoreszierende oder nicht-fluoreszierende Kollagen-I-Lösung hinzuDeckglas in einer 24-Well-Zellkulturplatte. </li><li> Inkubieren für 4 h bei 37 ° C für die Kollagen-I-Polymerisation. </li><li> Nach der Inkubation das überschüssige Kollagen I durch Kippen der Platte und Pipettieren auf der Seite des Brunnens (nicht direkt auf dem Deckglas) entfernen, um eine Beschädigung der Matrix zu vermeiden. HINWEIS: Diese Matrix kann nicht gespeichert werden. Die Zellen sofort nach dem Entfernen von überschüssigem Kollagen I. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Zellseeding, Zeit der Kultur und Fixierung <ol><li> Je nach Zelltyp werden die Zellen in das entsprechende Kulturmedium vorbereitet und Zellen für ein Endvolumen von 500 μl pro Vertiefung zugegeben. </li><li> Um die Fähigkeit einer Zelllinie zu charakterisieren, lineare Invadosomen zu bilden und die Matrix abzubauen, die Zellen für 4 h, 12 h und 24 h auf der Kollagen-I-Matrix zu trennen, um die Kinetik der linearen Invadosomenbildung und der damit verbundenen Abbauaktivität zu bestimmen. ANMERKUNG: Tabelle 1 enthält Beispiele für ZelllinienGetestet im Labor. <table border="1"><tbody><tr><td> Zelllinie </td><td> Anzahl der Zellen pro Deckglas </td><td> Zeit der Kontakt mit Matrix für lineare Invadosom-Quantifizierung </td><td> Zeit der Berührung mit Matrix zur Quantifizierung der linearen Invadosomenabbauaktivität </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> HUH7 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> NIH 3T3 src </td><td> 30.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50.000 </td><td> 6 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h &amp;# 160; </td></tr><tr><td> ROH </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zellseeding und Inkubationszeitreferenz. Diese Tabelle stellt eine nicht erschöpfende Liste von Zelllinien dar, die verwendet werden, um lineare Invadosomen zu studieren. Es gibt die Anzahl der Zellen an, die auf der Matrix säen, die Zeit, die notwendig ist, um lineare Invadosomen zu beobachten, und die Zeit, die notwendig ist, um den assoziierten Matrixabbau zu beobachten. Lineare Invadosomen haben eine kurze Lebensdauer. Um lineare Invadosomen in der maximalen Anzahl von Zellen beobachten zu können, müssen die Zellen für eine kurze Zeitspanne mit der Kollagen-I-Matrix in Kontakt kommen. Um andererseits den gemeldeten Gelatineabbau zu visualisieren, müssen die Zellen über einen längeren Zeitraum mit der Kollagen-I-Matrix in Kontakt kommen als die oben aufgeführten. </li><li> Nach der Entfernung des Zellkulturmediums,Die Deckgläser für 10 min in 500 μl 4% Paraformaldehyd in 1X PBS fixieren. </li><li> Waschen Sie zweimal mit 1x PBS. </li><li> Bei 4 ° C aufbewahren, vor Licht geschützt. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz <ol><li> Permeabilisieren Sie die Zellen für 10 min mit einer frisch zubereiteten Lösung Von 0,2% Triton X-100 in 1x PBS. Diese Lösung nicht wiederverwenden. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen zweimal mit 1x PBS. </li><li> Lege ein Stück Parafilm (20 cm x 15 cm) auf die Bank. </li><li> Verdünnen Sie den primären Antikörper in 4% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS, wie in der Materialtabelle beschrieben . </li><li> Aliquotieren Sie 50 &amp; mgr; l Tröpfchen der primären Antikörperlösung in einer Linie, die jeweils etwa 1 cm voneinander entfernt sind. </li><li> Lege jedes Deckglas auf ein Tröpfchen. </li><li> 40 min bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt. </li><li> Nach der Inkubationszeit zweimal mit 1x PBS waschen. </li><li> Verdünnen Sie den sekundären Antikörper, Phalloidin und Hoechst Farbstoff in 4% BSA in 1xPBS </li><li> Aliquotieren Sie 50 μl Tröpfchen der Mischung, die jeweils etwa 1 cm unterhalb der ersten Linie der Deckgläser liegen, wie zuvor getan. </li><li> Lege jedes Deckglas auf ein Tröpfchen. </li><li> 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt. </li><li> Nach der Inkubation zweimal mit 1x PBS waschen. </li><li> Waschen Sie einmal mit destilliertem Wasser, um die Salze zu entfernen. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser auf einer Glasrutsche mit polymerisierendem Montagemedium. </li><li> Lassen Sie die Deckgläser über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, vor Licht geschützt vor der Mikroskopie. </li></ol> 4. Quantifizierungen <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> Abbildung 2: Lineare Invadosom-Quantifizierung. Das Makro erfordert konfokale Bilder von F-Aktin und Tks5-Färbung (Format: 1.024 x 1.024). ( A ) Zuerst das F-Aktin-Bild öffnen und eine Maske machen. ( B ) Dann öffne dichDas Tks5 Bild und Schwelle es. Tragen Sie das Makro auf. ( C ) Die analysierten Ergebnisse werden in zwei Tabellen angezeigt. Die Anzahl der linearen Invadosomen pro Zelle und andere Informationen, wie der prozentuale Bereich, der von linearen Invadosomen in der Zelle verwendet wird, befindet sich in der Übersichtstabelle. Die Größe jedes linearen Invadosoms wird in der Ergebnistabelle liegen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Prozentsatz der Zellen, die lineare Invadosomen bilden <ol><li> Zählen Sie die Zellen, die lineare Invadosomen bilden, ungefähr 100 Zellen pro Deckglas (verwenden Sie technische Triplikate). Quantifizieren Sie mindestens 300 Zellen pro n mit n = 3. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die lineare Invadosomen bilden, indem Sie den Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten, was zu 900 quantifizierten Zellen führt. </li></ol></li><li> Lineare Invadosomgröße und Anzahl pro Zelle <li> Verwenden Sie ImageJ mit dem zusätzlichen Makro. </li></ol></li><li> Abbau pro Zelle <ol><li> Verwenden Sie drei Deckgläser pro Zustand. </li><li> Nehmen Sie 30 Bilder pro Deckglas von fluoreszierenden Gelatine und Hoechst-gefärbten Kernen. </li><li> Verwenden Sie die ImageJ-Software, wie in Martin KH et al. 9 </li></ol></li></ol> 5. 3D-Kollagen-Invasionstest <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> Abbildung 3: Invasionstestschema. Zusammenfassung des Invasionstestprotokolls Kollagen I wird mit Succinimidylester-Farbstoff vernetzt und für 1 h bei 37 ° C polymerisiert. Die Zellen werden in serumfreiem Medium auf den Kollagen-I-Stopfen gegeben. Der Einsatz ist mittig wiTen 10% FBS. Kollagen I-Stöpsel sind 1 h nach Zellsäen in der Kontrolle fixiert und 3 Tage nach Zellsäen im experimentellen Zustand, um die Invasionskapazität der Zellen zu bestimmen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Kollagen I Stecker Vorbereitung <ol><li> Machen Sie einen Zeitverlauf von 4 h, 12 h, 24 h, 48 h und 72 h für das erste Experiment, um die Kinetik der Invasion in das Gel nach dem Zelltyp zu bestimmen. Für jedes Experiment fügen Sie einen 1-Stunden-Zeitpunkt als Referenzzeitpunkt hinzu, wenn keine Invasion auftritt. </li><li> Bereiten Sie die Kollagen-I-Lösung auf Eis unter einer sterilen laminaren Strömungshaube vor. 500 μl Lösung für 3 Boyden Kammereinsätze vorbereiten. </li><li> 1 mg handelsübliches Ratten-Schwanz-Kollagen I einspülen, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 2 mg / ml Kollagen I herzustellen. </li><li> Füge 5-carboxy x Rhodamin-succinimidylester bei einEine Endkonzentration von 1 &amp; mgr; g / ml, berechnet für das Endvolumen der Kollagen-I-Lösung (in diesem Fall 500 &amp; mgr; l). </li><li> Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 5 min auf Eis unter der sterilen laminaren Strömungshaube, geschützt vor Licht. </li><li> 50 μl eiskaltes, filtriertes 10X PBS und 6,25 μl eiskaltes 1 M Natriumhydroxid (NaOH) zugeben. </li><li> Addieren Sie steriles Wasser gemäß der Formel 443,75 - x μl Kollagen I. </li><li> 100 μl Lösung pro Boyden-Kammereinsatz zugeben. </li><li> 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren, um die Polymerisation zu ermöglichen. </li><li> Addieren Sie Zellkulturmedium, angereichert mit fötalem Rinderserum (FBS) in neue Brunnen; Platzieren Sie Einsätze in diese Brunnen. </li><li> Seed 30.000 Zellen auf dem Kollagen Ich stecke FBS-freies Medium ein. </li><li> Nach dem Kultivieren der Zellen bei 37 ° C fixieren Sie den Kollagen-I-Stopfen für 30 min in 4% Paraformaldehyd in 1x PBS. </li><li> Komplette Immunfluoreszenz wie in Schritt 3, mit Ausnahme der folgenden Schritte: permeabiliZe mit 0,2% Triton X-100 in 1x PBS für 30 min, nicht 10 min; Inkubieren mit primären und sekundären Antikörperlösungen für jeweils 1,5 h, anstatt 40 min bzw. 30 min. Fleck für F-Aktin oder Kerne, um die Zellen zu lokalisieren. </li><li> Nach der Immunfluoreszenz ein Skalpell verwenden, um die Membran des Einsatzes zu schneiden und den Kollagen-I-Stecker vorsichtig auf eine Glasbodenschale zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Kollagen-I-Steckers mit dem Glas in Berührung kommt. Halten Sie die Einsatzmembran an der Unterseite des Kollagen-I-Steckers befestigt, um die Integrität des Steckers beizubehalten. HINWEIS: Der Collagen-I-Stecker bleibt in der Glasbodenschale intakt. Die Tiefe zwischen dem Glasboden und dem Kunststoff, der den Glasboden umgibt, entspricht der Dicke des Stopfens. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf das Kollagen I-Stecker und montieren mit polymerisierenden Montagemedium, um zu verhindern, dass der Stecker austrocknet. </li><li> Verwenden Sie ein umgekehrtes konfokales Mikroskop, um den Kollagen-I-Stecker abzubilden. die Spitze vonDer Stecker steht mit dem Glasboden der Schale in Kontakt. <ol><li> Erwerben Sie einen Z-Stapel von der Oberseite bis zum Ende des Kollagen-I-Steckers, um die Zellinvasion zu visualisieren. Bestimmen Sie die Dicke des Z-Stapels, indem Sie untersuchen, wie tief die Zellen in das Bildgebungsfeld eindringen. Führen Sie Akquisitionen mit einem 40X Ölobjektiv in einem 512 x 512 Format mit einer z-Schrittgröße von 0,25 μm durch. HINWEIS: Als Referenz ist der durchschnittliche Z-Stack für MDA-MB-231 Zellen 3 Tage nach dem Seeding 30 μm. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Klassisch werden Invadosomen in vitro ohne Rücksicht auf die Mikroumgebung und die Matrix untersucht, auf der die Zellen plattiert werden. Mehrere Matrixarten werden derzeit verwendet, einschließlich Gelatine, Fibronectin, Vitronectin oder hochdichtes fibrilläres Kollagen (HDFC) 7 , 11 ; Diese sind jedoch oft nicht repräsentativ für die Mikroumgebung, in der sich Zellen befinden und nicht physiologisch relevant sind. Hier wurde ein neuartiger Matri...

Extrazelluläre Matrix (ECM) Remodeling erfolgt während physiologischer und pathologischer Prozesse wie Angiogenese und Tumorzellinvasion. In physiologischen Bedingungen können viele Zelltypen, meist aus der hämatopoetischen Abstammung, ECM-Elemente abbauen. Zum Beispiel können Makrophagen anatomische Barrieren kreuzen, um Gewebe zu erreichen, und Osteoklasten verschlechtern die Knochenmatrix, um die Calciumhomöostase zu gewährleisten. Weltweit erneuern sich alle Matrizen im Körper, um ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften zu erhalten. In Krebsgeweben wird die Tumor-Mikroumgebungszusammensetzung verändert. Zum Beispiel bei Brust-und Lungenkrebs, Typ I Kollagen ist überexprimiert und sammelt sich um den Tumor. Darüber hinaus ist diese Akkumulation mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung von Metastasen 1 , 2 verbunden. Die Krebsmetastase hängt von der Fähigkeit von Krebszellen ab, das ECM abzubauen und in benachbarte Gewebe einzudringen. DasInvasive Aktivität von Zellen wird auf spezialisierte aktinreiche Strukturen, die als Invadosomen bekannt sind, zugeschrieben. Dieser Begriff schließt Podosomen und Invadopodien ein, die jeweils in normalen und Krebszellen vorhanden sind ( z. B. Makrophagen, Endothelzellen und Krebszellen wie die MDA-MB-231-Brustkrebszelllinie). In vitro können Invadosomen in verschiedene Formen organisieren: Punkte, Aggregate oder Rosetten 3 . Klassisch bestehen Invadosomen aus einem F-Aktin-Kern, der mehrere Proteine ​​enthält, wie das Gerüstprotein Tks5 und Cortactin, umgeben von Adhäsions-Plaque-Molekülen wie Integrinen und Vinculin 4 . Vor kurzem wurde gezeigt, dass Tks5 und die RhoGTPase Cdc42 als minimale molekulare Signatur für funktionelle Invadosomen verwendet werden können 5 . Diese Strukturen sind in der Lage, das ECM durch die Rekrutierung und Aktivierung von spezifischen Metalloprotease-Proteinen wie MT1-MMP und MMP-2 zu verschlechtern. In einer früheren Studie berichteten wir, dass die Wechselwirkung zwischen Kollagenfibrillen des Typs I und dem Diskoidin-Domänenrezeptor 1 (DDR1), einem spezifischen Rezeptor von Kollagenfibrillen vom Typ I, zur Bildung einer neuen Klasse von Invadosomen mit dem Namen lineare Invadosomen führt. Lineare Invadosomen werden entlang Kollagenfibrillen des Typs I gebildet 7 . Diese Strukturen sind in der Lage, Typ-I-Kollagenfibrillen durch die Rekrutierung und Aktivierung von MT1-MMP / MMP2 abzubauen. Darüber hinaus ist ihre Bildung abhängig von Tks5 und Cdc42 5 . In vitro zeigten wir die Existenz von linearen Invadosomen und die Beteiligung von DDR1 an ihrer Bildung und Aktivität 8 unter Verwendung verschiedener Strategien, die aus einer Kombination verschiedener Matrixelemente bestehen, einschließlich: i) fluoreszierende Gelatine-beschichtete Deckgläser, ii) fluoreszierende Kollagenfibrillen vom Typ I -beschichtete Deckgläser und iii) 3D-Typ-I-Kollagen-Stopfen. Durch den Einsatz unterschiedlicher Matrizen konnten wir studieren und charakterisierenIve lineare Invadosomenbildung und deren Abbauaktivität 7 , 8 . Um die Biologie von invasiven Zellen besser zu verstehen, wurde eine Kombination von ECM-Komponenten sowohl in 2D- als auch in 3D-Kultursystemen verwendet, wobei die Komplexität der Tumor-Mikroumgebungszusammensetzung nachgeahmt wurde. Im Folgenden sind Protokolle für die Beschichtung von Deckgläschen mit Gelatine / Typ I Kollagen in 2D- und 3D-Kultursystemen.

<table><tbody><tr><td>Gelatin solution</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td><td>Molecular probe life technologies</td><td>G13186</td><td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td></tr><tr><td>Microscope cover glasses</td><td>Marlenfeld GmbH &amp;amp; Co</td><td>111520</td><td>&amp;Oslash;12mm No.1</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td><td>Electron microscopy science</td><td>15960</td><td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td></tr><tr><td>1x PBS pH 7.4</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10010-015</td><td>Use this PBS in all steps before fixation</td></tr><tr><td>Collagen I Rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td><td>Life technologies</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x + calcium + magnesium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron microscopy science</td><td>15710</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS buffer pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td></tr><tr><td>Tks5 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td></tr><tr><td>Cortactin 4F11 antibody</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>Invadosome markers Dilution :1/100</td></tr><tr><td>DDR1 antibody</td><td>Cell signaling</td><td>5583</td><td>Linear invadosome receptor</td></tr><tr><td>Dilution :1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>Nucleus marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Secondary antibodies FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Fluoromount G mounting medium</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>Public domain</td><td></td><td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr><tr><td>Cell culture insert</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>8.0&amp;micro;m pore size / 24 wells</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

Zelladhäsion, Migration und Invasion sind in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert. Zum Beispiel müssen die Tumorzellen während der Metastasenbildung anatomische Barrieren überqueren, um durch das umgebende Gewebe einzudringen und zu wandern, um Blut oder Lymphgefäße zu erreichen. Dies erfordert die Wechselwirkung zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM). Auf zellulärer Ebene sind viele Zellen, einschließlich der Mehrheit der Krebszellen, in der Lage, Invadosomen zu bilden, die F-Aktin-basierte Strukturen sind, die in der Lage sind, ECM abzubauen. Invadosomen sind protrusive Aktinstrukturen, die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) rekrutieren und aktivieren. Die molekulare Zusammensetzung, die Dichte, die Organisation und die Steifigkeit des ECM sind entscheidend für die Regulierung der Invadosomenbildung und -aktivierung. In vitro ist ein Gelatine-Assay der Standard-Assay, der verwendet wird, um Invadosomen-Abbauaktivität zu beobachten und zu quantifizieren. Allerdings ist Gelatine, die denaturiertes Kollagen I ist, keine physiologische Matrix eLeasing Ein neuartiger Test unter Verwendung von Kollagenfibrillen vom Typ I wurde entwickelt und verwendet, um zu zeigen, dass diese physiologische Matrix ein potenter Induktor von Invadosomen ist. Invadosomen, die sich entlang der Kollagenfibrillen bilden, werden als lineare Invadosomen aufgrund ihrer linearen Organisation auf den Fasern bezeichnet. Darüber hinaus zeigte die molekulare Analyse von linearen Invadosomen, dass der Diskoidin-Domänen-Rezeptor 1 (DDR1) der Rezeptor ist, der an deren Bildung beteiligt ist. Diese Daten zeigen deutlich, wie wichtig es ist, eine physiologisch relevante Matrix zu verwenden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ECM zu verstehen.

Unter Verwendung einer Kombination von zwei Arten von Matrizen, Gelatine und Typ I Kollagen ( Fig. 1 und 4 ) haben wir eine neue Art von Invadosom, bekannt als lineare Invadosomen, hervorgehoben. Die Markierung dieser Matrizen ermöglicht die Beobachtung der linearen Invadosomenbildung entlang der Kollagen-I-Fasern und ihrer Abbaubarkeit (Abbildung 5 ). Die Anzahl der invasiven Strukturen kann dann durch das zuvor beschriebene Makro quan...

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine 2D-Mischmatrix, bestehend aus Gelatine und Kollagen I, und einem 3D-Kollagen-I-Plug, um lineare Invadosomen zu studieren, vorzubereiten. Diese Protokolle erlauben die Untersuchung der linearen Invadosomenbildung, der Matrixabbauaktivität und der Invasionsfähigkeit von Primärzellen und Krebszelllinien.

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Aufrufe.  INSERM U1053.  Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine 2D-Mischmatrix, bestehend aus Gelatine und Kollagen I, und einem 3D-Kollagen-I-Plug, um lineare Invadosomen zu studieren, vorzubereiten. Diese Protokolle erlauben die Untersuchung der linearen Invadosomenbildung, der Matrixabbauaktivität und der Invasionsfähigkeit von Primärzellen und Krebszelllinien. 

Serie: 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Forschung

Krebsforschung

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Medizin

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

3D-Modelle in der Krebsbiologie: Invasionsdynamik in Heterospheroiden

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Wechselwirkung zwischen Krebs und Immunzellen während des Fortschreitens von Kopf- und Halskrebs

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Biotechnik

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Zusammenfassung

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Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts