비디오에서, 우리는 시험관 내에서 방광암 세포로부터 기원되는 세포밖 소포의 동결 파쇄를 위한 프로토콜을 제시한다. 세포밖 소포는 세포로부터 유래된 막 제한 소포가 세포외 공간으로 방출되고 세포간 통신에 역할을 한다. 세포 밖 소포 내에서 우리는 기원, 크기 및 분자 구성에 따라 다른 세 개체군, 엑소좀, 마이크로베시클 및 사멸체를 구별합니다.
세포밖 소포의 분자 조성은 공여체 세포의 분자 프로파일을 반영하고 수용자 세포에서 생물학적 과정을 방해한다. 그러나, 세포 소포의 막의 제한막의 조성은 수용자 세포막과의 상호작용에 결정적이다. 제한된 막의 조직을 분석하기 위해, 세포 밖 소포는 먼저 분리 된 다음 동결 골절 기술에 접근해야합니다.
동결 골절은 소포를 포함한 생물학적 막의 이차원 조직을 연구하는 데 전념하는 전자 현미경 기술입니다. 동결 파쇄의 단계는 시편의 신속한 동결, 시편 파쇄, 동결 파단 표면의 복제본 제작, 복제본을 청소하여 생물학적 물질을 제거하는 단계입니다. 복제본은 마침내 투과 전자 현미경으로 시각화됩니다.
우리의 목표는 동결 골절 기술을 사용하여 모양, 크기 및 멤브레인 조성 측면에서 마이크로베시클을 특성화하는 것이 었습니다. 세포 배양기에서 성장하는 세포부터 시작하십시오. 현미경으로 세포를 검사하여 세포의 가변성과 합류를 확인합니다.
마이크로베시클을 가진 배양 배지를 튜브에 모으고, 300g-force에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 수집하십시오. 이어서, 2000 g-force 및 10, 000 g-forces에서 상청액을 원심분리한다.
그 후, 튜브의 끝에서 미생물을 나타내는 희끄무레 한 펠렛을 관찰하십시오. 조심스럽게 상청액을 제거하십시오. PBS 1.5 밀리리터를 첨가하고, 마이크로베시클을 함유하는 펠렛을 재현탁한다.
그런 다음 10, 000 g-forces에서 원심 분리하십시오. 희끄무레 한 펠릿을 관찰하십시오. 상층액을 제거하고 부드럽게 고정 물질을 첨가하십시오.
섭씨 4도에서 20 분 동안 그대로 두십시오. 다음으로 고정제를 제거하고 세척 완충액을 추가하여 펠렛을 다시 현탁시키지 않고 헹구십시오. 섭씨 4도에서 10 분 동안 그대로 두십시오.
세척 완충액을 제거하고 펠렛에 30 % 글리세롤을 첨가하십시오. 펠렛을 균질한 현탁액 내로 재현탁시키고, 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 중앙 구덩이가있는 깨끗한 구리 운반대를 준비하고 찡그린 얼굴과 액체 질소로 플라스크를 개발하십시오.
현미경으로 샘플을 구리 캐리어의 중앙 구덩이로 옮깁니다. 응고된 프레온을 혼합하여 액화시킨다. 핀셋으로 캐리어의 외부 링을 잡고 냉각 된 프레온에 담그십시오.
여덟 초 후에 캐리어를 액체 질소로 개발 플라스크로 신속하게 옮깁니다. 마크 냉동 악의적이고 그것을 식히십시오. 액체 질소 하에서 캐리어를 빌레로 모으고 닫은 다음 동결 파쇄 될 때까지 액체 질소 용기에 보관하십시오.
제조업체 운영 지침에 따라 동결 분수 장치를 준비하십시오. 진공 시스템을 시작하고 장치 챔버를 영하 150도까지 식히십시오. 동결된 샘플이 있는 구리 담체를 동결 분별 장치로 옮깁니다.
칼 온도를 영하 100도까지 설정하고 진공 상태를 기다립니다. 샘플의 표면이 매끄럽게 될 때까지 나이프의 전동 운동을 켜서 샘플을 단면화하기 시작하십시오. 파쇄를 위해서는 칼의 전동 운동을 끄고 칼의 느린 수동 제어를 진행하십시오.
플래티넘 섀도잉을 45도 각도로 진행합니다. 높은 장력을 켜고 백금 총에 전류를 증가시킵니다. 백금의 불꽃이 샘플을 그림자로 만들기 시작해야합니다.
석영 크리스탈 두께 모니터에서 백금의 위치를 감독하십시오. 백금의 권장 두께는 2.5 나노 미터입니다. 전류와 높은 장력을 끕니다.
90도 각도로 카본 섀도잉을 진행합니다. 높은 장력을 켜고 탄소 총에 전류를 증가시킵니다. 탄소의 불꽃은 샘플을 그림자로 만들기 시작해야합니다.
2.5 나노 미터의 탄소가 얻어지면 전류와 높은 장력을 끄십시오. 동결 파괴 장치에서 복제본이있는 샘플을 이중 증류수로 채워진 12 밸브 플레이트로 옮깁니다. 캐리어가 가라 앉는 동안 복제본이 물 표면에 떠 있습니다.
와이어 루프가있는 복제본을 하이포클로라이트 나트륨으로 채워진 12 밸브 플레이트로 옮기고 밤새 배양하십시오. 복제품을 이중 증류수로 씻으십시오. 메쉬 구리 TM 화격자에 모아서 두 시간 동안 공기 중에서 말리십시오.
투과 전자 현미경을 사용하여 복제본을 이미지화하고 현미경 사진을 얻으십시오. 복제본과 현미경 사진을 정확하게 해석하려면 명명법에 대한 적절한 방향에 대한 지침을 따르십시오. 복제본의 분석은 단리된 조건화된 배지가 소포의 농축된 분획을 함유하고 있음을 보여주었다.
분리된 소포는 세 개 이상의 클러스터로 수집되거나 매우 개별적으로 분포되었다. 소포는 구형으로 형성되었습니다. 소포의 직경은 마이크로베시클의 직경과 일치했다.
동결 파쇄는 또한 마이크로베시클 막의 이차원 조직을 밝혀냈다. 마이크로베시클의 외인질성 상은 매끄럽고 균일한 외관을 가졌고, 원형질체 단계에서는 막간 입자를 관찰했다. 막간 입자는 산발적으로 나타났는데, 이는 암 물질 세포로부터 분리된 마이크로베시클이 단지 낮은 양의 막 단백질 또는 단백질 어셈블리만을 함유하고 있음을 의미한다.
요약하면, 제시된 프로토콜에 사용 된 동결 골절 기술은 세포 밖 소포의 특성화를위한 최적의 기술임을 입증하고 다른 세포 밖 소포 집단의 평가에 사용될 수 있습니다. 동결 골절 기술의 중요한 장점은 세포 밖 소포의 생물학적 기능을 결정하는 소포 제한 막의 내부 조직을 해결할 수있는 힘입니다.
