We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

형광 단백질 키메라 1. 생성 및 검증 <ol><li> 표준 재조합 DNA 전략 (13)를 사용하여 관심의 대상이되는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 추가. 참고 : 우리가 광범위하게 GFP를 사용하고 있지만, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP)와 같은 다른 변종 DsRed의 및 mCherry가 이용 될 수있다. 형광 접는 효율성, 밝기와 광 안정성의 개선이 지속적으로 이루어지고 있으며, 연구자들은 최신 구조의 자신을 소용합니다. <ol><li> 정확한 DNA 서열을 확인하고 GFP 부분이 관심의 단백질과 프레임에 있는지 확인하십시오. 표준 재조합 DNA 전략 (21)를 사용하여 시퀀싱을 수행합니다. 참고 : 많은 기관이 조사가 추가 정보를 문의 권장 핵심 DNA 시설을 가지고있다. </li><li> 단일 또는 이중 패스 막 단백질의 경우, 생성융합 단백질 (19)의 아미노 및 카르 복실 단말기 버전 모두. </li><li> 다중 스패닝 단백질 추정 extramembrane 루프 내에서 GFP뿐만 아니라 말단를 삽입합니다. 단백질은 ER에 translocon 통과 한 후에 신호 서열은 종종 단백질 분해에 의해 절단 될 때 목적 단백질의 아미노 말단에 부착 된 형광 융합 단백질 트랜스 키메라를 생성 할 때 특히주의. </li><li> 그대로 아미노 - 말단 태그 형광 단백질을 함유하는 성숙한 단백질을 생성하도록 현존하는 신호 계열의 경우, 절단 부위에 형광 융합 단백질 말단을 삽입한다. 키메라 (21)의 생성을위한 표준 재조합 DNA 전략을 사용한다. </li></ol></li><li> 관심 세포주 충분한 적절히 국부 형광 신호의 존재를 결정. <ol><li> appropri에서 GFP의 고유 형광을 이용하여 표면 형광 현미경 하에서 세포를 관찰필터 설정 조건을 먹었다. 510-560 nm의를 포함 GFP 필터 세트의 경우, 올바른 필터가 사용되는 형광체에 사용되는 것을 확인합니다. 참고 : 눈에 의한 평가는 신호가 상주하는 내 세포 구조가 쉽게 배경 위에 해결되었는지 충분히 강한 신호를 제공 할 때 충분한 신호를 얻을 수있다. 또한 GFP 단백질의 염색 패턴은 적절한 세포 기관에 대한 마커의 것과 일치하고, 기본 태그가 지정되지 않은 단백질의 바람직 동일해야합니다. </li></ol></li><li> 안정적인 또는 일시 발현 방식이 단백질이 평가되고 기반으로 활용할지 여부를 결정합니다. 참고 : 안정 형질은 일반적으로 일시적인 시스템보다 표현의 낮은 수준을 감당할. 일시적 발현은 (단백질에 따라 5-24 시간 ~ 포스트 형질) 단백질 및 증가 된 신호 강도의 높은 수준의 발현을 얻을 수 있지만, 또한 단백질 등의 과발현 AGGR 인공물을 초래할 수잘못된 세포 내 현지화로 이어지는 egation 또는 단백질 대상 경로의 포화,. </li></ol> 세포와 세포 배양 2. 형질 참고 : 세포의 다양한 HEK293, 헬라, COS-7, CHO 세포 (14)를 포함하여, FPP 분석 의무가 있습니다. 다음의 설명은 HEK293 세포에서 막 단백질을 발현에 기초한다. <ol><li> 성장 인간 배아 신장 세포 (HEK293) 부착 단층 등의 6 개의 37 °에서 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 피루브산 나트륨 및 250 ㎍ / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM), ml의 5 % CO 2와 C. 층류 조직 문화 후드 세포와 모든 작업을 수행합니다. T-75 플라스크에서 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 ~ 배지에서 세포를 성장한다. </li><li> transien를 생성하는 지질, 또는 일렉트로 viral- 기반 기술을 포함하는 임의의 표준 고효율, 낮은 독성의 형질 전환 방법을 사용하여 세포를 형질t 또는 안정 식입니다. 일반적으로 1 × 10 6 세포 당 플라스미드 DNA의 2 μg의 좋은 재현성 단백질 발현을 제공합니다. CO 2 할 수있는 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 적절한 조직 배양 배지에서 5-48 시간 동안 세포를 유지한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 적절한 필터 세트를 이용하여, 극한의 GFP 형광 신호를 이용하여, 표면 형광 현미경을 이용하여 GFP 융합 단백질의 발현을 위해 세포를 모니터한다. 형광 신호는 보통 다음 형질 감염 24-72 시간 이내에 최대에 도달한다. 형광 신호가 최대 레벨에 도달 할 때 셀을 사용한다. 관심있는 단백질 또는 GFP 잔기 하나에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석에 의한 단백질 발현 수준을 모니터링. </li><li> 코팅 된 커버에 실험 분석 판 세포하십시오. 라이브 셀 구성 또는 다음 고정에서 하나보고 현미경 슬라이드에 탑재합니다. 플레이트 세포는 24 ~ 48 시간 내에 60 % -80 %의 합류를 달성하기 위해. <ol><li> 전체 표면이 피복되도록 폴리 라이신 용액 (0.1 ㎎ / ㎖)으로 코팅 된 커버. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 60 분,이어서 실온에서 자외선 광 하에서 30 분 동안 인큐베이션. 초과 폴리 라이신을 제거하고 PBS 3 회에 커버 슬립을 씻어. </li><li> 대안 적으로, 오일 - 침지 목적과 직접 촬상 할 수 있도록 광학 유리 바닥이있는 세포 배양 플레이트로 구성된 챔버 커버 유리 셀을 접시. 실제 현미경 설정은 연구자가 사용할 수있는 장비에 따라 다르지만 빠른 솔루션을 변경 할 수 있어야한다. 세포 형태 및 세포 형태에 따라, 세포는 FPP 분석시의 주위 60-90% 합류이어야한다. </li></ol></li></ol> 3. 형광 현미경 설정 <ol><li> 이러한 60X, 1.42 NA 오일 침지 목적으로 최대 신호 수집 및 공간 해상도에 대한 높은 개구 수 (NA) 오일 침지 목표를 사용합니다. 일 사용전자 형광 물질을 자극하는 레이저를 다음과 아르곤 가스를 488 나노 미터 (GFP와 YFP) 및 561 다이오드 (RFP, mCherry을). </li><li> 각각의 구조에 대한 이미지의 최적의 노출, 이득 및 캡처 속도를 결정합니다. (단계 7.1.2 참조) photobleaching에 최소화하기 위해 레이저 강도와 노출 시간을 조정합니다. </li><li> (예를 들면, 세포막 단백질 마커와 협동하여 막 투과성으로 대 수용성 마커), 적절한 필터를 선택할 여러 형광 물질을 이용하여 연구를위한 신호 크로스 토크를 최소화하고 신호대 잡음비를 최대화하도록 설정한다. </li></ol> 4. 플라즈마 막 투과성으로 최적 조건을 설정 <ol><li> (예 EGFP DsRed의) 전용 수용성 형광 단백질을 발현하는 세포로부터 세포 배양 배지를 제거한다. KHM 버퍼 셀을 3 회 (각각 1 분)을 워시 (110 mM 아세트산 칼륨, 3 mM의 MgCl 2, 20 mM의 HEPES-NaOH를, pH가 7.2). 실온에서 세포 실험과 모든 시약을 수행합니다. </li><li> 장소 세포 오N, 커버 슬립 형광 현미경 스테이지 KHM 버퍼 (단계 2.4 참조), 제어 &#39;비 - 투과 가능&#39;단계를 나타내는 첫 번째 이미지를 수집한다. </li><li> 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하려면, 세포 KHM 디기 토닌 완충액 (30 μM)을 첨가. 10-60 초 동안 5 ㎖ / min의 속도 완충액 (+ 디기 토닌 완충액)로 세포를 관류. </li><li> 서서히 토닌의 농도를 증가시킴으로써 최적 토닌 농도를 측정. 디기 토닌 애플리케이션 10-60 초 이내에 용해 EGFP에서 형광 신호의 완전한 손실이있을 때 최적 토닌 농도가 달성된다. 많은 세포 10-50 μM의 디기 토닌의 적용은 세포막을 Permeabilize 하시려면하기에 충분하다. <ol><li> 모든 응용 프로그램은 디기 토닌의 가장 낮은 농도를 사용합니다. 투과 가능 배경 신호에 대해 투과성으로를 토닌 후 이미지를 수집합니다. </li></ol></li><li> 관심의 GFP 단백질 키메라는 막에 있는지 확인세포막 투과성으로 디기 토닌 (16)의 다음의 형광 신호의 세포 유지를 확인함으로써 tegrated. <ol><li> 세포 소기관 특정 형광 단백질 (23)을 표현한다. 미토콘드리아 단백질은 예를 들어, 이와 관련 16 일, pDsRed2 - 미토 벡터에서 잘 작동합니다. 2.1 단계에 설명 된대로 최적의 발현 상태를 확인합니다. </li><li> 세포 내 소기관의 형태가 토닌에 장시간 (60 분에) 노출을 일정하게 유지하는 토닌 농도를 확인하여 사용되는 세포 유형에 적합한 지 확인합니다. 참고 사항 : 리소좀 같은 다양한 세포 구획에 대한 항체를 사용하여 사용 표준 면역 형광 현미경 프로토콜 (예 LAMP1), 골지 (예 TGN38) 소포체 (예컨대, calnexin), 엔도 솜 (예 Rab5), 미토콘드리아 (예를 들면, 시토크롬 C). 세포 내 소기관의 형태 / 무결성 변경 극적으로 비켜 경우R 60 분, 그것은 토닌 농도가 너무 높았다 같으며 토닌 농도 및 / 또는 노출 시간의 감소를 필요로한다. 참고 : 토닌은 흡입 및 피부 접촉에 의해 독성. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 할 것. </li></ol></li></ol> 형광 단백질의 5. 단백질 분해 효소 처리 <ol><li> 단백질 분해 효소를 추가 한 후 (단백질 분해 효소 K를, KHM 버퍼에 50 ㎍ / ㎖) KHM 버퍼에있는 세포를 씻으 직접 세포에. 5 mL의 연속적 제조를 목욕 관류 중력 공급 시스템을 사용하여 / 분의 유속으로 세포를 관류. <ol><li> 50 ㎖ 주사기에 보관 솔루션과 폴리에틸렌 튜브 목욕 (5 ml / 분의 유량)에서 단일 출구 매니 폴드에 독립적 인 저수지를 연결. 상수 (0.5 mL) 중 조 볼륨을 유지하고 수동 저수지 관류 용액의 전환에 의해 교환을 달성하기 위해 흡인 피펫을 위치. </li></ol></li><li> 불소 여부를 결정하기 위해 이미지를 수집escent 신호가 지속되거나 저하. 30-60 초 이상 초기 신호 강도의&gt; 90 %의 손실이 GFP 단백질 키메라의 단백질 분해 열화와 일관성 (대표 결과 참조). </li><li> 신호 열화가 테 K 관찰되지 않는 경우, 이러한 손실이 예상되는 경우, 버퍼 내의 KHM 트립신 (4-8 mM)을 가진 테 K 솔루션을 대체. 필요한 경우, 프로 테이나 제 K 및 트립신의 혼합물을 이용한다. 프로테아제 활성을 해소 할 필요가 없다. </li></ol> 외부 도메인에 플라즈마 막 단백질 6. 대안 <ol><li> 세포막 단백질, 투과성으로 토닌을하기 전에 외부 형광 단백질 키메라에 대한 분석을 수행한다. KHM 버퍼 된 커버에 세포 (5 ml / 분 × 3 분) 세척 및 사전 단백질 분해 효소 처리에 대한 이미지를 촬영하고 7 단계로 사전 단백질 분해 효소 형광 신호를 정량화. </li><li> 프로테아제 세포를 노출 (단백질 분해 효소 K를 50 ㎍ / ㎖의 또는 mM의 KHM 버퍼에 4-8 트립신) t에KHM 매체 함유 프로테아제 (유량 5 ㎖ / 분)로 세포를 환류시켜두면 그 토닌의 부재. 신호가 사라지거나 얼마나 오랫동안 신호가 지속 얼마나 빨리 결정하기 위해, 형광 단백질의 이미지를 수집합니다. </li><li> 디기 토닌 투과성으로 전에, 10 %의 혈청 (FBS)을 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 세 번 (각각 1 분)을 세정함으로써, 모든 프로테아제 활성을 급냉. </li><li> 2 분 동안 KHM 완충액 (5 ㎖ / 분의 유량)으로 환류시켜두면 세포를 세척 하였다. 사전 투과성으로의 화상을 취득. 단계 4에 기재된 세포막 Permeabilize 하시려면. </li><li> 5 단계에 설명 된대로 프로테아제 또한 다음과 같은 이미지를 수집합니다. </li></ol> 7. 이미지 분석 <ol><li> 형광 신호의 손실은 실시간으로 모니터링 할 수있는 &quot;생균&quot;기록 가능한 도립 현미경을 사용한다. 지속적으로 모니터링 동일한 파라미터 (노출 시간, 게인, 레이저 강도 등)을 이용한다. <ol><li> EXPER 결정제어 조건 (즉, KBH 혼자 버퍼)에서 관심의 GFP 단백질의 형광 신호를 관찰하여 imental 매개 변수를 설정합니다. 10-20 분 동안의 신호 강도의 뚜렷한 손실이 없다는 것을 보장하기 위해 컴퓨터 - 기반 현미경 이득, 레이저 강도 및 노출 시간 설정을 조정한다. 주 : 신호 강도의 절대 값이 아니라, 각각의 PI 사용할 현미경 시스템과 설정에 기초한다. 상대 형광 강도의 변화를 모니터링합니다. </li></ol></li><li> 또한, 단백질 분해 효소에 의해 다음 토닌에 설정된 시간 지점에서 세포를 치료, 이전 이미징 된 커버에 장착에 세포를 고정합니다. 시점 경험적 4 단계와 초기 조사 제의 절차에 따라 결정, 디기 토닌 또는 프로테아제의 0, 30, 60, 120 및 300 초 후 첨가 시작한다. <ol><li> 세포 (실온에서 20 분간) 완벽 번째 잠기하는 고정액 충분한 양 (PBS에 3.7 % 파라 포름 알데히드)를 사용하여 해결전자 세포. </li><li> PBS 20 mM의 글리신 (3 × 5 분)를 함유하는 세포를 세척하여 잔여 파라 포름 알데히드를 켄칭. </li><li> 커버 슬립에서 물기를 제거하고 유리 현미경에 50 μl의 설치 매체에 커버 슬립을 반전하여 마운트 된 커버는 이미징 슬라이드. 슬라이드 영상 전에 밤새 건조하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 형광 현미경 이미지를 수집 컴퓨터 제어 형광 현미경 영상 캡쳐 기능을 사용함으로써 (아래에서 적절한 필터하면 형광 물질이 사용되고 호환 세트). </li><li> 배양 조건의 함수로서 형광 신호 세기를 정량화. 개별 셀을 둘러싸는이자 (ROI)의 영역 내의 평균 픽셀 강도를 구합니다. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

막 단백질의 정확한 방향 및 토폴로지들은 적절한 기능을 위해 필수적이다. 막 단백질 토폴로지 이해의 중요성에도 불구하고, 이러한 데이터가 완전히 결여되는 많은 단백질이있다. FPP는 쉽고 효율적인 세포막 단백질 토폴로지를 결정하는 단계로서, 대부분의 실험실에 의해 수행 될 수있는 하나를 제공한다. FPP 방식은 단백질 토폴로지를 결정하기위한 기존의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제?...

세포막뿐 아니라 수많은 세포 막은, 수성 두 구획을 분리 장벽의 역할을한다. 세포막의 경우, 분리와 외부 셀의 안쪽이고; 세포 내 소기관 것은 세포질 소기관 루멘 사이이다. 예를 들어, 소포체 (ER) 멤브레인을 저감 한 환경 세포질에서 ER의 루멘 내 산화성 환경을 분리한다. 막 단백질은 ER-관련 리보솜에서 합성하고, ER 막 2 내에서 최종 토폴로지를 얻을 수있다. 단백질에 적합한 막 방향 및 토폴로지의 인수는 정상적인 기능을 위해 중요하다. 정확한 토폴로지가 결합 파트너와 상호 작용하는 세포막 단백질의 중요한 영역을 허용 그것은 중요한 번역 후 변형이 발생할 수 있고, 세포막 단백질의 경우, 세포와 상호 작용하고 t를 응답 할 수환경을 오. 완전히 세포막 단백질의 기능을 이해하려면 그 단백질이 존재하는 막 내, 즉, 그 막 토폴로지에 대해 배향되는 방법을 알고 명백히 필수적이다. 막 단백질은 약리학 타겟 (3)의 대부분을 포함 이후 단백질 표면의 양태는 다른 환경에 노출되는 세포막 단백질 어느의 토폴로지를 이해하는 기초 과학 기술의 취득 이외에 임상 적 의미를 표시하고있다. 최근까지, 시간과 비용에 상당한 투자를 필요거나 구하기 어려운 시약을 요구 한 막 단백질 토폴로지를 결정하는 접근한다. 두 실험과 인 실리코 접근법 세포막 내에 존재하는 단백질의 막 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. INDIVI의 평가에 기초하여 소수성 멤브레인 스패닝 영역의 예측 제 보낸이중 아미노산 3 수많은 예측 알고리즘은 이제 인터넷에서 사용할 수 있으며, 단순히 단백질의 아미노산 서열에 대한 지식을 필요로한다. 그러나 가정은 종종 토폴로지 4,5의 잘못된 할당 될 수 있습니다와 같은 모델링 프로그램, 가정의 중심에 있습니다. 이러한 컴퓨터 기반의 예측이 잠정적으로 막에 걸쳐 영역을 할당 할 수 있지만 또한, 그들은 항상 아미노 또는 단백질의 카르복시 말단이 세포 기관 루멘 또는 셀의 외관, 세포질에 있는지 여부를 확인하지 않습니다. 계산 능력을 증가, 심지어 함께 기계 학습 알고리즘 (6), 이러한 데이터의 사용은 여전히 모델이고, 실험적으로 획득 된 데이터를 이용하여 검증되어야한다. 멤브레인 토폴로지 판정 직접 실험은 면역 반응성을 평가 전과 후에 세포 투과성으로 만들어졌다 단백질 걸쳐 분산 공지 에피토프와 모노클로 날 항체의 패널을 사용하여 수행되었다. 이접근법은 관심있는 단백질을 사용하지 못할 수도 항체들의 세트를 필요로한다. 또 다른 전략은 다시 이전과 막 투과성으로 후 면역 반응의 결정 뒤에 단백질에 걸쳐 다양한 위치에 myc의 또는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 같은 에피토프 태그를 엔지니어링하는 것입니다. 면역 원성 태그 이외에, 이러한 시스테인 스캐닝 화학적 변형 (β 갈 락토시다 아제, 알칼리 포스파타제, 또는 β의 마제 포함) 효소 태그는 모든 세포막 단백질 7,8 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. 세포막 단백질의 위상 맵핑 채용 추가적인 방법 에피토프 태그와 약간 다른 접근 방법에 의존한다. 이 방법에서, 태그 서열은 N- 연결 글리코 실화 컨센서스 서열 NXS / T이다. 이러한 시퀀스는 생합성 경로, 내강 대에서 태그의 존재의 루멘에 존재하는 경우에만 발생 글리코 실화 때문에세포질 구획은 쉽게 SDS-PAGE 젤에 질량 변화로 관찰된다. 이러한 접근 방법은 이온 채널 multispanning CFTR 9에인가되었다. 이러한 모든 접근법들이 이용되었지만, 그것들은 모두가 생성 매니 폴드 구조를 서열에 분자 생물학에 상당한 투자를 필요로하는 것이 분명하다. 세포 내 소기관에 위치한 횡단 단백질에 대한 위상 정보를 확인하려면 더 많은 도전 것으로 입증되었습니다. 형광 기반 기술의 적용하지만, 멤브레인 토폴로지 많이 간단의 판정을했다. 이분자 형광 상보의 기술 (BiFC)가 해당 단백질 (10)의 형광 특성을 복원, 형광 단백질의 형광이 아닌 두 단편 사이의 상호 작용에 의존한다. 처음 10 생체 단백질 - 단백질 상호 작용을 결정하기 위해 설명되었지만,이 방법도 이용되고있다식물 세포 (11) 세포막 단백질 토폴로지를 결정한다. 그러나이 방법은 관심의 단백질뿐만 아니라 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 타겟팅 융합 단백질의 다양한 융합 단백질뿐만 아니라 생성을 필요로 시간 집약적이기도 한 관심에있는 세포 내에서는 단백질을 세포막되는 지식이 필요 . 막 단백질의 토폴로지를 결정하는 대안적인 접근법은 단순 12을 설명 하였다. 분석법, 형광 프로테아제 보호 (FPP)는 GFP 및 관심 유전자 간의 융합 단백질의 생성을 필요로한다. 접근법은 GFP 잔기에 비특이적 프로테아제의 상대 접근성에 기반; GFP 여​​부에 따라 세포 내 소기관의 루멘에 존재하여 단백질 분해로부터 보호 또는 세포질 내에 존재하는 단백질 분해 됨으로써 노출된다. 관심 단백질에 GFP 잔기 세포질을 향하게되면 따라서, 그것은에 노출 될프로테아제 활성 및 형광 신호는 손실. 관심 단백질에 GFP 잔기 (예 골지 내강으로) 환경에서 프로테아제 &#39;보호&#39;을 반대로 향하게되면, 다음 형광 신호는 계속된다. 프로테아제는 세포를 입력 할 수 있지만, 콜레스테롤 결합 토닌 약물이 사용되는 세포 내 세포막 구획을 입력하지 않을. 콜레스테롤은 척추 동물 스테롤 지배적이며, 구체적으로는 세포 내 구획에 대하여 세포막에서 농축된다. 배당체 독소, 디기 토닌은 공장 Digitalis 푸로부터 추출된다. 토닌은 (14, 16) (그림 1) permeabiliztion 선택적 막에 이르게 콜레스테롤이 풍부한 막에 친 화성을 ​​가지고 있습니다. 작은 세포질 성분의 출구 수있을뿐만 아니라, 디기 토닌 또한 투과성으로 단백질 분해 효소 K 또는 트립신과 같은 외인성 분자의 침입을 허용한다. FPP 프로토콜은 FAC 활용세포막은 ER 다른 소기관 반면, 골지체는 엔도 좀이 매우 낮은 콜레스테롤 함량을 가지고 미토콘드리아, 14 그대로 남아, 셀룰러 콜레스테롤 (17)의 80 %까지 포함 t. 세포막에 콜레스테롤의 선택적 혼입 S. 같은 다양한 종에서 진핵 토닌 의존적 세포막 투과성으로의 사용을 허용하는, 많은 진핵 세포에서 관찰되어왔다 인간 (14, 18)에 cerevisiae에. FPP 분석은 (a) 단백질은 막 결합 / 연관 또는 세포질과 세포막 단백질의 (b) 영역에서 자유롭게 확산 여부 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 대향 결정 간단 신속하고 매우 강력한 수단을 제공한다. 막 단백질은 여러 방향이 경우, 신호가 지배적 인 형태에서 발생하고 작은 형태가 감지되지 않습니다. 관심의 단백질 GFP 잔기의 첨가는 그 기능에 영향을 줄 수있는 얼마간의 관심이있을 수있는 반면 및/ 또는 세포 내 현지화,이 실제보다 실제로 더 이론이다. 실제로 많은 연구 명확 태그 GFP 단백질 (19, 20)의 특성을 변화하지 않는다는 것을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

플라즈마 막 투과성으로 효율적인 세포막 투과성으로는 수용성 형광 단백질 (예 : GFP DsRed의) (단계 4)의 사용에 의해 결정된다. 이들 단백질은, 세포에서 발현 될 때, 세포질에서 자유롭게 확산 및 세포막은 (도 2)를 사용하여 투과 가능 토닌 경우 손실된다. 형광 신호의 완전한 소멸 토닌 응용 프로그램의 10 ~ 60 초 이내에 발생한다. 관심의 단백질이 ?...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.7K 조회수.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies against specific peptides within the predicted sequence allow some localization experiments. However, other possible interactions with the antibodies often cannot be excluded. This situation provided an opportunity to develop a set of assays dependent on the protein sequence. Specifically, a construct containing the gene sequence coupled to the GFP coding sequence at the C-terminal end of the protein was obtained and employed for these purposes. Experiments to characterize localization, ligand affinity, and gain of function were originally designed and carried out to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor1. In addition, the construct can be employed for studies addressing membrane topology questions and detailed protein-ligand interactions. The present report presents a range of experimental protocols based on the GFP-TMEM184A construct expressed in vascular cells that could easily be adapted for other novel proteins.

A construct encoding TMEM184A with a GFP tag at the carboxy-terminus designed for eukaryotic expression, was employed in assays designed to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor in vascular cells.

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

연구

유전학

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

생화학

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구<em&gt; 생체</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

생체공학

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

생물학

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Source: Bird, L. E., et al. <a href="https://www.jove.com/v/52357">Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli</a>. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

Source: Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)
In this ...

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FPP)

요약

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이 비디오의 챕터

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

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GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FPP)