Name: nuclear magnetic resonance spectroscopy for the identification of multiple phosphorylations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

The NMR facilities were funded by the R&#233;gion Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer's disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

15 N 1. 생산, 13 C-타우 (그림 1) <ol><li> BL21에 pET15b-타우 재조합 T7 발현 플라스미드 (13, 14)을 변환 (DE3) 유능한 대장균 박테리아 세포 15. 주 : 최장 (441 아미노산 잔기) 타우 이성체에 대한 cDNA의 코딩은 플라스미드 pET15b에서을 NcoI 및 XhoI에 제한 부위 사이에 클로닝한다. <ol><li> 유능한 BL21 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 플라스미드 DNA의 100 NG와 플라스미드 DNA의 μg의 당 1-5 × 10 (7) 식민지를 형성 (DE3) 세포의 부드럽게 50 μl를 섞는다. 참고 : 진핵 cDNA를 발현 코돈 - 사용에 최적화 된 균주는 인간의 타우를 생산하는 것이 필수적되지 않습니다. </li><li> 42 ° C에서 10 초 동안 다음 30 분 및 열 충격 얼음에 세포 혼합물을 놓습니다. 다시 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓고 실온 LB (루리아 - 베르 타니) 배지 1 ㎖를 추가합니다. 부드러운 하에서 30 분 동안 37 ℃에서 세균 현탁액을 부화동요. </li></ol></li><li> 항생제 암피실린을 100 ㎍ / ml를 함유하는 LB 한천 배지의 플레이트 상에 접종 루프를 고르게 세포 현탁액 100 ㎕를 사용하여 확산. </li><li> 37 ° C에서 15 시간 동안 선택 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 약 2 주 최대, 문화 단계로 진행하기까지 4 ° C에서 선택 판을 보관하십시오. 주 : 세균 배양 (50 % 글리세롤)의 글리세롤, -80 ℃에서 보관은 이후 단계에서 배양을 시작하기 위해 제조 될 수있다. </li><li> 멸균 M9 염 1 L (6g이 나에게 HPO 4 3g의 KH 2 PO 4 ml의 100 mM의 CaCl2를 10 ㎖의 100 × MEM 용 비타민 보충 1 mL의 1 M 황산, 1, 1 ml의 100 ㎎ / ㎖의 암피실린을 추가 0.5 g의 NaCl). 주 : 백색 침전물을 빠르게 방산 M9 소금에 염화칼슘 (2) 용액을 첨가에 형성 할 것이다. </li><li> 15 N 300 ㎎, 13 C-완전 배지, 15 1g을 용해NH 4 CL 13 C M9 배지 6 글루코스 10 ml를 2g. 살균 필터 직접 M9 배지에, 0.2 ㎛의 필터를 사용하여 동위 원소 용액. </li><li> 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖로 보충 된 LB 배지 20ml에 선택 플레이트로부터 박테리아를 형질 pET15b 타우 접종 루프를 사용하여 하나의 콜로니 일시. </li><li> 약 6 시간 동안 37 ° C에서 접종 매체를 품어. </li><li> 플라스틱 분광계 큐벳에서 세균 배양의 10 배 희석액 1ml를 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정한다. 참고 : 3.0-4.0의 600 중독에 대응하는 세균성 문화의 탁도는 포화 성장 단계에 도달했음을 나타냅니다. </li><li> 2 L의 삼각 플라스틱 배플 배양 플라스크에서 암피실린 (100 μg의 / ㎖ 최종 농도)로 보충 M9 성장 배지 1 L로 포화 LB 배양 20 ㎖를 추가한다. </li><li> 10 °로 설정 프로그램 배양기에서 배양 플라스크를 배치C 50 rpm으로. 다음날 이른 아침에 200 rpm으로 37 ° C로 전환 인큐베이터 프로그램. </li><li> 플라스틱 분광계 큐벳에서 세균 배양 1 ㎖에 측정 OD (600). 1 M IPTG 400 μL (이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드) OD 600 재조합 타우 단백질의 발현을 유도하는 약 1.0의 값에 도달 (-20 ° C에 보관) 스톡 용액을 첨가. </li><li> 또한 3 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션을 계속한다. 20 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 균체를 수집합니다. </li><li> -20 ℃에서 박테리아 펠렛을 동결. 필요하다면 장기간의 정제 공정 전까지 냉동 보관. </li></ol> 15 N 2. 정제, 13 C-타우 (그림 2) <ol><li> 121 ° C에서 압력솥 양이온 교환 (CEX) 정화 버퍼 20 분 15 PSI에서. 4 ° C에서 보관 버퍼. </li><li> 박테리아 세포 펠렛을 녹여 45 ㎖에 완전히 재현 탁추출 CEX의 버퍼 (50 mM의 NAPI의 완충액 pH 6.5, 1 mM의 EDTA)를 갓 프로테아제 억제제 칵테일 1 배 (1 정)과 DNAseI (2,000 대)로 보충. </li><li> 20,000 psi에서 고압 균질기를 이용하여 균체를 방해. 3-4 패스가 필요합니다. 40 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 불용성 물질을 제거합니다. </li><li> 수조를 사용하여 75 ° C에서 15 분 동안 박테리아 세포 추출액을 가열한다. 참고 : 흰색 침전물이 몇 분 후에 관찰된다. </li><li> 20 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기 및 열 안정성 타우 단백질을 포함 뜨는을 유지한다. </li><li> 다음 정제 단계까지 -20 ℃에서 저장, 필요하다면. </li><li> 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 시스템 (그림 3 A)를 사용하여 5 ml의 침대 컬럼으로 포장 강한 CEX 수지에 양이온 교환 크로마토 그래피를 수행합니다. <ol><li> 2.5 ml / 분으로 설정 유량. </li><li> 버퍼 CEX에서 열 평형 </li><li> 60-70 ML의 heated-를로드타우 샘플 펌프를 사용하여 추출 함유, 또는 대안 적으로 시스템에 따라 펌프. 플로우를 통해 분석은 타우 단백질이 효율적 (2.8 참조) 수지에 결합되어 있는지 확인 할를 수집합니다. </li><li> 다시 기본 값입니다 nm의 280에서 흡수 될 때까지 CEX로 버퍼를 수지 씻으십시오. </li><li> CEX B의 버퍼의 점진적인 증가에 의해 얻어진 세 단계의 NaCl 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용출 타우 (CEX 1 M NaCl을 가진 버퍼). 프로그램 FPLC 다음과 같이 500 mM의 NaCl을 도달하기 위해 5 CV 250 mM의 NaCl을, 50 % CEX B 버퍼에 두 번째 단계에 도달하는 10 컬럼 부피 (CV) 25 % CEX B 버퍼에 그라데이션의 첫 번째 단계와 세 번째 단계 이 CV에서 100 % 완충액 B CEX 1 M NaCl을 도달한다. 용출 단계에서 1.5 ml의 분수를 수집합니다. </li></ol></li><li> SDS-PAGE (12 % 아크릴 아미드 SDS-GEL) 쿠마시 염색 (도 3 A) (16)에 의해 용출 단계 동안 수집 된 분획의 10 μl를 분석한다. analy가 아니라 컬럼에 로딩하는 단계를 점검플로우 스루 10 μl를 쌩쌩. </li><li> 타우을 함유하는 분획을 선택하고 다음 단계에서 이들 분획을 풀. </li><li> 타우 함유 풀링 분수 (그림 3 B)에 버퍼 교환을 수행합니다. <ol><li> FPLC 시스템을 사용하여 50 mM의 암모늄 바이 카보네이트 (휘발성 버퍼)에 53 ml의 G25 수지 충전 층 (26 X 10cm)의 탈염 열 평형. </li><li> / 분 5 ㎖로 설정 유량. 5 mL의 주입 루프를 통해 열에 타우 샘플을 주입한다. 280 nm에서 흡수 피크에 대응하는 분획을 수집한다. </li><li> 초기 CEX 풀의 양에 따라, 주사를 3 ~ 4 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 280 나노 미터 (타우 1 mg을 140 ml의 MAU *에 대응)의 크로마토 그램의 피크 면적을 이용하여 정제 된 타우 단백질의 양을 계산한다. 주 : 280 nm에서의 타우 단백질의 흡광 계수가 7,550 M -1 cm-1이다. 타우는 TRP의 잔류 물을 포함하지 않습니다. </li><li> 수영장은 모든 타우 분수. </li><li> Aliquo타우의 1 ~ 5 밀리그램의 등가를 포함하는 튜브에 샘플을 t. 용액의 부피는 상기 튜브 (50 ㎖의 튜브 용액, 예를 들어 5 ㎖)의 체적에 비해 작게되도록 이들 튜브를 선택한다. </li><li> 바늘을 사용하여 튜브를 뚜껑의 구멍을 펀치. -80 ° C에서 타우 샘플을 고정. </li><li> 동결 건조 타우 샘플. 동결 건조 된 타우 단백질이 장기간 동안 -20 ℃에서 유지 될 수있다. </li></ol> 15 N-타우 3. 체외 인산화 <ol><li> 500 ㎕의 인산화 버퍼 (50 mM의 헤 페스을 · KOH, pH가 8.0, 12.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA, 50 mM의 염화나트륨)의 동결 건조 된 타우 5 mg을 녹이고. </li><li> 0.5 M 스톡 2.5 mM의 ATP (100 mM의 스톡 용액을 25 μL가 -20 ℃로 유지), 1 mM의 DTT (1 M 스톡 용액을 1 μL를 -20 ℃로 유지), 1mM의 EGTA 추가 (2 μL 용액), 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1 ml의 인산화 버퍼 한 태블릿을 용해시킨 40X 재고 25 μL) 및 한81; M 그의-ERK2 활성화 (보존 버퍼 250 μL를 10 -80 ° C에 보관 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 1mM의 DTT, 5 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨 및 10 % 글리세롤)의 총 샘플 부피 1 ml의. 참고 : 활성화 된 그의-ERK2는 MEK 키나아제와 인산화에 의해 사내 5,8 제조 할 수있다. </li><li> 37 ° C에서 3 시간을 품어. </li><li> ERK 키나아제를 실활 15 분 동안 75 ° C에서 샘플을 가열한다. </li><li> 15 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기. 수집하고 뜨는을 유지한다. </li><li> 1 mL의 샘플에 적합한 3.45 mL의 G25 수지 충전 층 (1.3 × 2.6 cm)의 컬럼을 사용하여 50mM의 중탄산 암모늄으로 단백질 샘플을 탈염. </li><li> 무결성 및 효율적인 인산화 (그림 4)을 모두 확인하는 단백질 시료의 2.5 μL와 12 % SDS-PAGE (16)를 실행합니다. </li><li> 인산화 타우 샘플을 동결 건조. -20 ° C에서 분말을 저장합니다. </li></ol> NMR 스펙트럼 4. 취득 (FIgure 5) <ol><li> 동결 건조 15 N의 4 ㎎, 400 μL의 NMR 버퍼 (13) C ERK 인산화 타우 (50 mM의 NAPI 또는 트리스 (D11) .Cl 중수 소화의 50 mM, pH를 6.5, 30 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 EDTA 1 mM의 DTT)을 용해. </li><li> 내부 NMR 신호 기준으로 NMR 분광계의 필드 잠금 및 1 mM의 TMSP (3- (트리메틸 실릴) 프로피온산-2,2,3,3- D 사 산 나트륨 염))에 대해 5 % D 2 O를 추가합니다. 완전한 단백질 분해 효소 억제제 칵테일의 40 배 원액의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 긴 바늘 또는 파스퇴르 피펫 전자 주사기를 사용하여 5mm의 NMR 튜브에 시료를 옮긴다. 플런저를 사용하여 NMR 튜브를 닫습니다. 플런저의 움직임에 의해 플런저와 액체 사이에 갇혀있는 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 스피너의 NMR 튜브를 놓습니다. 시료 용액의 대부분이 NMR 코일 내부에있을 것 같은 것을 사용하는 NMR 프로브 헤드에 대한 적절한 게이지와 회 전자의 수직 위치를 조정합니다. </li><li> 공기 흐름을 시작 리프트 난을 클릭N 자석 제어계 창. 조심스럽게 자석 구멍의 상단에있는 공기 흐름 튜브와 스피너를 배치합니다. 공기의 흐름을 중지 (리프트를 클릭) 튜브 자석의 프로브 헤드 내부 제자리에 내려 보자. </li><li> 25 ° C (298 K)로 설정 온도. </li><li> 동력 전달을 최적화하기 위해 반자동 튜닝 및 프로브 헤드의 정합을 수행한다. 명령 행에 ATMM 입력합니다. </li><li> 중수소 채널 상에 기록 된 샘플의 D 2 O 신호를 이용하여 주파수 분석 장치 잠금. 자석 제어계 창 잠금을 클릭. </li><li> 샘플의 위치에서의 자기장의 균일 성을 최적화 shimming 절차를 시작한다. 심 창을 열려면 명령 행에서 GUI를 topshim 입력합니다. 심 창에서 시작을 클릭합니다. 심가 (이하 2 Hz에서 좋은) 최적인지 확인하기 위해 잔류 B0 표준 편차 값을 확인하십시오. </li><li> 양성자의 P1 매개 변수 (길이 보정양성자 스핀의 90 ° 회전을 얻기 위해 필요한 마이크로 초에서 고주파 펄스). 물 양자의 1D 스펙트럼 (그림 6)를 사용하여 360 ° 펄스에 대한 목표로하고 있습니다. </li><li> (도 6) 1D 스펙트럼 양성자 물 주파수 (Hz 단위)을 O1 매개 변수를 설정하여 주파수 오프셋을 조정한다. </li><li> 샘플 (그림 7)로부터의 신호를 확인하기 위해 (예를 zggpw5를 들어, 물 신호 억제를위한 워터 게이트 순서와 펄스 시퀀스) 1 차원 양성자 스펙트럼의 획득을 시작합니다. 상대 단백질 농도를 검사의 수를 적응. 획득을 시작하려면 명령 줄에서 ZG 입력합니다. </li><li> 2 차원의 인수에 대한 추가 매개 변수를 설정 [1 H, 15 N] HSQC 스펙트럼 (펄스 시퀀스 hsqcetfpf3gpsi, 8-9도). <ol><li> 15 N의 경우, 13 C는 15 N 간접 진화 중 (13) C를 분리, 샘플을 표시. </li><li&gt; 포인트의 수 및 1 H (F2) 15 N (F1) 치수의 스펙트럼 폭 (PPM)를 설정한다. 주 : 점당 Hz의 유사한 번호를 유지하는 분광계 필드에 수집 된 데이터 포인트의 수를 적응 시간 디커플링 제한하기 : 1 H 차원에서는 900 MHz와 600 MHz에서 2048 포인트에서 3072 포인트를 사용한다. </li><li> 펄스 시퀀스의 추가 파라미터를 최적화 지연 펄스 길이에 대응하는 주파수, 전력 레벨 오프셋. 명령 행에서 ased 유형 실험에 대한 관련된 모든 매개 변수를 표시합니다. </li></ol></li><li> 3 차원의 획득을위한 설정 매개 변수 [1 H 15 N, 13 C] HNCACB 스펙트럼 (펄스 시퀀스 hncacbgpwg3d, 그림 10A) 600 MHz에서. </li><li> 600 MHz에서 3 차원 [1 H 15 N, 15 N] HNCANNH 실험 (펄스 시퀀스 hncannhgpwg3d)에 대한 매개 변수를 설정합니다. 1 H에서 2048 포인트의 수를 설정하고, (64)두 15 N 차원에서 128 점. , (25), 만 (ppm으로) 당 25 부 4.7, 119, 1 H 119 ppm으로, 15 N 15 N 차원을 중심으로 14으로 스펙트럼 폭을 정의합니다. (16) 검사와 취득 기간 1 일 22 시간이다. </li></ol> 인산화 사이트 5. 확인 <ol><li> 수집 및 처리 NMR 소프트웨어를 이용하여 처리 스펙트럼. <ol><li> 데이터 (도 7)의 푸리에 변환을 수행한다. 1 차원 스펙트럼에 대한 형식 피트, 2 차원 스펙트럼 xfb 또는 명령 행에서, 3 차원 스펙트럼 ft3d. </li><li> 단계 참조 모든 스펙트럼 (그림 7C) 대화 형 창을 사용하여. </li></ol></li><li> 2 차원 HSQC 잠재적 인산화 빼앗아과의 Thr 잔기 (그림 9, 빨간색 상자)에 해당하는 관심의 공명을 확인합니다. </li><li> 추출면에서 (즉, 2D 1 H-13 C 스펙트럼)2 차원의 관심 공명의 (15) N 화학 변화를 이용하여 3 차원 (1) H-15 N- (13) C 스펙트럼. 시각화 할 수있는면 (W1-W3)에 해당하는 15 N 주파수 (그림 10B)을 선택하는 차원이 (W2)의 커서를 사용합니다. </li><li> 각각에 대한 &#39;CA&#39;의 공진 주파수와 &#39;난&#39;의 &#39;CB&#39;13 C 핵와 &#39;I-1&#39;잔류 물 (다음 i 잔류에 비해 신호의 약한 세트)을 선택 [1 H, 15 N] 공명 포인터 모드 메뉴에서 공진을 클릭하여 HNCACB 3D 스펙트럼에서 관심 피크리스트 파일의 화학 쉬프트 값을 추가하기 위해, 추가의 피크를 찾기 /. <ol><li> 공지 CA의 값과 pSer pThr 17 CB 화학 시프트에 피크리스트의 화학적 이동과 비교하여 상기 잔기 I 유형 또는 pSer pThr 식별. </li><li> 추가적인 특성이 PPM 시프트 O로 I + 1 위치에서 프로 잔기의 존재를 확인하여 CA 케미컬 시프트 값 18 F. </li><li> 제 i-1 위치에서의 잔기의 특성을 식별하는 타우의 아미노산 잔기 19에 대한 예측 된 화학적 이동의 테이블에 I-1 잔류에 대응하는 CA와 CB 공명의 화학적 시프트 값을 비교한다. </li></ol></li><li> HNCANNH 스펙트럼에 대한 관심의 각 [1 H, 15 N] 공명의 공명 (가) &#39;난&#39;의 15 N 핵의 주파수와 &#39;I-1&#39;잔류를 선택합니다. </li><li> 23 - 타우 단백질 (20)의 화학적 이동 할당에 15 N의 화학 시프트 값을 비교한다. </li><li> 시퀀스의 특정 할당을 정의하는 타우 시퀀스 식별 디 펩티드를 비교한다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 효소 변성 타우 샘플의 특성을 NMR 분광 분석을 사용 하였다. 재조합 발현과 전장 사람 타우 단백질 여기 기재된 정제 마찬가지로 돌연변이 또는 타우 타우 도메인을 생성하는데 사용될 수있다. 동위 원소 적으로 농축 된 단백질의 재조합 발현을 필요로, NMR 분광법 필요하다. 인산화 사이트의 식별 공명 할당 및 15 N, 13 C 이중 표지 단백질을 필요로한다. 동위 원소의 가격을 ?...

21 세기 의료의 주요 과제 중 하나는 알츠하이머 병 (AD)와 같은 신경 퇴행성 질환이다. 타우 미세 소관 (MT)의 형성을 자극 미세 소관 - 연관된 단백질이다. 타우 동등하게, 여러 가지 신경 퇴행성 질환에서 가장 잘 알려진이 AD로되어있는 소위 퇴행성 신경을 참여하고있다. 이러한 질환에서, 타우 쌍 나선형 필라멘트 (PHFs)에서 자기 집합체와는 같은 인산화 1과 번역 후 수정 (PTMS)에 의해 많은 잔류에 수정 발견된다. 타우 단백질의 인산화는 MT 안정화 및 AD 신경 세포의 특징 기능의 병리학 적 손실의 생리 기능을 모두 조절에 관여한다. 질병 뉴런 PHFs에 통합 될 때 더욱이, 타우 단백질은 언제나 2 hyperphosphorylated된다. 2 ~ 3 인산염 그룹을 포함하는 일반 타우는 달리, PHFs에서 hyperphosphorylated 타우 5-9 phosphat을 포함전자 그룹 3. 타우의 과인산 일부 사이트에서와 인산화의 병적 인 사이트라고 추가 사이트의 인산화에 화학 양론의 증가에 모두 해당한다. 그러나, 중복 레벨 4의 양적 차이에도 불구하고, AD 및 인산화의 정상 성인의 패턴 사이에 존재합니다. 어떻게 특정 인산화 이벤트에 영향을 미치는 기능과 타우의 기능 부전은 크게 알려지지 않은 남아있다. 우리는 분자 수준에서 PTMS에 의해 타우 규제를 해독하는 것을 목표로하고 있습니다. 타우의 분자 측면의 이해를 깊게하기 위해, 우리는 기술적 인 문제를 해결해야합니다. 첫째, 타우 솔루션에 고립 본질적으로 무질서 단백질 (IDP)입니다. 이러한 단백질은 생리 학적 조건에서 잘 정의 된 세 가지 차원 구조를 결여하고 그 기능 (들) 및 구조적 특성을 연구하기 위해 특정 생물 물리학 적 방법이 필요합니다. 타우는 실향민의 성장 클래스에 대한 패러다임, 자주와 관련된 발견이러한 신경 퇴행성 질환과 같은 병리, 따라서 그 기능의 기초가되는 분자 파라미터를 이해하기 위해 관심을 증가시킨다. 둘째, 타우 인산화 특성은 최장 441 아미노산 타우 이성체의 순서에 따라 80 전위 인산화 부위와 분석 도전이다. 항체의 다수의 타우 인산화 에피토프에 대해 개발되어 뉴런 또는 뇌 조직 병리학 타우 검출을 위해 사용된다. 인산화 이벤트는 프롤린이 풍부한 지역 내 가까이에 그들의 대부분, 프롤린 지시 키나제의 대상이 적어도 20 사이트에 일어날 수있다. 정 성적 (어떤 사이트?) 및 (화학량 무엇?) 정량적 특성은 가장 최근에 MS 기술 (5)에 의해 곤란하다. NMR 스펙트럼은 매우 이형태 앙상블 구성 동적 시스템이다 무질서 단백질을 연구하는데 사용될 수있다. 고해상도 NMR 분광법 어플리이었다에드는 타우 단백질의 양 구조와 기능을 조사합니다. 8 - 또한, 타우의 인산화 프로파일의 복잡도 인산화 부위 (6)의 식별을위한 NMR을 이용하여 분자 도구 새로운 분석법의 개발을 이끌었다. 분석 방법으로 NMR은 인산 결합의 정도의 글로벌 방식으로 타우 인산화 사이트의 식별, 하나의 실험에서 모든 단일 사이트 수정의 시각화 및 정량화 수 있습니다. 타우 인산화 과정은 문헌에 풍부하지만, 이들 대부분은 인산화 프로필 불확실성의 큰 정도 따라서 개별 인산화 이벤트의 실제 영향을 떠나는 항체 수행 되었기 때문에이 점은 중요하다. PKA, 글리코겐 신타 제 키나제 3β (GSK3β), 사이클린 의존 키나제 2 / 사이클린 A (CDK2 / CycA에 의해서), 사이클린 의존 키나제 5 (CDK5) / P25의 행위를 포함하는 재조합 키나제향해 타우 인산화 활성을 나타내는 ivator 단백질 세포 외 신호 조절 키나아제 2 (ERK2) 및 미세 소관 연관 조절 키나아제 (MARK)는, 활성 형태로 제조 될 수있다. 또한, 잘 특성화 인산화 패턴 특정 타우 단백질 이소 형을 생성 할 수 타우 돌연변이 타우의 인산화 코드를 해독하는데 사용된다. 8 - NMR 분광법이어서 효소 변성 타우 샘플 6을 특성화하기 위해 사용된다. 타우 인산화 시험관은 글루탐산 (Glu가) 잔기로 선택 빼앗아 /의 Thr 돌연변이 등에 의해 의사 인산화보다 더 도전이지만,이 방식은 장점을 갖는다. 실제로, 인산화도 구조에 미치는 영향도 상호 작용 매개 변수는 항상 글루타민산 산으로 모방 할 수있다. 예 글루 돌연변이 9 재현되지 포스 포세린 (202) (pSer202)의 주위에 관찰 턴 모티브 / phosphothreonine 205 (pThr205)입니다. 체외 인산화 타우의 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 12 - ERK2은 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 / ERK 키나제 (MEK) (10)에 의해 인산화에 의해 활성화된다. 개질 된, 동위 원소로 표지 된 타우 단백질의 제조뿐만 아니라, PTMS의 식별을 위해 사용 된 NMR 전략을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>pET15B recombinant T7 expression plasmid</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>BL21(DE3) transformation competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; bacteria</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Keep at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Autoclaved LB Broth, Lennox&amp;nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Bacterial Growth Medium</td></tr><tr><td>MEM vitamin complements 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Bacterial Growth Medium Supplement</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C-ISOGRO complete medium powder</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Bacterial Growth Medium Supplement</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td>Isotope</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>Isotope</td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Homogenizer (EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>Lysis is realized at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Unstained Protein MW Marker</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>Active human MEK1 kinase, GST Tagged</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>Keep at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AKT&amp;Auml; Pure chromatography system</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Cation exchange chromatography columns</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalting</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Protein Desalting column</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Protein Desalting column</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Deuterated NMR buffer</td></tr><tr><td>5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (set of 5 inner &amp;amp; outerpipe)&amp;nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi Tubes</td></tr><tr><td>eVol kit-electronic syringe starter kit</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipetting</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR spectrometer for data acquisition</td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR spectrometer for data acquisition</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Acquisition and Processing software for NMR experiments</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)</td><td></td><td>NMR data Analysis software</td></tr></tbody></table>

nuclear magnetic resonance spectroscopy for the identification of multiple phosphorylations of intrinsically disordered proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

도 3a는 용출 구배 중 관찰 된 280 nm에서 큰 흡수 피크를 나타낸다. 크로마토 그램 상기 아크릴 아마이드 겔에서 볼 때이 피크는 정제 된 타우 단백질에 해당한다. 도 3b는 단백질의 탈염이 효율적으로 보장, 280 nm의 전도도의 피크에서 잘 분리 흡수 피크를 보여줍니다. 도 4는 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 여러 단백질 인산화 (16)의 특성을 관찰 겔 - 시프트 (비교 레인 2 ...

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Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

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Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

연구

생화학

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the propagation of neurodegenerative disorders. Such assemblies consist in multiple protein subunits organized in a non-covalent way to form large macromolecular objects that can execute a variety of cellular functions or cause detrimental consequences. Atomic insights into the assembly mechanisms and the functioning of those macromolecular assemblies remain often scarce since their inherent insolubility and non-crystallinity often drastically reduces the quality of the data obtained from most techniques used in structural biology, such as X-ray crystallography and solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We here present magic-angle spinning solid-state NMR spectroscopy (SSNMR) as a powerful method to investigate structures of macromolecular assemblies at atomic resolution. SSNMR can reveal atomic details on the assembled complex without size and solubility limitations. The protocol presented here describes the essential steps from the production of 13C/15N isotope-labeled macromolecular protein assemblies to the acquisition of standard SSNMR spectra and their analysis and interpretation. As an example, we show the pipeline of a SSNMR structural analysis of a filamentous protein assembly.

Structures of supramolecular protein assemblies at atomic resolution are of high relevance because of their crucial roles in a variety of biological phenomena. Herein, we present a protocol to perform high-resolution structural studies on insoluble and non-crystalline macromolecular protein assemblies by magic-angle spinning solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (MAS SSNMR).

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human proteome. The highly flexible nature of these sequences allows them to form weak, long-range, and transient interactions with diverse biomolecular partners. Specific yet low-affinity interactions promote promiscuous binding and enable a single intrinsically disordered segment to interact with a multitude of target sites. Because of the transient nature of these interactions, they can be difficult to characterize by structural biology methods that rely on proteins to form a single, predominant conformation. Paramagnetic relaxation enhancement NMR is a useful tool for identifying and defining the structural underpinning of weak and transient interactions. A detailed protocol for using paramagnetic relaxation enhancement to characterize the lowly-populated encounter complexes that form between intrinsically disordered proteins and their protein, nucleic acid, or other biomolecular partners is described.

A protocol for the application of paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy to detect weak and transient inter- and intra-molecular interactions in intrinsically disordered proteins is presented.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

글라이칸-단백질 상호 작용 분석을 위한 고급 NMR 기술

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and their biological consequences are intimately related to the three-dimensional structures of both partners, as well as to their dynamic features and their presentation on the corresponding cell compartments. NMR techniques are unique to disentangle these characteristics and, indeed, diverse NMR-based methodologies have been developed and applied to monitor the binding events of glycans with their associate receptors. This protocol outlines the procedures to acquire, process and analyze two of the most powerful NMR methodologies employed in the NMR-glycobiology field, 1H-Saturation transfer difference (STD) and 1H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titration experiments, which complementarily offer information from the glycan and protein perspective, respectively. Indeed, when combined they offer a powerful toolkit for elucidating both the structural and dynamic aspects of molecular recognition processes. This comprehensive approach enhances our understanding of glycan-protein interactions and contributes to advancing research in the chemical glycobiology field.

저자 스포트라이트: Unveiling the Structural and Dynamic Aspects of Glycan Molecular Recognition (글라이칸 분자 인식의 구조적 및 동적 측면 공개)

Here, we present a protocol detailing the acquisition, processing, and analysis of a series of NMR experiments aimed at characterizing protein-glycan interactions in solution. Most common ligand-based and protein-based methodologies are outlined, which undoubtedly contribute to the fields of structural glycobiology and molecular recognition studies.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

화학

<meta charset="utf8"></head><body>단백질 역학 연구에서 NMR 15N 이완 및 hetNOE 실험을 위한 프로토콜

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide groups of the protein backbone or the methyl groups in side chains are used as reporters of structural dynamics in proteins. A structural dynamics study of the protein backbone of globular proteins on 15N labeled and fully protonated samples usually works well for proteins with a molecular weight of up to 50 kDa. When side chain deuteration in combination with transverse relaxation optimized spectroscopy (TROSY) is applied, this limit can be extended up to 200 kDa for globular proteins and up to 1 MDa when the focus is on the side chains. When intrinsically disordered proteins (IDPs) or proteins with intrinsically disordered regions (IDRs) are investigated, these weight limitations do not apply but can go well beyond. The reason is that IDPs or IDRs, characterized by high internal flexibility, are frequently dynamically decoupled. Various NMR methods offer atomic-resolution insights into structural protein dynamics across a wide range of time scales, from picoseconds up to hours. Standard 15N relaxation measurements overview a protein&#39;s internal flexibility and characterize the protein backbone dynamics experienced on the fast pico- to nanosecond timescale. This article presents a hands-on protocol for setting up and recording NMR 15N R1, R2, and heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments. We show exemplary data and explain how to interpret them simply qualitatively before any more sophisticated analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: NMR 이완 실험을 통한 본질적으로 정렬되지 않은 단백질 역학 탐색

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can characterize structural protein dynamics in a residue-specific manner. We provide a hands-on protocol for recording NMR 15N R1 and R2 relaxation and {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments, sensitive to the picoseconds to nanoseconds timescale.

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

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된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR ¹⁵N 이완 실험