이 작품은 과학 인터페이스 (ARD), NIH 원장의 새로운 혁신 보너스 프로그램을 통해 국립 보건원 1-DP2-OD007078 (ARD), 윌리엄 Bowes 주니어 스탠포드 대학원 원정대 (ASA에서 버로우즈 Wellcome 경력 수상에 의해 지원되었다 ), 그리고 스탠포드 순환기 학회 젊은 Predoctoral 원정대 (JC). 저자들은 현미경 장비를 빌린 위해 제임스 Spudich 감사드립니다.

1. 흐름 셀 준비 <ol><li> Coverslips은 (# 1.5, 22x22 mm와 22x40 mm, VWR) sonication을 사용하여 청소합니다. <ol><li> coverslips를 개최하고 (단계 2 참조) sonicator에서 피팅 가능한 작은 유리 용기에 coverslips을 추가합니다. </li><li> 이소프로판올과 용기를 기입하고 20 분 동안 목욕 sonicator에 sonicate. </li><li> 이소프로판올을 취소하고 Barnsted MilliQ 장치 또는 이와 유사한 장치에 의해 생산된 탈이온수의 풍부한 수량과 coverslips를 헹굴. 물로 용기를 기입하고 20 분 동안 sonicate. </li><li> sonication 후, 여과, 먼지없는 공기의 흐름에 coverslips을 건조. (예 : 없음 얼룩) 깨끗한에만 표시 coverslips를 사용하십시오. </li><li> 천천히 불꽃이 몇 초간 coverslips는 남아있는 먼지와 습기 그들을 청소하는 방법 : 초과 열로 인해 coverslip을 워프하지 돌보는, 분젠 버너로 생산된 가스 불꽃을 통해 coverslips를 전달합니다. 이 단계는 잔여 표면을 제거오염 물질. </li></ol></li><li> 양면 스카치 테이프를 이용하여 함께 두 coverslips 첨부합니다. 테이프를 자르고 ~ 길이 3cm, 폭 0.3 cm. 중간에 1.6 cm 채널을두고 22x40 밀리미터 coverslip에 테이프를 부착합니다. 부드럽게 테이프가 제대로 준수되었는지 coverslip에 아래로 누르십시오 피펫 팁을 사용합니다. </li></ol> 2. 마그네틱 족집게 설정 및 교정 <ol><li> 마그네틱 핀셋은 이전에 10,12 설명된대로 영구 희토류 자석을 사용하여 설치했다. 알루미늄 L-브래킷은 1 밀리미터 직경 핀홀과 건설과 수직 Z-번역사 (Thorlabs) 족집게의 높이를 조절하기 위해 장착되었다. 두 개의 영구 희토류 자석은 자석 트랩 (그림 1)을 만드는 핀홀의 양쪽에 받침대가 붙어 있었다. </li><li> DNA의 준비 : 그 5 &#39;및 3&#39;에서 분류 람다의 파지의 DNA는 비오틴과 digoxigenin (IDT의 DNA, 샌디에고, CA)와 엔드 탄환을 보정하기 위해 사용되었다netic 핀셋. <ol><li> 10 분 60 복합 oligonucleotide와 열 ° C를 비오틴 40 nm의 2 μL와 4 nm의 λ-DNA의 50 μL를 섞습니다. 일시간 이상 상온에서 다음 천천히 좋아. </li><li> 제조 업체의 사양에 따라의 DNA ligase를 추가하고 3 시간 동안 실온에서 ligate. </li><li> 45 분 동안 상온에서 400 나노미터 digoxigenin 복합 oligonucleotide과 부화 2 μL를 추가합니다. </li><li> 10 밀리미터 ATP의 1.5 μL을 넣고 3 시간 동안 λ-DNA에 dig​​oxigenin 복합 oligonucleotide의 결합을 계속합니다. </li><li> 100 kDa의 스핀 필터 (Microcon Ultracell YM-100)를 사용하여 초과 oligonucleotides 그리고 DNA ligase를 제거합니다. TE 버퍼에 1,000 배 버퍼 교류의 총 초과 oligos를 제거하는 적절한 것입니다. 참고 : DNA의 전단으로 이어질 것이기 때문에 그것은 회전 속도&gt; 500xG을 사용하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 그 DNA는 내가 보장하기 위해 0.7 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 관한 통해 DNA 샘플을 검사s의 변성이나 빠졌어 않습니다. </li><li> DNA의 농도를 측정합니다. 사용 가능한 샘플 볼륨이 매우 작은이 될 수 있으므로 Nanodrop UV-VIS 분광계 (써모 과학)의 사용을 권장합니다. </li></ol></li><li> 섹션 1에서 설명한대로 흐름 세포를 준비합니다. </li><li> 흐름 세포로 DNA의 첨부 파일, 안티 digoxigenin 항체를 추가 (양 IgG, 1 μg ML -1; 로슈 Bioscience, Manheim, 독일)와 그것이 15 분 동안 유리 표면에 충실하실 수 있습니다. </li><li> 1X PBS로 200 밀리그램 ML -1 BSA, 0.1 % 십대 초반-20을 추가하여 DNA의 불특정 버티는 것을 막기 위해 흐름 세포의 표면을 Passivate. 45 분 동안 상온에서 품어. </li><li> 단계 2.5 반복합니다. </li><li> λ-DNA fuctionalized 50 PM을 추가하고 15 분 동안 coverslip에 첨부할 수 있습니다. </li><li> 1X PBS로 여분의 DNA를 멀리 씻는다. </li><li> 2.8 μm의 비즈 = 20 μg ML -1, streptavidin - 코팅 superparamagnetic 비즈 (1 μm의 비즈 = 2 μg ML -1 추가 </s최대&gt;)들을 15 분 동안 고정 DNA에 연결하실 수 있습니다. </li><li> 1X PBS로 초과 구슬 멀리 씻는다. </li><li> 마그네틱 족집게 교정 <ol><li> 멀리 시료 표면 (&gt; 15mm)로부터 위치로 영구 자석을 이동합니다. </li><li> 현미경에서 준비한 흐름 전지를 놓습니다. </li><li> 흐름 셀 위에 위치로 영구 자석을 이동합니다. </li><li> 멀리 유리 표면 모두에서 비즈에 초점을 맞춤으로써 λ-DNA가 작용 구슬의 초점 평면을 선택합니다. 정확한 초점 비행기는 원하는 구슬이 밝은 센터를 보유하고있는 것입니다. </li><li> 500 프레임 80 Hz에서 또는 그 이상의 구슬의 운동 비디오를 가져가라. </li><li> 가까이 샘플 표면에 자석을 이동합니다. 5mm 넘어 거리, 1 밀리미터 단위로 이동합니다. 1과 5mm 사이의 거리, 0.5 mm 단위로 이동합니다. 1mm 미만 거리, 0.25 밀리미터 단위로 이동합니다. </li><li> 각각의 새로운 자석 위치에 단계 2.11.5 및 2.11.6를 반복합니다. </li><li> 각 데이터에 대한설정 2D 가우스 발작을 사용하는 구슬의 중심을 추적합니다. </li><li> 사용하는 브라운 변동 통해 힘을 계산 : </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" /> K B T는 볼츠만 열에너지이고, L은 λ-DNA의 길이이며, &lt;x 2&gt; 중심 위치에 분산이다. <ol start="10"><li> rolloff 주파수를 찾기 위해 파워 스펙트럼 Lorentzian 끼워 맞춤을 통해 힘을 계산을 선택하여 세력의 정확성을 확인합니다. 응용 세력 관계에 의해 rolloff 주파수 관련이 : </li></ol><img alt="등식이" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" /> ƒ에 0 rolloff 주파수는 어디,이 구슬 반경이며, μ는 유체 점도 12. </li></ol> 3. 흐름 셀로 콜라겐 펩타이드 첨부 우리의 방법론의 적용에 대한 구체적인 예제를 제공하기 위해, 우리는 trimeric 콜라겐 모델 펩티드의 proteolysis를 특징 짓는 저희 연구실의 최근의 작업을 설명합니다. 우리는이 일반적인 접근 방식이 크게 다른 단백질과 polynucleotides에 적용할 수있다는 것을 기대하고 있습니다. <ol><li> 콜라겐 모델 펩티드는 삼중 나선 형성을 집행하는 10 5 배 myc 태그 (GPP), 콜라겐 뒤에 정화를위한 N-터미널 6x 그의 태그로 구성되어 형성 α1 잔류물 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), MMP를 한 인식 사이트 foldon 시퀀스 (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) 및 C-터미널 KKCK은 비오틴-maleimide으로 레이블링 촉진합니다. Foldon는 T4-파지 단백질 fibritin에서 유래하고, N 중 하나에 융합되면 콜라겐 모델 trimers을 안정화 - 또는 C-말단 13,14. </li><li> 이전 4,15 설명한 것처럼 콜라겐 펩타이드 및 MMP-1 단백질은 표현과 정화되었다. &lt;이/ 리&gt; <li> 안티 myc은 흐름 세포의 표면에 부착하도록 안티 - myc (15 μg ML -1) 20 분 동안 상온에서 흐름 전지 및 부화 추가합니다. </li><li> 2.5 단계에서 설명한 것과 같은 방법으로 5 밀리그램 ML -1 BSA를 사용하여 단백질의 불특정 첨부 파일을 방지하기 위해 유동 셀을 Passivate. </li><li> 150시 콜라겐 펩타이드를 추가하고 45 분 동안 myc 태그를 통해 항체에 연결하실 수 있습니다. </li><li> PBS 버퍼를 사용하여 과도한 콜라겐 멀리 씻는다. </li><li> streptavidin 코팅 superparamagnetic 비즈 (1 μm의 비즈 = 2 μg ML -1과 2.8 μm의 구슬 = 20 μg ML -1)들을 45 분 동안 콜라겐 분자에 첨부할 수 있습니다. 추가 1 μm의 비즈는 PBS에서 원하는 농도로 희석해야한다. 3 μm의 비즈 그런 다음 PBS에서 resolubilized 강한 자석을 사용하여 솔루션에서 분리해야합니다. 이 과정은 3 회 반복한다. 우리는이 단계가 GE에 필수적 것으로 나타났습니다t 3 μm의 비즈는 표면 고정화 콜라겐 펩타이드에 바인딩합니다. </li></ol> 4. 강제 Proteolysis 분석 <ol><li> 일단 흐름 세포는 낮은, ~ 1 PN 포스 밑에 자석 트랩의 영상 흐름 세포, 콜라겐 펩타이드 및 자기 구슬과 함께 조립하고 있습니다. 우리의 경험에서, 구슬 subpopulation 때로는 약하게 아닌 특정 방식으로 표면을 준수하고 있습니다. 겸손한 무력 신청이 구슬은 해방임을 보장합니다. </li><li> 흐름 세포에 활성 효소를 추가합니다. 이 경우 MMP-1은 3.5 밀리미터 APMA (4 aminophenylmercuric 아세테이트)를 추가하고 3 시간 동안 37 ° C에서 incubated하여 미리 활성화되었다. 정품 인증은 SDS-PAGE를 사용하여 검증되었다. </li><li> 곧 유동 세포가 자기 족집게 장치에 다시 도입되면로서, 일반적으로 수백 첨부된 구슬을하였으며,보기의 몇 가지 분야를 스팬 동영상을 기록합니다. 이것은 t = 0이 될 것입니다. </li><li> T를 반환하면서 뷰의 여러 분야를 기록하는 것과 같은 과정을 (반복모든 분리 구슬이나 더 이상 proteolysis가 뚜렷한입니다 때까지, 정기적인 시간 지점에서보기의 동일한 필드) O. </li><li> 운동 데이터 분석 <ol><li> 다른 시간 시점에서보기의 다양한 분야에 비즈를 카운트하고 평균. t = 0에서 구슬의 수를 각 시간 지점에서 구슬의 평균 수를 나누어 구슬의 개수를 정상화. 이것은 구슬의 절대 숫자는 실험에서 실험으로 다를 수 있기 때문에 우리는 서로 다른 실험의 proteolysis의 속도를 비교할 수 있도록합니다. </li><li> 시간의 함수로 비율로 잡아. 이 경우, 우리는 부패 지수 플러스 상수에 장착. </li></ol><img alt="등식 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" /> ƒ (T)는 (또는 콜라겐 분자가 unproteolyzed) 첨부 구슬의 비율이고, t는 시간이며,이 콜라겐 밧줄로 연결된 구슬의 분율이고, B는 부패 속도가 상수이며, C비 구체적으로 연결된 구슬의 분율입니다. <ol start="3"><li> 같은 실험은 MMP-1에 의해 콜라겐 proteolysis에 대한 무력의 효과를 명료하게하다 강제와 MMP-1 농도 변화에 반복됩니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 위의 프로토콜은 효소 proteolysis에 대한 무력의 효과를 연구를위한 마그네틱 핀셋 (그림 1)의 소설 사용을 설명합니다. 우리는 관찰된 브라운 변동의 크기와 다양한 자석의 위치 (그림 2)에서 롤 - 오프 주파수의 계산 모두를 사용하여 1 μm의 3 μm의 구슬을위한 핀셋을 보정. 힘 proteolysis 실험에서는 설치 프로그램이 DNA가 콜라겐 (그림 3, 4)로 대체되는 제외하고 비슷합니다. 남아있는 구슬의 정규화된 숫자 proteolysis 속도 (그림 5)을 찾을 시간의 함수로 꾸몄다 수 있으며,이 프로세스가 될 수 있습니다효소 농도와 세력 변화를 위해 반복했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" /> 그림 1. 자기 트랩 교정 프로세스의 도식 (확장되지 않음). 두 개의 영구 드문 지구 자석이 superparamagnetic 구슬을 끌어 자기장을 만듭니다. 위아래로 자석을 번역하는 것은 적용 력을 조정합니다. 구슬은 두 자석 사이에 핀홀을 통해 빛을 전달과 함께 종래의 밝은-필드 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다 삽입된 페이지 :. 이미지 40x 공기 목적으로 찍은. 날카롭고 둥근 반점이 coverslip 표면에 부착된 비즈 일치합니다. 밖에서 초점 개체는 단독 구슬입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" /> 그림 2. 1 μm의 (왼쪽)와 2.8 μm의 (오른쪽) 비드를위한 시료 표면의 자석 거리의 함수로 보정 부대의 음모의. 데이터는 경험적 함수에 적합했다 <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" /> 어디에 x는 자석의 거리입니다. = 31.8, B = 5.61, 및 C 1 μm의 비즈와 용 = 4.39 = 140, B 3 μm의 비즈를위한 = 3.10와 c = 1.86. 이 값은 특정한 악기와 실험적인 기하학에 특정한 있으며, 각각의 악기는 개별적으로 보정해야합니다. 각 지점에 오차 막대는 구슬 크기의 다양성으로 인해 구슬 기준으로 비드에 대한 적용 력에 ~ 10 %의 변화를 나타냅니다. 적용 힘은 구슬의 볼륨에 비례하고, 구슬 볼륨 (제조 업체 사양에 따라) 평균 이상 ~ 9 %를 다릅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" /> 그림 3. 강제 proteolysis 분석 설정 (없음 규모). 콜라겐 모델 trimer는 m 통해 coverslip의 표면에 붙어있다YC / 안티 myc 활용. streptavidin-코팅 superparamagnetic 비즈는 비오틴 - streptavidin 연계를 통해 콜라겐 trimers에 첨부됩니다. 활성 MMP-1 베인 시간이 지남에 따라 콜라겐, 구슬이 표면에서 분리하고 초점 평면에서 멀리 이동하는 원인. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" /> 그림 4. 시간의 함수로 proteolysis의 도식 만화. 만화는 proteolysis 같은 시간에 따른보기의 샘플 필드가 발생 보여줍니다. 시간이 지남에 MMP-1 상처 콜라겐과 비즈는 분리와 자기장의 영향하에 초점 평면에서 떨어져 이동합니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" /> 그림 5. Proteolysis 요금이 적용된 힘 16 다릅니다. , 6.2 PN (3 μm의 MMP-1, 적색)와 13 PN (0.2 μm의 MMP-1, 마술사, 표시 1.0 PN (블랙 3 μm의 MMP-1)에서 수집된 자료입니다nta). proteolysis의 속도 (적합한 매개 변수)는 다음과 같습니다 0.22 ± 0.02 분 -1 (1 PN), 0.46 ± 0.09 분 -1 (6.2 PN), 그리고 2.08 ± 0.18 분 -1 (13 PN). 오랫동안 포인트 (&gt; 15 분)에서 unproteolyzed 구슬의 분율은 다른 실험을 걸쳐 ~ 0.25의 약 일정하게 유지됩니다. 오차 막대는 각 시점에서 관찰의 수를 반영 Poisson 통계에 대응. N 개의 구슬 각 시점에서 오류가 N 2분의 1입니다. 첨부된 구슬의 분율에 오류가 propagation.1 ​​μm의 비즈가 1.0 PN과 6.2 PN 실험 및 2.8 μm의 비즈 13 PN 실험에 사용되었다 위해 사용되었습니다 오류에 의해 계산되었다.

<ol>
	<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment.">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li><li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis.">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).</li><li>Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+structure+and+wound+healing.">Fibrin structure and wound healing.</a> J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).</li><li>Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Load+Induces+a+100-Fold+Increase+in+the+Rate+of+Collagen+Proteolysis+by+MMP-1.">Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).</li><li>Zareian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+collagen/enzyme+mechanochemistry+in+native+tissue+with+dynamic,+enzyme-induced+creep.">Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.</a> Langmuir. 26, (2010).</li><li>Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+bovine+pericardium+accelerates+enzymatic+degradation.">Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation.</a> Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).</li><li>Jesudason, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+regulate+elastase+activity+and+binding+site+availability+in+lung+elastin.">Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin.</a> Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy:+determination+of+unbinding+force,+off+rate+and+energy+barrier+for+protein-ligand+interaction.">Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction.</a> Micron. 38, 446-461 (2007).</li><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads.">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li><li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers+in+cell+biology.">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+short+collagen-like+triple+helices+by+protein+engineering.">Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering.</a> J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).</li><li>Stetefeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+stabilization+at+atomic+level:+crystal+structure+of+designed+(GlyProPro)10foldon.">Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon.</a> Structure. 11, 339-346 (2003).</li><li>Chung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagenase+unwinds+triple-helical+collagen+prior+to+peptide+bond+hydrolysis.">Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis.</a> EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).</li><li>Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+the+specific+adhesion+of+cells+to+cells.">Models for the specific adhesion of cells to cells.</a> Science. 200, 618-627 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22, 292-299 (2006).</li><li>Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+ligand-receptor+complexes+using+magnetic+tweezers.">Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers.</a> Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).</li><li>Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoenzymatic+cleavage+of+the+ultralarge+vascular+protein+von+Willebrand+factor.">Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor.</a> Science. 324, 1330-1334 (2009).</li><li>Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li><li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding.">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜은 고전적인 단일 분자 기술을위한 새로운 사용을 설명합니다. 마그네틱 핀셋은 비용 효율적인 방법으로 높은 처리량 단일 분자 assays에 대한 중간 수 있습니다. 그러나 모든 실험 기법처럼 도전과 잠재적인 함정이 있습니다. 마그네틱 핀셋의 한계 광학 트랩에 비해 MT 장치의 공간과 시간적 해상도가 낮습니다. 또한, 여기에 설명된 간단한 MT에...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 마이크로 커버 글래스 # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> 마이크로 커버 글래스 # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> 람다 디엔에이 </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4의 DNA Ligase </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42,413 </td></tr><tr><td> 안티 Digoxigenin </td><td> 로슈 진단 </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> 안티 - myc 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> 소의 알부민 세럼 </td><td> 시그마 </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> P-Aminophenylmercuric 아세트산 </td><td> Calbiochem </td><td> 164,610 </td></tr><tr><td> 비오틴 - Maleimide </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> 비오틴은 oligo를 분류 </td><td> IDT의 DNA </td><td> 사용자 지정 합성 </td></tr><tr><td> Digoxigenin는 oligo를 분류 </td><td> IDT의 DNA </td><td> 사용자 지정 합성 </td></tr><tr><td> 콜라겐펩타이드 유전자 </td><td> DNA 2.0 </td><td> 사용자 지정 합성 </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> 하버드 플라스미드 데이터베이스 </td><td></td></tr><tr><td> Z-번역 </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> 번역자를위한 서보 제어기 </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolysis measurements using magnetic tweezers

기계 력의 생성 및 검출이 암 전이 1, atherogenesis 2 및 치료 3 상처에 직접 관련으로, 세포 생리학의 유비 쿼터스 측면이다. 이러한 예는 각에서 세포들은 주변에서 힘을 발휘하고 동시에 효소 리​​모델링 세포외 매트릭스 (ECM) 둘. ECM의 세력의 영향 때문에 4-7의 가능성이 생물 학적, 의학적 중요성으로 인해 상당한 관심 지역이되었다. 이러한 광학 트래핑 8, 원자 힘 현미경 9, 마그네틱 핀셋 10,11과 같은 단일 분자 기술은 연구자 개인의 단백질에 힘을 exerting하여 분자 수준에서 효소의 기능을 알아내기 수 있습니다. 이러한 기법, 마그네틱 핀셋 (MT)은 낮은 비용과 높은 처리량을 위해 주목할 수 있습니다. MT는 ~ 1-100 PN의 범위에서 힘을 발휘하고 밀리초에게 시간적 해상도를 제공할 수잘 단일 분자 수준 12 효소 메커니즘의 연구와 일치되는 자질. 여기에서 우리는 단일 단백질 분자의 proteolysis에 힘의 효과를 공부하는 높은 parallelizable MT 분석을보고합니다. 우리는 매트릭스 metalloproteinase 1 (MMP-1)에 의해 trimeric 콜라겐 펩타이드의 proteolysis의 구체적인 예제를 제시하지만, 이러한 분석은 쉽게 다른 기판과 프로 테아제를 공부하는 데 적용할 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers at JoVE.com

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K 조회수.  Stanford University. 이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

비디오: Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

연구

생체공학

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다<em&gt; 생체</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

형광 현미경으로 전단 흐름 하에서 단일 분자 변형 특성화

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...