Name: method to visualize and analyze membrane interacting proteins by transmission electron microscopy
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
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저자는 그들의 지원을 위해 스웨덴 연구위원회, 스톡홀름 카운티위원회, 및 KI 기금 감사합니다. MSP의 발현 및 정제는 카롤린스카 연구소 / SciLifeLab 단백질 과학 핵심 시설에 (http://PSF.ki.se)을 수행 하였다. 저자는 또한 기술 전문 지식을 공유하고 자신의 적시 지원을 위해 박사 파시 Purhonen 박사 마틸다 베르그에게 감사의 말씀을 전합니다.

Nanodiscs 1. 준비 <ol><li> 식 및 멤브레인 비계 단백질 (8)의 정화 (35) <ol><li> 대장균 BL21에서 그의-태그 MSP1E3D1 (DE3) 플라스크에 T1R pRARE2의 피로를 표현한다. 37 ° C에서 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 LB 배지 50 mL의 하룻밤 스타터 문화를 준비합니다. 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 훌륭한 국물 매체의이 L에서 하룻밤 스타터 문화를 희석. </li><li> 약 3 18 ° C에서 3 시간 동안 0.5 mM의 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 단백질 발현을 유도 도달 600nm의 (OD 600)에서의 광학 밀도까지 37 ℃에서 세포를 성장한다. </li><li> 용해 완충액 (100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤 100 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)을 준비한다. 사용 직전에 1 mM의 TCEP를 추가합니다. </li><li> 18 ° C에서 유도 3 시간 후, 4500 XG에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확4 ° C를. , 상층 액을 버린다 수확 된 세포를 무게, 그리고 세포의 g 당 2 mL의 용해의 버퍼의 비율로 용해 버퍼에서 그들을 다시는 일시 중지합니다. </li><li> 를 Lyse 펄스 초음파 (반복 속도 : 4의 ON, 4의 OFF)에 의한 세포의 80 % 진폭에서 3 분. </li><li> 49,000 XG, 4 ° C에서 20 분 동안 해물을 원심 분리기. 이 원심에서 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 바람직하게는 4 ℃에서 보관하는 자동화 액체 크로마토 그래피 시스템에 연결된 5 ㎖의 니켈로 상등액 + 킬레이트 컬럼을 주입. </li><li> 그분의-태그 MSP를 제외한 모든 단백질을 제거하기 위해 아래 - 3 용출 단계 (단계 1.1.9)하기 전에 버퍼 1 열을 씻는다. 정제 공정을 수행하기 위해 280 nm에서의 단백질 함량을 모니터; 280 nm에서 UV 기록은 각 세척 후 다시 기본에 가야한다. <ol><li> 40 mM의 트리스 -HCl, 300mM NaCl, 10 mM의 이미 다졸, 1 % 트리톤, pH가 8.0 : 1 세척 완충액으로 세척 하였다. </li><li> 40 mM 트리스 - 염산, 300 MM : 세척 버퍼 (2)로 세척염화나트륨, 20 mM의 이미 다졸, 50 mM의 나트륨 콜레이트, pH가 8.0. </li><li> 40 mM 트리스 - 염산, 300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 이미 다졸, pH가 8.0 : 세척 버퍼 3 씻으십시오. </li></ol></li><li> 40 mM의 트리스 -HCl, 300mM NaCl, 및 500 mM의 이미 다졸, pH를 8.0으로 MSP를 용출. </li><li> 겔 여과 (8), (35)에 의해 표준 버퍼 (0.5 mM의 EDTA, 100 mM의 NaCl을 20 mM 트리스 - 염산, pH를 7.5) MSP하기 위해 버퍼를 변경; 배치 당 수율은 약 7 mg을 L해야한다 -1. </li></ol></li><li> 인지질 원액의 제조 <ol><li> 유리 비이커를 25 ㎎ / ㎖의 농도로 클로로포름에 용해 된 1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (POPC) 305 μL를 첨가하고 부드러운 질소 스트림으로 퍼징하여 클로로포름을 증발 . 진공 데시 케이 터에서 지질 밤새 건조. 주 :이 단계는 유리 비이커의 바닥에서 지질의 박막을 남긴다 지질로부터 용매를 제거한다.</li><li> 용액이 투명해질 때까지 튜브를 볼 텍싱하여 100 mM의 나트륨 콜레이트를 함유 MSP 표준 완충액 200 μL의 지질 케이크를 재현 탁; 이것은 50 mm의 POPC 농도를 갖는 용액을 제공한다. 주 : 2 (지질 : 세제) (8) 일반적으로,이 때 세제로 지질의 몰비는 1이어야한다. 이 지질 세제 혼합은 약 2 달 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 세제 제거를위한 소수성 구슬의 준비 <ol><li> 50 ㎖의 튜브에 비즈 5g (건조 중량)을 놓습니다. </li><li> 초순수 물 40 mL로 한 후 100 % 메탄올 30 ㎖로 세척하고 비드. </li><li> 10 mL의 MSP의 표준 버퍼로 구슬을 씻으십시오. 마지막으로, 4 ° C에서 MSP 표준 버퍼의 15 mL로 구슬을 저장합니다. </li></ol></li><li> 나노 디스크의 재구성 <ol><li> 의 microfuge 튜브에 MSP1E3D1 (0.124 mM)을 190 μL를 분배 및 인지질 원액 (50 mM의 P의 61.5 μL를 추가같은 튜브에 OPC). 1 시간 동안 젖은 얼음에 재구성 혼합물을 품어. 주 : 130 (MSP1E3D1 : POPC)이 (1)의 몰비가 동일하다. </li><li> 자기 조립 공정을 시작하도록 재구성 혼합물을 1 ㎖ 당 비드 0.5 g의 농도로 소수성 비드를 추가한다. 4 ℃에서 16 시간 동안 회전 배양기에서 품어. </li><li> 배양 후, 13,000 XG에 10 분, 4 ° C를위한 원심 분리기 침전물 및 집계를 제거합니다. 펠렛을 버리고 상층 액을 저장합니다. </li><li> 280 nm에서의 흡광도가 안정 될 때까지 MSP 표준 완충액 (자동화 액체 크로마토 그래피 시스템에 장착) 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼을 평형화. 컬럼에 상층 액을 주입 피크 분수를 수집합니다. </li><li> 280 nm에서의 피크 분획 nanodiscs의 농도를 측정한다. 나노 디스크 농도 계산 MSP1E3D1 (ε = 29,910cm -1 M-1)의 몰 흡광 계수를 사용한다. 참고 :나노 디스크 당 지질의 수는 방사성 표지 된 지질 및 인산 분석 (4)의 조합에 의해 또는 인산 형 분석에 의해 측정 할 수있다. </li></ol></li></ol> Monotopic 단백질 2. 5- 리폭 시게나 제 (35) <ol><li> 밤새 스타터 문화를 준비합니다. 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린 LB 배지 50 ㎖를 보완. 5- 리폭 시게나 제 유전자 (ALOX5)의 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21 (DE3)를 배지에 접종. 42 mM의 나트륨 2 HPO 4, 24 mM의 KH 2 PO 4, 9 mM의 염화나트륨, 19 mM의 NH 4 CL, 1mM의 황산, 0.1 mM의 CaCl2를, 0.2 % D- 글루코오스, 0.1를 함유하는 발현 배지에서 밤새 스타터 배양 희석 %, 5 μM 다음날에 FeSO4, 100 μg의 / ㎖ 암피실린. 600 인 OD ~ 0.5에서 25 ° C까지 세포를 성장. 20 ° C에서 16 시간 35 0.2 mM의 IPTG로 단백질 발현을 유도한다. </li><li> 7000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확하고 상층 액을 버린다. 프로테아제 억제제 및 0.5을 포함하는 (1 mM의 TCEP 100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤 100 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 용해 완충액에서 수확 된 세포 및 재현 탁 수확 된 세포를 포함하는 상기 튜브의 하단에있는 펠릿 무게 ㎎ / ㎖ g 당 세포 용해 완충 용액 2의 비율로 35 리소자임. </li><li> 80 % 진폭에서 5 × 15 초 동안 초음파로를 Lyse는 세포. 7000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 용액 (35)에 단백질을 침전 포화도 60 % - 30 황산 암모늄 침전 법을 수행한다. 16,000 XG에 15 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 주 : 5LO 펠릿 급속 냉동 최대 6 개월 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 40,000 XG에 15 분, 4 °의 C에 대한 용해 버퍼와 원심 분리기 20 mL를 펠렛을 재현 탁. </li><li> 에 뜨는을 품어<html> 30 분 동안 4 ° C에서 ATP 아가로 오스 열입니다. 0.5 M NaCl을 함유하는 용해 버퍼 중 하나 열 볼륨을 한 번 열을 씻으십시오. 10 μM 다음날에 FeSO4 및 20 μg의 / ㎖의 카탈라제를 함유하는 용해 완충액에 20 mM의 ATP로 5LO을 용출. ATP에 (35)을 제거하기 위해 겔 여과 크로마토 그래피를 수행한다. 주 : 5LO이 불안정 및 정제 후 즉시 사용하여야한다. 그렇지 않으면, 황산 암모늄 침전시키는 단계 (단계 2.1.3 후 메모 참조)에서 중단하는 것이 좋습니다. </li></ol> 나노 디스크 - 단백질 복합체의 3 준비 <ol><li> 복잡한 100 μL의 총 부피를 준비한다. MSP 표준 버퍼의 1 ㎜ 칼슘 2 + 현재와 0.8 μM ND 0.8 μM 5LO 믹스 (20 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 100 mM의 NaCl을 0.5 mM의 EDTA, 1.5 mM의 염화칼슘 2)과는 10 분 동안 품어 얼음 에다가요. 참고 : 샘플 1 개월까지 C ~ 35 ° 4에 저장할 수 있습니다. </li></ol>샘플의 ove_title &quot;&gt; 4. 분석 <ol><li> 겔 전기 영동 <ol><li> 비 변성 전기 영동 <ol><li> 5 로딩 버퍼의 μL (50 mM의 BisTris, 6 N 염산, 50 mM의 NaCl을, 10 % (w / v)의 글리세롤, 0.001 % 폰소 s, 산도 7.2) 49 시료의 15 μL를 혼합하고 4로드 - 16 % 비스 - 트리스 젤 전기 영동을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 광 음극 버퍼 음극 탱크 채우기 (50 mM의 트리 신, 산도 6.8, 50 mM의 비스 트리스 및 0.002 % 쿠마 G-250) 및 버퍼 (50 mM의 비스 트리스 50 mM의 트리 신, 산도 6.8)를 실행하는 양극 탱크. 150 V.에 일정한 전압을 이용하여 분리를 시작 </li><li> 쿠마 프론트 겔의 끝에 도달 할 때 전기 영동 분리를 중지. </li><li> 표준 쿠마 푸른 프로토콜 젤을 얼룩. </li></ol></li><li> 변성 전기 영동 <ol><li> ((SDS를 함유 로딩 완충액 10 μL와 0.05 %의 시료 40 μL를 혼합 / V) 브로 모 페놀 블루 w 0.2 M 트리스 -HCl,pH가 6.8; 20 % (v / v)의 글리세롤; 10 % (W / V) SDS; 전기 영동을 수행하기 위해 20 % 트리스 글리신 젤 - 10 mM의 2- 머 캅토 에탄올)과는 4로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행하는 캐소드와 애노드 탱크를 채우기 (25 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 200 mM의 글리신 및 0.1 % (W / V) SDS). 150 V.에 일정한 전압을 이용하여 분리를 시작 </li><li> 로딩 염료 프론트 겔의 끝에 도달 할 때 전기 영동 분리를 중지. </li><li> 표준 쿠마 푸른 프로토콜 젤을 얼룩. </li></ol></li></ol></li><li> NAPT 용액의 제조 <ol><li> (w / v)의 산성 용액을 2 %를주고, 실온에서 교반하여 물 50 mL에 phosphotungstate 나트륨 1 g을 녹인다. </li><li> 1 M NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다. 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 입자를 제거한다. 실온 또는 4 ℃에서 용액을 저장한다. </li></ol></li><li> TEM 분석을위한 시료의 준비 <ol><li> 글로우 방전 탄소 코팅 된 구리 그리드 (430mA에서 20 초 00 메쉬) 시료의 흡착 전에 친수성 그리드 렌더링합니다. 그리드에서 샘플합니다 (nanodiscs에 대해 0.8 μM)의 3.5 μL를 놓고 30 초 동안 품어. 참고 : 적용된 볼륨이 시료 농도에 따라 2.5 내지 5 μL 다를 수 있습니다. 1 μM - nanodiscs에 적합한 농도 범위는 0.5입니다. </li><li> 여과지를 사용하여 잉여의 용액을시킨다. </li><li> 즉시 30 초 동안 2 %의 NAPT 방울 그리드 얼룩. 초과 솔루션을 가릴 공기 건조에 그리드를 둡니다. </li><li> TEM에 의한 격자를 평가합니다. 120-200 keV의 가속 전압을 갖는 현미경 겹침의 정도를 추정하는 데 충분하다. 참고 : 본 프로토콜은, 교정 된 투과 전자 현미경을 사용 하였다 200 keV의 전계 방출 총 장비. </li><li> TEM에 이미지를 기록합니다. 긴 스택을 보여주는 이미지의 경우, 추가로 처리하지 않는다; 이미지는 몇 가지를 포함 할 수 있습니다 외부 단백질 nanodiscs의 복잡한을 보여짧은 스택하지만, 대부분의 입자는 복잡한에 있습니다. 녹음 여러 이미지 공정 급 평균 및 저해상도의 복합체의 3 차원 모델을 획득하기 위해 표준 방법에 의해이. 주 : 네가티브 염색 데이터의 수집을 위해, 격자는 적어도 세 개의 다른 날에 이루어졌다. 부정적인 얼룩이 적용되기 전에 매일 신선한 샘플 배양 (단계 3.1에서와 같이)가 만들어졌다. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

의학 연구에 많은 관심이 지질 상호 작용의 다양한 관련된 진성 또는 외부 중 막 단백질에 초점을 맞추고있다. 지질 상호 작용하는 단백질과 작업 중 하나가, 세제 등의 지질에 대체를 선택 1 amphipols, 또는 작은 단백질 2, 또는 수용성 활성 단백질을 유지하는 막 대용품을 찾는 포함되어 있습니다. 리포 막 대체는 리포좀과 nanodiscs (ND) 3, 4를 포함한다. Nanodiscs 당연히 혈액에서 발생하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 단백질의 일부 ​​ApoA-1 엔지니어링 개발 가까운 천연 막 플랫폼이다. ApoA-1은 짧은 양친 매성 α-나선의 243 잔류 긴 체인 및 지질없는 수용성 형태가 있습니다. 시험관 내에서의 지질의 존재 하에서, 단백질 ApoA-1 개의 카피 자발적 히드을 둘러싸 재정렬 때지질 이중층 패치 5 ophobic 아실 사슬 부분. ApoA-1의 엔지니어링 버전은 일반적으로 멤브레인 비계 단백질 (MSP)라고하고, 증가는 플라스미드이나 정제 단백질과 같은 시판되고있다. 6 길거나 짧은 7 막 비계 단백질 ApoA-1 결과에 반복 또는 α-나선의 삭제. 차례로 이로써 7 8 내지 17 6nm의 주위 디스크를 형성 할 수있다. nanodiscs 3, 9 응용 프로그램의 다른 유형이있다. 가장 일반적으로 사용되는 애플리케이션이 이전 3 구 검토 일체 세포막 단백질 (8)의 안정화를위한 니어 - 네이티브 막 환경을 제공하는 것이다. 덜 탐구 이용의 연구 나노 멤브레인 표면을 제공하는 것이다말초 막 단백질 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 프로토콜의 제 1은 인지질 막 단백질 폴딩 이루어지는 nanodiscs의 제조 과정을 시각화한다. 샘플 준비는 대부분의 방법에서 병목 현상입니다. 방법 별 샘플은 특정 정보를 추가 할 수 있습니다,하지만 그들은 또한 결과의 비교를 어렵게 만든다. 샘플 복합있는 여러 가지 방법에 직접 사용할 수있는 경우에 따라서, 간단하다. nanodiscs의 사용과 장점은 리포좀 (예를 들어, 샘플을 직접 본 프로토콜에서와 같이, TEM 및 비 - 변성 겔 전기 영동에 모두 사용될 수 있음)에 비교하여 나노 디스크의 작은 크기이다. 18이다. 그러나, 리포좀 막에 포함 된 monotopic 막 단백질의 더 높은 해상도의 3D 구조는 우리가 아는까지로, 아직 게시되지 않았습니다. 금 나노 입자는 항체 또는 TEM (19)을 사용하여 리포솜 소낭 또는 결합 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 이 프로브는 매우 특정한 비록 그들이 막 결합 부위를 베일로 덮기하거나 유연한 부분과 관심 영역을 마스킹함으로써 막 - 결합 단백질을 방해 할 수있다. 골드 표지 또는 항체 복합체 단백질은 아마 겔에서 분석 할 수 있지만,이 실험의 비용을 증가시킬 것이다. 리포좀이 뛰어난 플랫폼 비록, 하나는 팝업이 확신 할 수 없다위험률은 리포좀 당 단백질의 특정 비율, nanodiscs (20)를 사용하여 탐색 할 수있는 기능이 있습니다. 리포좀에서, 보조 인자 및 기판 수용성 내부에 트랩 될 수있다. 막 용해 물질은 막 모방 체의 두 가지 유형에 대해 동일한 운명을 공유합니다. 이중층 영역 nanodiscs 작다 그럼에도 불구하고, 약물의 적은 양의 나노 디스크 막을 포화 요구된다. 원자 구조의 결정을 통해 이해 단백질의 기능 연구의 많은 분야에 대해 필수였다. 단백질 구조 결정하는 방법은 X 선 (21)을 포함한다; 핵 자기 공명 (NMR) 22, 23; 및 투과형 전자 현미경 (TEM) 저온에서 24 cryoEM. cryoEM에서 해상도가 최근 크게 주로 직접적인 전자 드의 사용으로 개선 된26, 25 tectors. 거대 분자는 거의 원시 상태에서 얇은, 유리체 얼음 27 군데 있습니다. 200 kDa의 - 그러나, 생체 분자의 낮은 대비로 인해, 그들 (100)의 크기의 범위가 검출하기 어려운된다. 적절한 크기의 샘플은 데이터를 수집 할 수 있고, 하나의 입자의 재구성 방법은 구조물 (28)을 얻기 위해 적용될 수있다. 그러나, TEM에 의한 단백질 구조의 측정은 다단계 과정이다. 그것은 일반적으로 부정적인 얼룩 TEM (29) phosphotungsten (PT) 30 우라늄 (31)과 같은 중금속을 사용하여 샘플 단 분산의 평가로 시작합니다. 음으로 염색 고분자의 저해상도 모델의 재구성은 일반적으로 이루어지고, 분자 구조 (29)에 대한 중요한 정보를 산출 할 수있다. 병행하여,cryoEM 시작할 수 있습니다 사용하여 데이터 수집. 인위 형성 오해를 방지하기 위해 네거티브 얼룩 TEM 데이터를 평가할 때주의를 기울여야한다. 한 특정의 인공물은 인지질의 PT 얼룩의 효과와 측면 (33)에서 본 동전의 스택을 닮은 긴 막대의 형성의 결과로, 32 리포솜. 이러한 &quot;ROULEAU&quot;또는 &quot;스택&quot;(이하 &quot;스택&quot;으로 표시됨) nanodiscs 35 이상 또한 34 HDL 초기에 관찰 하였다. 막의 적재 및 재 형성은 여러 가지 이유로 발생할 수 있습니다. 예를 들면, 암모늄 몰 리브 데이트 얼룩 36 TEM 영상으로 나타낸 구리 등 공동 요인에 의해 유도 될 수있다. 리포좀의 막 지질의 일부분 따라서 구리 이온의 첨가 후 리포좀 스태킹 EDTA하여 금속 착물을 모방 이미 노디 아세트산 머리기를 포함 <s클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 36입니다. 스태킹 인해이나 지질 이중층에 의한 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용 될 수있다 (37) (사용 된 스테인 언급되지 않음). PT에 의한 인지질의 스택 형성은 초기에 관찰되었다; 그러나, 나중에 작업을 제거하거나이 이슈 형성 (38) 폐지에 초점을 맞추고있다. 여기서는 TEM에 의해 막 결합 단백질의 연구 적재 NAPT 유도 나노 디스크를 이용할 수있는 방법을 제안한다. 즉, nanodiscs에 결합 단백질은 스택에서 nanodiscs을 방지 할 수 있습니다. 적층에 대한 이유는 명확하지 않지만, 그것은 서로 (도 1A)에 부착하기 위해 디스크를 일으키는 인지질 및 PT의 포스 포릴 그룹 사이의 정전 기적 상호 작용이 있다는 것을 제시 하였다 (39). 우리 프로토콜 뒤에 가설 단백질은 나노 디스크에 결합하면, 인지질 표면의 대부분 availa 없다는 것이다<html> 때문에 단백질에 의한 입체 장애에 대한 PT와 상호 작용 BLE. 이 스택 형성 (그림 1B)를 방지 할 수 있습니다. 두 가지 결론을 그릴 수 있습니다. 우선, 적층 예방 관심있는 단백질은 막에 결합 된 것을 의미한다. 둘째, 단백질 ND 복합체는 복합체의 대략적인 형태를 얻기 위해 표준 단일 입자 처리 방법 (24) (40)로 처리 될 수있다. 또한, 비 - 변성 겔 전기 영동 또는 동적 광 산란과 같은 방법으로 분석을 수행 할 수있다. 이 가설을 입증하기 위해, 우리는 많은 염증성 질환 (41), (42)에 관여하는 막 결합 단백질 5 리폭 시게나 제 (5LO)을 사용했다. 이 78-kDa 단백질은 막 (43)에 결합하는 칼슘 이온을 필요로한다. 이 멤브레인 연관이 조사 된 경우에도 광범위 리포좀을 사용하여S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 44, 45, 46, 47의 막 분획, 이러한 TEM 분석과 구조 결정을 위해 사용될 수 없다. nanodiscs의 제조는 세제 나트륨 콜레이트 재현 탁 MSP 지질과 혼합함으로써 시작한다. 얼음상에서 1 시간 동안 배양 한 후, 세제 서서히 흡착 수지를 이용하여 재구성 된 혼합물로부터 제거된다. 이러한 종류의 재료는 종종 작은 비드로 성형 폴리스티렌 이루어진다. 그들은 상대적으로 소수성 및 지질 (48)에 비해 세제를 바인딩에 대한 강한 선호를 가지고있다. 소수성 비드를 제거하고, 원심 분리를 이용하여 설명을 수행 한 후에는 nanodiscs은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)에 의해 정제된다. 정제 nanodiscs은 (a 적정 또는 여러 비) 등몰 비율의 monotopic 막 단백질 (및 가능한 보조 인자)와 혼합하고, (R)에 남아어린애들입니다 사람들을 대피 (15 분). TEM 분석으로는 글로우 방전 탄소 코팅 된 그리드 상에 샘플 μL - 양을 적용하여 다음 NAPT 마이너스 염색을 수행함으로써 수행된다. 분취 액은 TEM 그리드에인가 된 경우에서 동일한 샘플은 별다른 변화 비 변성 또는 SDS의 PAGE 겔 전기 영동뿐만 아니라 의한 활성의 측정 각종 분석을 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Transmission electron microscope: JEOL2100F</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow discharger</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM grid: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purification Matrix: ATP agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipid: POPC</td><td>Avanti polar lipids</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL in chloroform</td></tr><tr><td>Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm syringe filter: 0.2 &amp;mu;m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Detergent: Sodium cholate hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cholate</td><td></td><td></td><td>500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Lipid Stock</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. &lt;bt /&gt;Store at 4 &amp;deg;C for a week; or&lt;br/&gt; Store -80 &amp;deg;C for a month, after purging the solution with nitrogen.</td></tr><tr><td>MSP standard buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. &lt;br /&gt;Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis Running Buffer</td><td></td><td></td><td>In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer</td><td></td><td></td><td>In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol</td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td></td><td></td><td>Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 0.72 M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Glycerol - 4 mL.&lt;br /&gt;Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.</td></tr></tbody></table>

method to visualize and analyze membrane interacting proteins by transmission electron microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

우리가 제안하는 방법은 결합 monotopic 막 단백질 막 표면을 제공 nanodiscs의 제조 방법에 의존한다. 나노 디스크 지질 이중층에 매립에는 막 관통 단백질이 없을 때, nanodiscs 여기에서 &quot;빈 nanodiscs&quot;(도 2A)로 표시된다. 이 두 MSP1E3D1 비계 단백질과 POPC (8)의 약 260 분자의 조성물 256 kDa의의 계산 된 분자량이있다. 이 단백질 사용 : 재구성을위한 지질 비율, 하나의 주요 피크 (그림 2A하는) 겔 여과 동안 용출 하였다. 9 ㎖ (그림 2A) 주변의 피크 분획을 하나의 밴드 (그림 2B, 레인 1)을 보여주는 파란색 기본 겔 전기 영동 (49)에 의해 조사 하였다. 밴드 256 kDa의 계산보다 다소 큰 크기에 대응되지만, TEM 영상에서 측정 된 나노 디스크 직경은에 대응0.5 nm의 ± 내지 13을 예상했다. 이전 35 (프로토콜 단계 2) 위에서 더 상세히 기술 된 바와 같이 monotopic 세포막 단백질 5- 리폭 시게나 제 (5LO)를 정제 하였다. 78 kDa의 5LO의 동질성은 SDS PAGE에서 전기 영동 (도 2C, 레인 1)로 분석 한 결과 35 (도시 생략) 전체 기능이었다. 이 프로토콜에서, 조건은 의도적으로 nanodiscs의 적층을 촉진이 만들어집니다. 그러나이 적층 특별히 다른 치료 및 부가가 이루어지고 난 후에 마지막 단계 네거티브 얼룩 나트륨 phosphotungstate 첨가함으로써 만 TEM 영상 (소위 검체)를 위해 만들어진 샘플에서 유도되는 것을 주목해야한다. 사실, NAPT 묻은 nanodiscs의 이미지는 HDL (34)에 대한 초기에 예상되는 적층 (그림 3A)를 보여줍니다 </s업&gt; 등의 인지질 단체 5, 50. 도 1a에 개략적으로 설명 된 장 등에 의해 제안 된 바와 같이 (도 3a)은 &quot;측면에서 볼 동전 긴 스택&quot;는 이중층 사이 인터 phosphotungstate로 집계 nanodiscs이다. 32, 39. 또한, 버퍼의 다양한 추가 영향 여부를 확인하지 않도록, 또는 적층을 유도하는 것이 중요하고, 이하 명백해질 바와 같이, 칼슘 이온의 영향의 조사가 필요했다. 도 3b에서, 적층은 여전히 칼슘 이온 NAPT 염색 전에 나노 디스크 용액에 첨가하고 시료에 존재한다. 프로토콜의 중요한 단계는 그림 4, 막 칸에 표시됩니다딩 단백질은 용액으로 존재한다. 5LO가 nanodiscs (도 4a)의 막 표면에 결합 될 때 적층은 NAPT 얼룩에 의해 유도 할 수 없었다. 개략적으로 (오른쪽, 하단도 1b)를도 1에 도시 된 바와 같이, 1 :이 표본 들어 nanodiscs에 5LO의 몰비는 1이었다. nanodiscs의 지질 이중층 양쪽에서 접근로 TEM 이미지를 더 적은 겹침 (도 4B) 표시하면서 또한 리포좀 대조적으로 제조 된 두 5LO 하나 나노 디스크의 비율 시편. 10, 11, 12 또는 10 포스파티딜 phosphoinositols 구속력 들어, 일부 외부 막 단백질은 세포막의 특정 지질의 존재 등을 의존 할 수있다. 5LO의 경우, 칼슘 이온의 존재이다 neces43 세리. 도 4a 및 B에서 칼슘 이온은 nanodiscs 및 5LO와 솔루션에 참석했다. 즉, 단지 적층의 부족은 monotopic 단백질 결합 된 것을 도시하지만 결합은 칼슘 이온에 달려있다. 이를 표시하기 위해 nanodiscs 및 5LO하지만없이 칼슘을 함유하는 용액으로 염색 NAPT하고 TEM (도 4C)에 의해 촬상. 예상대로, 5LO 솔루션에서 무료로 5LO를 떠나, 칼슘없이 nanodiscs에 바인딩 할 수 없습니다, 그래서 nanodiscs 대신 (그림 4C) 스택. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55148/55148fig1.jpg" /> 나노 디스크 스태킹 및 방법의 개요 그림 1. 원리. 나노 디스크의 스택의 A. 원리. nanodiscs (왼쪽)의 용액에 부정적인 얼룩 phosphotungstate 나트륨의 첨가는 토륨 리드<html> 전자 인해 인지질 이중층과 PT 분자 (중간, 검은 점) 사이의 정전기력 (중간 화살표)에 nanodiscs (오른쪽)의 적층. 프로토콜의 B. 도식 표현. 네 개의 다른 각도 (아래 가운데)에서 묘사 된 복합체를 형성하기 위해 (회색)는 외부 막 단백질에 빈 nanodiscs (왼쪽) 바인드. monotopic 단백질의 존재 입체적 phosphotungstate 염으로 염색 할 때 스택에서 nanodiscs 방지 (우하) 어떠한 큰 개체 (오른쪽)의 부재에 의한 적층 대조적이다. 녹색과 오렌지색 링은 밝은 갈색에 표시되는 인지질 코어, 주위에 두 개의 MSP 포장을 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55148/55148fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> JPG &quot;/&gt; 그림 2. Nanodiscs 및 5LO의 균질성 분석. 재구성 빈 nanodiscs의 A. 크기 배제 크로마토 그래피. (9) 용액의 nanodiscs 피크의 용출. B. (A)에 도시 된 SEC로부터 피크 분획의 겔 전기 영동 분석은 비 변성. 레인 M은 마커가 포함되어 있습니다. 싱글 밴드 (9) 용액의 피크 분획로드 레인 (1)에 존재한다. C. 정제 5LO의 젤 전기 영동 분석 변성. 레인 1에서 강렬한 밴드로 78 kDa의 5LO을 보여줍니다 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55148/55148fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55148/55148fig3.jpg" /> TEM에 의해 분석되는 단백질의 부재에 Nanodiscs 그림 3. 스택 형성. A. 나노 디스크 스태킹은 승 유도암탉은 NAPT로 염색. 측면에서 볼 때 &quot;동전의 스택은&quot;nanodiscs의 스택입니다. 각각의 나노 디스크는 흰색 밴드로 나타납니다. NAPT 물들 때 B. 스태킹은 나노 디스크 용액 중의 칼슘 이온의 존재에 의해 방해되지 않았다. 스케일 바는 100 나노 미터이다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55148/55148fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55148/55148fig4.jpg" /> TEM에 의해 분석 보조 인자의 존재에 단백질의 바인딩에 의해 스택의 형성을 방지 그림 4. 1 (A) 또는 2 : 1 (B) 및 A. B. 칼슘 이온의 몰 비율로 1 5LO의 혼합물 및 nanodiscs에 존재 하였다. (B)에 도시 된 바와 같이 더 5LO는 nanodiscs 결합, 적은 nanodiscs는 스택에 사용할 수 있습니다. 보의 단일 입자 복합체제 (A) 및 (B)는 상기 처리 (35)에 적합하다. 칼슘 이온의 부재에서 C.는 5LO 바인드 없다. 이 샘플의 NAPT 염색 언 바운드 5LO을 떠나, nanodiscs의 전형적인 스택을 보여줍니다. 스케일 바는 100 나노 미터이다. 이미지는 69,500x의 배율에 4K X 4K CCD 카메라에 의해 획득 하였다. CCD 카메라의 픽셀 크기는 이미지의 EM 시험편 수준 2.16 Å의 대응하는 값을 제공 ~ 15㎛이다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55148/55148fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

연구

생체공학

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

생화학

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular communication. EVs consist of three populations of vesicles, namely microvesicles (MVs), exosomes, and apoptotic bodies. The limiting membrane of EVs is crucially involved in the interactions with the recipient cells, which could lead to the transfer of biologically active molecules to the recipient cells and, consequently, affect their behavior. The freeze-fracture electron microscopy technique is used to study the internal organization of biological membranes. Here, we present a protocol for MV isolation from cultured cancerous urothelial cells and the freeze-fracture of MVs in the steps of rapid freezing, fracturing, making and cleaning the replicas, and analyzing them with transmission electron microscopy. The results show that the protocol for isolation yields a homogenous population of EVs, which correspond to the shape and size of MVs. Intramembrane particles are found mainly in the protoplasmic face of the limiting membrane. Hence, freeze-fracture is the technique of choice to characterize the MVs' diameter, shape, and distribution of membrane proteins. The presented protocol is applicable to other populations of EVs.

We present a protocol for the isolation and freeze-fracturing of extracellular vesicles (EVs) originating from cancerous urothelial cells. The freeze-fracture technique revealed the EVs' diameter and shape and-as a unique feature-the internal organization of the EV membranes. These are of immense importance in understanding how EVs interact with the recipient membranes.

세포 밖 소포 분석을 위한 동결-골절 전자 현미경 검사

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular ...

암 연구학

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

생물학

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

요약

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부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

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