TB와 HG 유럽 연구 위원회 "Cellufuel, 고급 보조금 번호 294438"를 통해 재정 지원을 인정 한다. SS 금융 인정 HCS 인정 교육 및 Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt)를 통해 연구에 대 한 연방 정부에서 재정 지원, 과학 교육에 대 한 바이에른 주 교육부에서 지원 통해 연구 초점 "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe-캔터". 우리는 기술 지원에 대 한 코니 Hasselberg-크리스토프와 마르티나 Hörig 감사

저자는 공개 없다.

AFM의 도입 기반을 SMF, 그것을 직접 내 고 intermolecular 개별 단백질, 핵 산 및 다른 생체3,,45의 널리 사용된 기법으로 진화. 성공적인 SMF 실험에 대 한 전략을 결합 하는 적절 한 표면 필수입니다. 천연 및 합성 폴리머에 intramolecular 힘을, 중합체는 기판 표면 및 AFM 팁36,,3839,40,41직접 결합 될 수 있습니다. 그러나 분자 채권 등 간 분자 상호 작용의 수사를 위해, 그것입니다 이종 bifunctional 못 링커 등 polypeptide 사슬, 유연한 링커 분자 AFM 팁을 상호 파트너를 연결 하 고 수 있도록 바인딩 파트너의 올바른 방향에 대 한 단거리 표면 힘을 극복 하 고 변성 그리고 단백질21,,2223의 전개를 피하기 위해 기판 표면 24,25,26,,2742. 우리 따라서 이종 bifunctional 못 스페이서를 사용 하 여 그들의 접근 주 아민 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 대 한 간단 하 고 곧장 앞으로 프로토콜을 설명 합니다.
우리가 그것의 적용을 보여주는 상호 작용의 수사 adhesin 미 균 에서 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn, 사이 힘 최근에 자세히 설명 다른 곳13.
표면 화학 잘 설립 하 고 분석 하 고 유사한 접근 여러 SMF 실험19,,4243,44,45에서 성공적으로 사용 되었습니다. 표면에 폴리머 실 란 커플링 사용 하는 silylether는 가수분해. 가수분해의 정도 silanization 과정에서 통제 될 수 있다 형성된 된 실록 산 결합의 금액에 따라 달라 집니다. 높은 상호 작용 힘 (≥ 1000 pN)는 SMF 측정 하는 동안 예상 하는 경우는 silanization 수행 통해 -기상 증 착30 낮아집니다의 지속적인 층의 형성 귀착되는 해야 합니다. 많은 실험 (예를 들어, 많은 단백질-단백질 상호 작용), 상호 작용 힘 몇 백 pN 및 설명된 절차는 실록 형성 수성 단계에서 증 착에 의해 실시 및 언바운드의 범위에는 유기 실 에탄올 (단계 1.1.7) 열 (단계 1.1.8) 치료 다음 씻어 신중 하 게, 충분 하다.
또 다른 중요 한 단계 나머지 EDC를 세척 하 고 보 건국 분자 표면 (1.2.3 단계)에서 남은 단백질에 carboxyl 그룹의 활성화로 이어질 것입니다. 이 기능을 변경할 수 있습니다 동일한 표면에 단백질의 가교에서 어느 결과 또는 몇 반대 표면에 다른 단백질에 단백질을 활성화 하는 covalently. 이 단백질 표면 사이의 도메인 전개 동반 가능성이 높은 파열 힘 귀착되는 AFM 팁의 클램핑 이어질 수 있습니다 ( 그림 3b, 추적 1, 4 및 5 참조 Fn 도메인의 전개)46. 못 스페이서의 활성 NHS 에스테 르는 불포화 경우 같은 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서, Tris 버퍼 식 염 수를 가진 외피는 좋습니다 (단계 1.2.6), 트리 스의 1 차 아민 냉각 나머지 아미노 반응 그룹으로.
Silanized 유리에 Fn의 균일 분포를 리드 stepwise 프로토콜에 따라 표면 ( 그림 2참조), 단백질의 dimeric 형태를 떠나. 이 솔루션에서 Fn´s 구조를 닮 고 다른 샘플 표면37에 이전 AFM 데이터와 일치. 또한, AFM 팁에 RrgA의 적절 한 농도, 얻어진 다는 SMF 측정 (그림 3 및 그림 4) 동안 잘 정의 된 상호 작용 이벤트 ~ 20%의 대상 값을 생성. 또 다른 우아한 방법은 다양 한 단백질 농도 및 부 화 번 외 샘플 기판 및 캔틸레버 끝에 결합 하는 분자의 양을 제어 실-대리인 다른 보조 기능 그룹의 조합입니다. 못-폴리머에서 연장 하는 단백질 반응 그룹의 비율을 변경 하 여 고정된 단백질의 수는 제어15,16,,1718수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 또한 다른-NH2 포함 된 분자를 무력화 하거나 유리 및 실리콘 질 화물 외 다른 실리콘 산화물 표면에 몇 단백질 조정 사용할 수 있습니다. 단백질 디자인 따라 아민 반응 carboxyl 그룹으로 변경할 수 있습니다 통해 단백질 하 sulfhydryl 반응 그룹 (예를 들어, maleimide 또는 pyridyl 직교 이황화) 무료-SH 그룹. Fn,이 미리 정의 된 방향13,,1720결과.
요약 하자면,이 프로토콜 다른 요구 사항을 제공 하기 위해 조정 될 수 있다 고 단일 분자 힘 분광학 실험 외 다른 생물 응용 프로그램에 적합 합니다.

광학 및 자기 핀셋, 옆에 원자 힘 현미경 (AFM)1,2 유용한 도구를 분석 하 고 분자 조작으로 떠오르고 있다 및 그들의 속성 및 기능, 외부 힘3에 그들의 응답을 포함 하 여 조사 ,4. 반면 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 같은 방법, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 석 영 크리스탈 중량 (QCM) 설정, AFM 수 단일 분자 (SMF)5 및 단일 셀 수준 (SCFS)6에 상호 작용을 측정 하 . 이러한 기술은 나왔고 캐치 채권 S. 구 균에서에서 Fn 바인딩 단백질에 의해 형성 된 대장균 pilus 단백질만 노 오 스7, 또는 협동 β-지퍼 FimH 반복의 상호 작용에 대 한 발견 처럼 바인딩 메커니즘에 대 한 값진 통찰력 바인딩 Fn8시. 최근 pilus-1 adhesin RrgA9,10 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)11 에서 fibronectin12 에 바인딩할 수는 보여줄 수 있었습니다. 와 그것의 2 개의 터미널 도메인. 이 새로운 2-도메인 바인딩 메커니즘을 탠덤 β-지퍼에서 다른 고 수 있습니다 형성 하 고 유지 과도 fibronectin 포함 된 연락처 호스트 표면13piliated pneumococci는 밝혔다.
SMF 실험의 성공을 비판적으로 고체 표면 및 AFM 팁에 생체의 기능 및 기본 동원 정지에 따라 달라 집니다. 높은 힘 SMF 측정 하는 동안 발생할 수 있습니다, 단백질 해야 선호 covalently 결합 표면에. 많은 단백질 등의 생체는 물론 (무기) 고체 표면, 나노 입자와 문학14,15에서에서 설명 하는 다른 장치에 전체 셀의 동원 정지에 대 한 다른 연결 방법 ,16,17,18,19,20,,2122,23,24, 25,,2627. 이러한 프로토콜은 자주 확인 유해 물질의 사용, 수행 및 특수 장비 (예를 들어, 플라즈마 클리너)를 필요로 하기 어렵습니다. 한쪽에 silane 반응 그룹 및 그들의 다른 쪽에는 아민 반응 그룹 heterobifunctional crosslinkers의 두꺼운 폴리머 레이어를 연결할 몇 분자 유리를 하는 간단한 방법이입니다. 어플리케이션, 커플링 에이전트 가변 길이, 예의 유연한 하이드로-탄소 사슬을 함유 할 수 있다., polyethylenglycol (나무 못). 그들은 수정 된 표면 (예를 들어, 소수 성, 정전기 그리고 van der Waals 상호 작용)의 일반적인 상호 작용을 억제 하 고 결합 된 분자 회전 자유를 제공할 수 있습니다.
여기, 우리는 공유 결합을 포함 하는 하나 이상의 무료 아미노 그룹 단백질의 일반적인 프로토콜 설명 (-NH2) 유리를 표면 및 실리콘 나이트 라 이드 AFM 팁 통해 는 heterobifunctional ethoxy silane 못 carboxyl (-COOH). 이 프로토콜은 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn의 상호 작용에 따라 궁 행 하는 SMF 실험, 사용할 수 있습니다 (에 대 한 개요 그림 1 참조).
첫 번째 단계는 표면28,29,,3031의 silanization 이다. 그것은 반응성이 매우 높은 SiOH 그룹을 형성 하기 위하여 커플링 에이전트의 ethoxy 그룹의 가수분해를 포함. 이 기판에 SiOH 그룹으로 반응 수 있습니다. 기본 응축에, 이러한 silanols 양식 수소 결합을 기판에 확산 있습니다. (요구 하는 일반적으로 열 또는 물을 제거 하는 진공) 보조 응축 반응, 실록 산 결합 형성 된다. Covalently 연결 된 유기 실 란 계층 결과.
두 번째 단계는 단백질 기능을 결합 (-COOH) 폴리머32에서 확장 하는 그룹. 첫째, 산 성은 반응 N-hydroxysuccinimid (NHS) 에스테 르 중간, 기초가 튼튼한 보 건국/EDC를 통해 얻은 변환 됩니다 (1-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 화학33 및 대체를 겪 습 및 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 한다.
이 방법에서는, 실리콘 질 화물 AFM 팁 및 무작위 방향에서 유리 기판에 인간의 Fn RrgA 결합 했다 그리고 그들의 상호 작용 힘 단일 분자 수준에서 분석 했다. 우리의 결과 설명된 표면 화학은 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 측정 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여 줍니다. 이 화학 일반적인 배경 상호 작용을 감소, 데이터 수집 기간 동안 작은 변경 적용 이며 따라서 무척 정확한 SMF 실험에 적합.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

최근 몇 년 동안, 원자 힘 현미경 (AFM) 단일 분자 힘 분광학 (SMF) 분자 속성 및 기능에 대 한 우리의 이해를 확장을 기반으로. 그것은 우리에 게 자세히 호스트 표면 수용 체에 어떻게 세균 adhesins 바인딩 생물 메커니즘, 예를 들면의 다양성을 탐구 하는 기회를 주었다. 다른 요인 들 중 고체 표면 및 AFM 팁에 대 한 관심의 생체의 기능 및 기본 immobilization SMF 실험의 성공에 의하여 달려 있다. 여기, 우리가 순서로 silane-말뚝-carboxyls와 잘 설립 N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) 화학을 사용 하 여 실리콘 표면에 단백질의 공유 결합에 대 한 간단한 프로토콜 설명 에 세포 외 기질 단백질 fibronectin (Fn)와 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)에서 pilus-1 adhesin RrgA의 상호 작용을 찾아보기. 우리의 결과 표면 기능화 리드 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 AFM 캔틸레버 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여합니다 측정 계시 RrgA 52 pN의 평균 힘 Fn에 바인딩합니다. 프로토콜 몇 사이트를 통해 특정 무료 thiol 그룹을 조정할 수 있습니다. 이 미리 정의 된 단백질 또는 분자 방향 귀착되 고 SMF 외 다른 생물 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다.

프로토콜 설명 여기 를 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 결과 임의의 방향 (그림 1) 액세스할 수 있는 그들의 1 차 아민. 그림 2 (왼쪽)와 silanized 유리 표면의 AFM 이미지를 보여줍니다 그리고 질소의 부드러운 스트림 아래 샘플의 탈수 후 (오른쪽) Fn 움직일 수 없이 기록. Silane 폴리머 레이어 Fn와 기능성된 표면에만 작은 표면 파형 높이 약 2-5 nm (그림 2, 오른쪽), 동안, 약 10 nm 높은 Fn 분자는 명백한 (그림 2, 왼쪽). 클로즈업, Fn의 dimeric 구조를 인식할 수 있습니다. Fn 분자 말뚝 표면 코팅 위에 4-5 nm의 높이와 길이의 소형 것 같다 ~ 120 nm (삽입 참조).
조사는 최근 자세히 설명 우리의 그룹13, Fn와 RrgA의 상호 작용 힘에 RrgA 실리콘 질 화물 AFM 팁과 유리 기판 (그림 3a)에 인간의 Fn에 결합 했다. 그림 3 샘플 분리 곡선 Fn 1 µ m s-1의 당기 속도에서 기록 된 RrgA의 상호 작용의 대표적인 팁을 보여 줍니다. 사용 된 표면 화학 상호 작용을 낮은 배경 및 체인 (eWLC) 모델 (빨간 곡선) 같은 확장 가능한 벌레를 사용 하 여 장착 했다 (그림 3a), 잘 모양된 (또는 2) 상호 작용 이벤트에. AFM 팁과 기판, 스트레칭 못 링커 (> 70 nm), 일반적인 표면 상호 작용까지 극복 후 보여줍니다 적합 (파열 힘 및-길이 그림 4참조)의 결과 플롯 ~ 19% 힘 곡선의 파열을 보여주었다 말은 파열 된 이벤트 RrgA-Fn의 상호 작용에 대 한 강제 ~ 약 100의 팁-샘플 거리에서 52 pN nm. 반면, 부적당 한 표면 화학 (여기, 염 분 그림 3b버퍼링 트리 스와 냉각 하는 생략) 여러 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 난다 상호 작용으로 인해 단일 상호 작용 이벤트에 대 한 명확한 평가 방해 것 이다 / 샘플 표면 및 AFM 캔틸레버 끝 사이의 단백질의 카 하 플 공유 링 높은 파열 힘 (추적 1) 단백질 (Fn) 도메인 (추적 4와 5)의 전개와 함께 가능 하 게이 리드.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> 그림 1: 표면 화학을 통해 개요. Ethoxy silane-말뚝-carboxyl의 가수분해 실록 crosslinks의 형성과 수산화 유리 표면에서의 결로 옵니다. Carboxyl 그룹 EDC의 반응 반응 o-acylisourea, 수성 해결책 (가수분해) 매우 짧은 반감기를 가진 아민 반응 중간 결과. 중간을 겪 습 및 대체 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 하는 NHS 에스테 르의 형성에 의해 안정 이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> 그림 2: 동원 정지의 한 유리 기판 통해 heterobifunctional ethoxy silane 말뚝에 fibronectin carboxyl 커플링 에이전트. 기능성된 유리의 AFM 이미지 (왼쪽)와 표면 및 (오른쪽) 없이 Fn. 숫자 (삽입) 기판 표면에 균질 분산 개별 Fn 분자를 나타냅니다. 분자는 말뚝 위에 4-5 nm의 높이 dimeric이 고 컴팩트한 구조 채택 코팅과의 길이 > 100 nm. 이 솔루션에서 Fn의 구조를 닮 고 다른 표면, 예를 들어, 운 모에 이전 AFM 데이터와 일치 (눈금 막대의 상 = 500 nm)37. AFM 아래 이미지는 AFM 이미지에 표시 된 라인을 따라 높이 프로필. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> 그림 3: SMF 실험 및 대표 일러스트 힘 거리 곡선 RrgA-Fn 상호 작용의. (a) RrgA와 Fn covalently 연결을 통해 heterobifunctional ethoxy silane 못 했다 carboxyl 커플링 에이전트 실리콘 나이트 라 이드 AFM 외팔보 팁과 유리 표면, 각각. 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Fn와 상호 작용 수 축력 속도에 1 µ m s-1 의 RrgA와 Fn의 설명된 동원 정지에 대 한 얻은 표시 됩니다. 빨간 곡선 파열 힘 및 길이에 적용 된 확장 가능한 웜 같은 체인 맞는 나타냅니다. 그림은 Becke, 그 외 여러분, ACSnano 201813에서 수정 되었습니다. (b) 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Tris 버퍼와 냉각 없이 Fn 상호 작용에 대 한 얻은 염 분. 이 경우에, 트리 스의 1 차 아민은 결 석 활성 남아 있도록 NHS 에스테 르 남았다 불포화 실험 기간 동안. 이것은 다중 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 하며 단백질 표면 사이의 높은 파열을 초래한 AFM 팁의 클램핑 (Fn-) 함께 도메인 전개 (추적 1, 4, 5; 다른 비늘을 참고). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> 그림 4: 단일 RrgA-Fn 상호 작용의 힘 및 길이 분포. 힘 및 RrgA-Fn SMF 상호 작용 측정에서에서 얻은 해당 파열 길이 히스토그램 파열 (n = 1400) 1 µ m s-1의 상승 속도에. 히스토그램 공개 51.6 pN (가우스 적합, 검은 선)의 가능성이 가장 높은 파열 힘 fMP 와 축적의 파열 길이 약 100 nm. 그림은 Becke 외., ACSnano, 201813에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

covalent-immobilization-proteins-for-single-molecule-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.0K 조회수.  Munich University of Applied Sciences. 이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

비디오: Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

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연구

생화학

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...