JDM wurde von einem Doktorandenstipendium von INSERM / Région Aquitaine unterstützt und wird nun von einem Post-Doktoranden-ARC-Stipendium und dem Tisch-Krebs-Institut am Berg Sinai School of Medicine unterstützt. EH wird von einem Doktorat des Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche unterstützt. ZE wird von einem Postdoc-Stipendium von Agence Nationale de la Recherche (ANR) unterstützt. CM wird vom Tisch-Krebs-Institut am Berg Sinai School of Medicine unterstützt und JJBC wird von der NIH / NCI Grant K22CA196750, dem TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund und dem Tisch Cancer Institute an der Mount Sinai School of Medicine unterstützt. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von ANR-13-JJC-JSV1-0005 unterstützt. FS wird von der &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot; unterstützt. VM und FS werden durch die Finanzierung von &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; und Institut National du Cancer, INCA_8036 und PLBio2012 unterstützt.

HINWEIS: Vor der Fixierung werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömungshaube durchgeführt. 1. 2D Matrix ANMERKUNG: 2D Matrizen werden verwendet, um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die Invadosomen bilden, und der Matrixabbaubereich pro Zelle. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Abbildung 1: Protokoll. Zusammenfassung des Protokolls zur Herstellung von Gelatine- und Kollagen-I-Matrizen. Es ist möglich, die Gelatine-Matrix nur oder eine Gelatine und Kollagen I gemischte Matrix zu machen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Gelatine-Matrix ANMERKUNG: Fluoreszierende Gelatine-Matrizen werden verwendet, um den Matrixabbau zu quantifizieren, und nicht-fluoreszierende Gelatine wird verwendet, um die Adhäsion von Kollagen-I-Fasern zu fördern. Fluoreszierende Gelatine-MatteRizes werden auch für Podosomen- und Invadopodien-Studien verwendet (siehe Abbildung 1 ). <ol><li> Unter einer sterilen laminaren Strömungshaube legen Sie ein Stück Parafilm (20 cm x 15 cm) auf den Arbeitsbereich und desinfizieren es mit 70% Ethanol. </li><li> Aliquotieren von 20 &amp; mgr; l Tröpfchen von 1 mg / ml Gelatine in einer Linie, die etwa 1 cm voneinander entfernt ist; Siehe Abbildung 1 für Tröpfchenorganisation. </li><li> Bedecken Sie jedes 20 μl Gelatine-Tröpfchen mit einem Autoklaven-Glasdeckel (12 mm Durchmesser). </li><li> 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn die Gelatine fluoreszierend ist, schützen sie vor Licht. </li><li> Aliquotieren Sie 40 μl Tröpfchen von 0,5% Glutaraldehyd in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Linie, die jeweils etwa 1 cm unterhalb der Linie der Deckgläser aus Schritt 1.1.3 liegen. ACHTUNG: Glutaraldehyd ist ein toxisches Fixiermittel. Handschuhe benutzen und nicht einatmen. </li><li> Mit der geschmiedeten Pinzette, jedes Gelatine-beschichtete Deckglas auf ein Glutaraldehyd-Tröpfchen übertragen. Notiere esIst normal, dass ein kleines Gelatine-Tröpfchen auf dem Parafilm bleibt. Wiederholen Sie das nicht für ein anderes Experiment. </li><li> 40 min bei Raumtemperatur inkubieren. Für fluoreszierende Deckgläser schützen sie vor Licht. </li><li> Nehmen Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit 500 μl sterilem 1x PBS. Legen Sie die Deckgläser, Gelatine Seite nach oben, in jede Vertiefung. </li><li> Waschen Sie zweimal in 1x PBS für jeweils 5 min. HINWEIS: Bei diesem Schritt können die Deckgläser zum Experimentieren verwendet oder in 1x PBS bei 4 ° C gelagert werden. Nicht fluoreszierende Deckgläser können für eine Woche gelagert werden, und fluoreszierende Deckgläser können für 48 h gelagert werden. </li></ol></li><li> Fibrilläre Kollagen Typ I Matrix HINWEIS: Die Fibrillar-Kollagen-Typ-I-Matrix wird verwendet, um die lineare Invadosomenbildung und den damit verbundenen Matrixabbau zu untersuchen. Eine Kombination von fluoreszierendem Kollagen I und nicht-fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen wird verwendet, um Invadosomenmarker mit Kollagenfasern zu kolokalisieren ( z. B. F-Aktin iN der weit-rote Kanal, Kollagen I im roten Kanal, Tks5 im grünen Kanal und Hoechst Farbstoff für einen Kernfleck). Auf der anderen Seite wird eine Kombination von nicht-fluoreszierendem Kollagen I mit nicht-fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen verwendet, um die Anzahl der gefärbten Invadosomen-Marker zu maximieren ( z. B. F-Aktin im weit-roten Kanal, Cortactin im roten Kanal, Tks5 in Der grüne Kanal und Hoechst Farbstoff für einen Kernfleck). Schließlich wird eine Kombination von nicht-fluoreszierendem Kollagen I mit fluoreszierenden Gelatine-Deckgläschen verwendet, um den Gelatine-assoziierten Abbau zu quantifizieren ( z. B. F-Aktin im weit-roten Kanal, Tks5 im roten Kanal, im grünen Kanal und Hoechst-Farbstoff Für einen Kernfleck) (siehe Abbildung 1). Hoechst-Farbstoff wird verwendet, um den Kern zu färben, und es prüft auch auf Mycoplasma-Kontamination, zusätzlich zu einem PCR-Test, der regelmäßig auf den verwendeten Zelllinien durchgeführt wird. <ol><li> Fluoreszierendes Kollagen I <ol><li> Verwenden Sie kommerzielles Kollagen, das ich aus Rattenschwanzsehne in 0,02 N Essigsäure extrahiert habeD. Ziehen Sie die Menge an Kollagen, die notwendig ist, um 500 μl Lösung pro Deckglas bei einer Endkonzentration von 0,4 mg / ml Kollagen I herzustellen. </li><li> Füge 5-Carboxy-x-Rhodamin-succinimidylester in einer Endkonzentration von 10 μg / ml hinzu, berechnet für das Endvolumen der Kollagen-I-Lösung (nx 500 μL). </li><li> Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren auf und ab und inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. </li><li> Verdünnen Sie das endgültige Volumen mit 1X Dulbecco&#39;s Phosphat-gepufferter Salzlösung (DPBS), die Calcium und Magnesium enthält, und verwenden Sie direkt. </li></ol></li><li> Fibrillar Kollagen I Deckglas <ol><li> Verwenden Sie die zuvor in Schritt 1.1 hergestellten nicht-fluoreszierenden oder fluoreszierenden Gelatine-Deckgläser. </li><li> Vorbereitung einer Lösung von fluoreszierendem oder nicht-fluoreszierendem Kollagen I bei einer Endkonzentration von 0,4 mg / ml in 1X DPBS, enthaltend Calcium und Magnesium. </li><li> Füge 500 μl fluoreszierende oder nicht-fluoreszierende Kollagen-I-Lösung hinzuDeckglas in einer 24-Well-Zellkulturplatte. </li><li> Inkubieren für 4 h bei 37 ° C für die Kollagen-I-Polymerisation. </li><li> Nach der Inkubation das überschüssige Kollagen I durch Kippen der Platte und Pipettieren auf der Seite des Brunnens (nicht direkt auf dem Deckglas) entfernen, um eine Beschädigung der Matrix zu vermeiden. HINWEIS: Diese Matrix kann nicht gespeichert werden. Die Zellen sofort nach dem Entfernen von überschüssigem Kollagen I. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Zellseeding, Zeit der Kultur und Fixierung <ol><li> Je nach Zelltyp werden die Zellen in das entsprechende Kulturmedium vorbereitet und Zellen für ein Endvolumen von 500 μl pro Vertiefung zugegeben. </li><li> Um die Fähigkeit einer Zelllinie zu charakterisieren, lineare Invadosomen zu bilden und die Matrix abzubauen, die Zellen für 4 h, 12 h und 24 h auf der Kollagen-I-Matrix zu trennen, um die Kinetik der linearen Invadosomenbildung und der damit verbundenen Abbauaktivität zu bestimmen. ANMERKUNG: Tabelle 1 enthält Beispiele für ZelllinienGetestet im Labor. <table border="1"><tbody><tr><td> Zelllinie </td><td> Anzahl der Zellen pro Deckglas </td><td> Zeit der Kontakt mit Matrix für lineare Invadosom-Quantifizierung </td><td> Zeit der Berührung mit Matrix zur Quantifizierung der linearen Invadosomenabbauaktivität </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> HUH7 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> NIH 3T3 src </td><td> 30.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50.000 </td><td> 6 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h &amp;# 160; </td></tr><tr><td> ROH </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zellseeding und Inkubationszeitreferenz. Diese Tabelle stellt eine nicht erschöpfende Liste von Zelllinien dar, die verwendet werden, um lineare Invadosomen zu studieren. Es gibt die Anzahl der Zellen an, die auf der Matrix säen, die Zeit, die notwendig ist, um lineare Invadosomen zu beobachten, und die Zeit, die notwendig ist, um den assoziierten Matrixabbau zu beobachten. Lineare Invadosomen haben eine kurze Lebensdauer. Um lineare Invadosomen in der maximalen Anzahl von Zellen beobachten zu können, müssen die Zellen für eine kurze Zeitspanne mit der Kollagen-I-Matrix in Kontakt kommen. Um andererseits den gemeldeten Gelatineabbau zu visualisieren, müssen die Zellen über einen längeren Zeitraum mit der Kollagen-I-Matrix in Kontakt kommen als die oben aufgeführten. </li><li> Nach der Entfernung des Zellkulturmediums,Die Deckgläser für 10 min in 500 μl 4% Paraformaldehyd in 1X PBS fixieren. </li><li> Waschen Sie zweimal mit 1x PBS. </li><li> Bei 4 ° C aufbewahren, vor Licht geschützt. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz <ol><li> Permeabilisieren Sie die Zellen für 10 min mit einer frisch zubereiteten Lösung Von 0,2% Triton X-100 in 1x PBS. Diese Lösung nicht wiederverwenden. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen zweimal mit 1x PBS. </li><li> Lege ein Stück Parafilm (20 cm x 15 cm) auf die Bank. </li><li> Verdünnen Sie den primären Antikörper in 4% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS, wie in der Materialtabelle beschrieben . </li><li> Aliquotieren Sie 50 &amp; mgr; l Tröpfchen der primären Antikörperlösung in einer Linie, die jeweils etwa 1 cm voneinander entfernt sind. </li><li> Lege jedes Deckglas auf ein Tröpfchen. </li><li> 40 min bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt. </li><li> Nach der Inkubationszeit zweimal mit 1x PBS waschen. </li><li> Verdünnen Sie den sekundären Antikörper, Phalloidin und Hoechst Farbstoff in 4% BSA in 1xPBS </li><li> Aliquotieren Sie 50 μl Tröpfchen der Mischung, die jeweils etwa 1 cm unterhalb der ersten Linie der Deckgläser liegen, wie zuvor getan. </li><li> Lege jedes Deckglas auf ein Tröpfchen. </li><li> 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt. </li><li> Nach der Inkubation zweimal mit 1x PBS waschen. </li><li> Waschen Sie einmal mit destilliertem Wasser, um die Salze zu entfernen. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser auf einer Glasrutsche mit polymerisierendem Montagemedium. </li><li> Lassen Sie die Deckgläser über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, vor Licht geschützt vor der Mikroskopie. </li></ol> 4. Quantifizierungen <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> Abbildung 2: Lineare Invadosom-Quantifizierung. Das Makro erfordert konfokale Bilder von F-Aktin und Tks5-Färbung (Format: 1.024 x 1.024). ( A ) Zuerst das F-Aktin-Bild öffnen und eine Maske machen. ( B ) Dann öffne dichDas Tks5 Bild und Schwelle es. Tragen Sie das Makro auf. ( C ) Die analysierten Ergebnisse werden in zwei Tabellen angezeigt. Die Anzahl der linearen Invadosomen pro Zelle und andere Informationen, wie der prozentuale Bereich, der von linearen Invadosomen in der Zelle verwendet wird, befindet sich in der Übersichtstabelle. Die Größe jedes linearen Invadosoms wird in der Ergebnistabelle liegen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Prozentsatz der Zellen, die lineare Invadosomen bilden <ol><li> Zählen Sie die Zellen, die lineare Invadosomen bilden, ungefähr 100 Zellen pro Deckglas (verwenden Sie technische Triplikate). Quantifizieren Sie mindestens 300 Zellen pro n mit n = 3. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die lineare Invadosomen bilden, indem Sie den Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten, was zu 900 quantifizierten Zellen führt. </li></ol></li><li> Lineare Invadosomgröße und Anzahl pro Zelle <li> Verwenden Sie ImageJ mit dem zusätzlichen Makro. </li></ol></li><li> Abbau pro Zelle <ol><li> Verwenden Sie drei Deckgläser pro Zustand. </li><li> Nehmen Sie 30 Bilder pro Deckglas von fluoreszierenden Gelatine und Hoechst-gefärbten Kernen. </li><li> Verwenden Sie die ImageJ-Software, wie in Martin KH et al. 9 </li></ol></li></ol> 5. 3D-Kollagen-Invasionstest <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> Abbildung 3: Invasionstestschema. Zusammenfassung des Invasionstestprotokolls Kollagen I wird mit Succinimidylester-Farbstoff vernetzt und für 1 h bei 37 ° C polymerisiert. Die Zellen werden in serumfreiem Medium auf den Kollagen-I-Stopfen gegeben. Der Einsatz ist mittig wiTen 10% FBS. Kollagen I-Stöpsel sind 1 h nach Zellsäen in der Kontrolle fixiert und 3 Tage nach Zellsäen im experimentellen Zustand, um die Invasionskapazität der Zellen zu bestimmen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Kollagen I Stecker Vorbereitung <ol><li> Machen Sie einen Zeitverlauf von 4 h, 12 h, 24 h, 48 h und 72 h für das erste Experiment, um die Kinetik der Invasion in das Gel nach dem Zelltyp zu bestimmen. Für jedes Experiment fügen Sie einen 1-Stunden-Zeitpunkt als Referenzzeitpunkt hinzu, wenn keine Invasion auftritt. </li><li> Bereiten Sie die Kollagen-I-Lösung auf Eis unter einer sterilen laminaren Strömungshaube vor. 500 μl Lösung für 3 Boyden Kammereinsätze vorbereiten. </li><li> 1 mg handelsübliches Ratten-Schwanz-Kollagen I einspülen, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 2 mg / ml Kollagen I herzustellen. </li><li> Füge 5-carboxy x Rhodamin-succinimidylester bei einEine Endkonzentration von 1 &amp; mgr; g / ml, berechnet für das Endvolumen der Kollagen-I-Lösung (in diesem Fall 500 &amp; mgr; l). </li><li> Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 5 min auf Eis unter der sterilen laminaren Strömungshaube, geschützt vor Licht. </li><li> 50 μl eiskaltes, filtriertes 10X PBS und 6,25 μl eiskaltes 1 M Natriumhydroxid (NaOH) zugeben. </li><li> Addieren Sie steriles Wasser gemäß der Formel 443,75 - x μl Kollagen I. </li><li> 100 μl Lösung pro Boyden-Kammereinsatz zugeben. </li><li> 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren, um die Polymerisation zu ermöglichen. </li><li> Addieren Sie Zellkulturmedium, angereichert mit fötalem Rinderserum (FBS) in neue Brunnen; Platzieren Sie Einsätze in diese Brunnen. </li><li> Seed 30.000 Zellen auf dem Kollagen Ich stecke FBS-freies Medium ein. </li><li> Nach dem Kultivieren der Zellen bei 37 ° C fixieren Sie den Kollagen-I-Stopfen für 30 min in 4% Paraformaldehyd in 1x PBS. </li><li> Komplette Immunfluoreszenz wie in Schritt 3, mit Ausnahme der folgenden Schritte: permeabiliZe mit 0,2% Triton X-100 in 1x PBS für 30 min, nicht 10 min; Inkubieren mit primären und sekundären Antikörperlösungen für jeweils 1,5 h, anstatt 40 min bzw. 30 min. Fleck für F-Aktin oder Kerne, um die Zellen zu lokalisieren. </li><li> Nach der Immunfluoreszenz ein Skalpell verwenden, um die Membran des Einsatzes zu schneiden und den Kollagen-I-Stecker vorsichtig auf eine Glasbodenschale zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Kollagen-I-Steckers mit dem Glas in Berührung kommt. Halten Sie die Einsatzmembran an der Unterseite des Kollagen-I-Steckers befestigt, um die Integrität des Steckers beizubehalten. HINWEIS: Der Collagen-I-Stecker bleibt in der Glasbodenschale intakt. Die Tiefe zwischen dem Glasboden und dem Kunststoff, der den Glasboden umgibt, entspricht der Dicke des Stopfens. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf das Kollagen I-Stecker und montieren mit polymerisierenden Montagemedium, um zu verhindern, dass der Stecker austrocknet. </li><li> Verwenden Sie ein umgekehrtes konfokales Mikroskop, um den Kollagen-I-Stecker abzubilden. die Spitze vonDer Stecker steht mit dem Glasboden der Schale in Kontakt. <ol><li> Erwerben Sie einen Z-Stapel von der Oberseite bis zum Ende des Kollagen-I-Steckers, um die Zellinvasion zu visualisieren. Bestimmen Sie die Dicke des Z-Stapels, indem Sie untersuchen, wie tief die Zellen in das Bildgebungsfeld eindringen. Führen Sie Akquisitionen mit einem 40X Ölobjektiv in einem 512 x 512 Format mit einer z-Schrittgröße von 0,25 μm durch. HINWEIS: Als Referenz ist der durchschnittliche Z-Stack für MDA-MB-231 Zellen 3 Tage nach dem Seeding 30 μm. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li><li>Gilkes, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+prolyl+hydroxylases+are+essential+for+breast+cancer+metastasis.">Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis.</a> Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).</li><li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degrading+Devices:+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion.">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).</li><li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'ins'+and+'outs'+of+podosomes+and+invadopodia:+characteristics,+formation+and+function.">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li><li>Di Martino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Tks5:+a+minimal+and+universal+molecular+signature+for+functional+invadosomes.">Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes.</a> Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).</li><li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+invasion+by+tumour+cells:+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia.">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+type+I+collagen+organization+induces+the+formation+of+a+novel+class+of+linear+invadosomes.">Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway.">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li><li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts.">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. Exp. , e4119 (2012).</li><li>Diaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+detection+and+gelatin+degradation+assay.">Invadopodia detection and gelatin degradation assay.</a> Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).</li><li>Artym, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+fibrillar+collagen+is+a+potent+inducer+of+invadopodia+via+a+specific+signaling+network.">Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network.</a> J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane.">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li><li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+invasion+assays:+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay.">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li><li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance:+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases.">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li><li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li><li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia.">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Klassisch werden Invadosomen in vitro ohne Rücksicht auf die Mikroumgebung und die Matrix untersucht, auf der die Zellen plattiert werden. Mehrere Matrixarten werden derzeit verwendet, einschließlich Gelatine, Fibronectin, Vitronectin oder hochdichtes fibrilläres Kollagen (HDFC) 7 , 11 ; Diese sind jedoch oft nicht repräsentativ für die Mikroumgebung, in der sich Zellen befinden und nicht physiologisch relevant sind. Hier wurde ein neuartiger Matri...

Extrazelluläre Matrix (ECM) Remodeling erfolgt während physiologischer und pathologischer Prozesse wie Angiogenese und Tumorzellinvasion. In physiologischen Bedingungen können viele Zelltypen, meist aus der hämatopoetischen Abstammung, ECM-Elemente abbauen. Zum Beispiel können Makrophagen anatomische Barrieren kreuzen, um Gewebe zu erreichen, und Osteoklasten verschlechtern die Knochenmatrix, um die Calciumhomöostase zu gewährleisten. Weltweit erneuern sich alle Matrizen im Körper, um ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften zu erhalten. In Krebsgeweben wird die Tumor-Mikroumgebungszusammensetzung verändert. Zum Beispiel bei Brust-und Lungenkrebs, Typ I Kollagen ist überexprimiert und sammelt sich um den Tumor. Darüber hinaus ist diese Akkumulation mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung von Metastasen 1 , 2 verbunden. Die Krebsmetastase hängt von der Fähigkeit von Krebszellen ab, das ECM abzubauen und in benachbarte Gewebe einzudringen. DasInvasive Aktivität von Zellen wird auf spezialisierte aktinreiche Strukturen, die als Invadosomen bekannt sind, zugeschrieben. Dieser Begriff schließt Podosomen und Invadopodien ein, die jeweils in normalen und Krebszellen vorhanden sind ( z. B. Makrophagen, Endothelzellen und Krebszellen wie die MDA-MB-231-Brustkrebszelllinie). In vitro können Invadosomen in verschiedene Formen organisieren: Punkte, Aggregate oder Rosetten 3 . Klassisch bestehen Invadosomen aus einem F-Aktin-Kern, der mehrere Proteine ​​enthält, wie das Gerüstprotein Tks5 und Cortactin, umgeben von Adhäsions-Plaque-Molekülen wie Integrinen und Vinculin 4 . Vor kurzem wurde gezeigt, dass Tks5 und die RhoGTPase Cdc42 als minimale molekulare Signatur für funktionelle Invadosomen verwendet werden können 5 . Diese Strukturen sind in der Lage, das ECM durch die Rekrutierung und Aktivierung von spezifischen Metalloprotease-Proteinen wie MT1-MMP und MMP-2 zu verschlechtern. In einer früheren Studie berichteten wir, dass die Wechselwirkung zwischen Kollagenfibrillen des Typs I und dem Diskoidin-Domänenrezeptor 1 (DDR1), einem spezifischen Rezeptor von Kollagenfibrillen vom Typ I, zur Bildung einer neuen Klasse von Invadosomen mit dem Namen lineare Invadosomen führt. Lineare Invadosomen werden entlang Kollagenfibrillen des Typs I gebildet 7 . Diese Strukturen sind in der Lage, Typ-I-Kollagenfibrillen durch die Rekrutierung und Aktivierung von MT1-MMP / MMP2 abzubauen. Darüber hinaus ist ihre Bildung abhängig von Tks5 und Cdc42 5 . In vitro zeigten wir die Existenz von linearen Invadosomen und die Beteiligung von DDR1 an ihrer Bildung und Aktivität 8 unter Verwendung verschiedener Strategien, die aus einer Kombination verschiedener Matrixelemente bestehen, einschließlich: i) fluoreszierende Gelatine-beschichtete Deckgläser, ii) fluoreszierende Kollagenfibrillen vom Typ I -beschichtete Deckgläser und iii) 3D-Typ-I-Kollagen-Stopfen. Durch den Einsatz unterschiedlicher Matrizen konnten wir studieren und charakterisierenIve lineare Invadosomenbildung und deren Abbauaktivität 7 , 8 . Um die Biologie von invasiven Zellen besser zu verstehen, wurde eine Kombination von ECM-Komponenten sowohl in 2D- als auch in 3D-Kultursystemen verwendet, wobei die Komplexität der Tumor-Mikroumgebungszusammensetzung nachgeahmt wurde. Im Folgenden sind Protokolle für die Beschichtung von Deckgläschen mit Gelatine / Typ I Kollagen in 2D- und 3D-Kultursystemen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td>
			<td>Molecular probe life technologies</td>
			<td>G13186</td>
			<td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses</td>
			<td>Marlenfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>111520</td>
			<td>&#216;12mm No.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15960</td>
			<td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Use this PBS in all steps before fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-30122</td>
			<td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortactin 4F11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5180</td>
			<td>Invadosome markers Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DDR1 antibody</td>
			<td rowspan="2">Cell signaling</td>
			<td rowspan="2">5583</td>
			<td>Linear invadosome receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FT-AZ0330</td>
			<td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33258</td>
			<td>Nucleus marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G mounting medium</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP 483331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Public domain</td>
			<td></td>
			<td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353097</td>
			<td>8.0&#181;m pore size / 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

Zelladhäsion, Migration und Invasion sind in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert. Zum Beispiel müssen die Tumorzellen während der Metastasenbildung anatomische Barrieren überqueren, um durch das umgebende Gewebe einzudringen und zu wandern, um Blut oder Lymphgefäße zu erreichen. Dies erfordert die Wechselwirkung zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM). Auf zellulärer Ebene sind viele Zellen, einschließlich der Mehrheit der Krebszellen, in der Lage, Invadosomen zu bilden, die F-Aktin-basierte Strukturen sind, die in der Lage sind, ECM abzubauen. Invadosomen sind protrusive Aktinstrukturen, die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) rekrutieren und aktivieren. Die molekulare Zusammensetzung, die Dichte, die Organisation und die Steifigkeit des ECM sind entscheidend für die Regulierung der Invadosomenbildung und -aktivierung. In vitro ist ein Gelatine-Assay der Standard-Assay, der verwendet wird, um Invadosomen-Abbauaktivität zu beobachten und zu quantifizieren. Allerdings ist Gelatine, die denaturiertes Kollagen I ist, keine physiologische Matrix eLeasing Ein neuartiger Test unter Verwendung von Kollagenfibrillen vom Typ I wurde entwickelt und verwendet, um zu zeigen, dass diese physiologische Matrix ein potenter Induktor von Invadosomen ist. Invadosomen, die sich entlang der Kollagenfibrillen bilden, werden als lineare Invadosomen aufgrund ihrer linearen Organisation auf den Fasern bezeichnet. Darüber hinaus zeigte die molekulare Analyse von linearen Invadosomen, dass der Diskoidin-Domänen-Rezeptor 1 (DDR1) der Rezeptor ist, der an deren Bildung beteiligt ist. Diese Daten zeigen deutlich, wie wichtig es ist, eine physiologisch relevante Matrix zu verwenden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ECM zu verstehen.

Unter Verwendung einer Kombination von zwei Arten von Matrizen, Gelatine und Typ I Kollagen ( Fig. 1 und 4 ) haben wir eine neue Art von Invadosom, bekannt als lineare Invadosomen, hervorgehoben. Die Markierung dieser Matrizen ermöglicht die Beobachtung der linearen Invadosomenbildung entlang der Kollagen-I-Fasern und ihrer Abbaubarkeit (Abbildung 5 ). Die Anzahl der invasiven Strukturen kann dann durch das zuvor beschriebene Makro quan...

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine 2D-Mischmatrix, bestehend aus Gelatine und Kollagen I, und einem 3D-Kollagen-I-Plug, um lineare Invadosomen zu studieren, vorzubereiten. Diese Protokolle erlauben die Untersuchung der linearen Invadosomenbildung, der Matrixabbauaktivität und der Invasionsfähigkeit von Primärzellen und Krebszelllinien.

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Aufrufe.  INSERM U1053.  Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine 2D-Mischmatrix, bestehend aus Gelatine und Kollagen I, und einem 3D-Kollagen-I-Plug, um lineare Invadosomen zu studieren, vorzubereiten. Diese Protokolle erlauben die Untersuchung der linearen Invadosomenbildung, der Matrixabbauaktivität und der Invasionsfähigkeit von Primärzellen und Krebszelllinien. 

Serie: 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

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