This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.

모든 절차는 독일 연방 공화국에 의해 발행 동물 실험에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 참고 : 망막 조직이 절차의 연장 부분 중에 산소가없는 것입니다 때문에, 모든 단계가 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 마우스는 어두운 적응 해부하기 전에 적어도 3 시간을해야합니다. 망막, 준비의 빛 적응을 방지하려면 및 슬라이싱은 희미한 붉은 빛 아래에서 수행되어야한다. 미디어 및 기타 화학 물질 1. 준비 <ol><li> 에임스 &#39;중간 (6)를 준비합니다. 절개 한 후, 항상 에임스 &#39;중간에 망막 조직 몰입. <ol><li> 에임스 &#39;중간의 2.2 g과 증류수 250 ml의에서 298 mg을 HEPES를 녹여. HEPES의 농도는 5 밀리미터 될 것입니다. 모든 입자가 용해 될 때까지 부드럽게 저어. </li><li> carbogen와 실온에서 거품 에임스 &#39;중간 (95 % 산소, 5 % 차적어도 5 분 봉 이산화탄소). 솔루션에 유리 파스퇴르 피펫으로 공급 carbogen. 가스 레귤레이터의 콘센트에 적합한 튜브를 통해 파스퇴르 피펫을 연결합니다. </li><li> 이 용액에 475 mg의 나트륨 - 중탄산염을 추가합니다. 발포 후 탄산 수소 첨가는 탄산 칼슘의 침전을 방지한다. </li></ol></li><li> 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 준비합니다. 아가로 오스는 vibratome의 절편 동안 망막 조직의 삽입이 필요합니다. <ol><li> 9 ml의 에임스 &#39;보통 180 mg의 아가로 오스와 증류수 1 ml에 용해. 모든 고체가 용해 될 때까지 천천히 아가로 오스 용액을 가열하는 전자 레인지를 사용한다. 5 열 - 10 초 단위는 오버 플로우를 방지 할 수 있습니다. 해결 방법은 명확하고 투명해야한다. </li><li> 저장소는 절차의 지속 기간 동안 37 ℃에서 수조에 용해 아가. </li></ol></li></ol> 2. Vibratome 설정 참고 : 모든 절편이 함께 수행하고있다vibratome 재료 표에 나열된. 주어진 설정은 vibratome의이 유형을 참조하십시오. 신경 조직의 vibratome 절편에 대한 자세한 내용은 7 참조 참조하시기 바랍니다가. <ol><li> 블레이드 홀더에 vibratome 인젝터 블레이드를 놓습니다. </li><li> 은 &quot;vibrocheck&quot;장치와 블레이드의 수직 편향을 측정합니다. 이 절삭면에 평행 할 때까지 블레이드를 기울 블레이드 홀더 상에 상기 조정 나사를 사용한다. 블레이드의 실제 위치는 부 표면 블라인드 효과를 방지하고 표면에 살아있는 세포를 포함하는 평면 부를 제조 할 필요가있다. </li><li> 다음 설정에 vibratome을 설정 진폭, 1.00; 속도, 0.20; 두께, 180-200 μm의. </li></ol> 마우스 망막의 3 해부 <ol><li> 밀폐 용기에 약 1 ml의 이소 플루 란의 증발에 의해 성인 C57BL / 6 마우스를 마취. 마취가 완료되면, 경부 탈구에 의해 동물을 안락사. 그만큼마우스 그렇지 않으면 조각의 품질이 저하되며, 이전 3 개월 이상이어야한다. </li><li> 눈 아래 곡선 집게를 배치하여 안구를 제거합니다. 조심스럽게 시신경을 노출 할 눈에 볼을 올려. 스프링 가위로 시신경을 잘라 2 ml의 에임스 &#39;매체를 포함하는 35mm 페트리 접시에 안구를 전송합니다. </li><li> 스테레오 현미경의 무대에 이후의 모든 단계를 수행합니다. 다음 절차 (- 3.9 3.4 단계)의 최적의 시각 제어를 할 수있는 값으로 배율을 조정합니다. </li><li> 뾰족한 집게로 공막 또는 20 G 바늘로의 전환에 각막에 구멍. 이 단계에서, 다른 집게로 눈 공을 안정. 천공 장치와 망막이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 단계 3.3에서 만든 작은 구멍에 스프링 가위를 삽입하고 각막 주위에 원을 잘라. 절단하는 동안 다시 집게로 눈 공을 안정. 다하기 위해 표면에 매우 근접하지 절개 유지망막에 유타. </li><li> 조심스럽게 집게와 각막, 렌즈 및 유리체를 제거합니다. 유리체는 눈 뒤쪽 만 얇은 투명층을 포함한다. 그러나, 유리체가 완전히 제거되었는지 절편 vibratome 필수적이다. </li><li> 페트리 접시에, 하나는 아래로 망막 위에 구멍을 통해 보이는하는 방식으로 아이 컵을 놓습니다. 개구부의 가장자리는 공막 조직으로 만 구성되어야합니다. 원형 컷 (단계 3.4)이 아이 컵의 적도에 너무 가까이 수행 한 경우, 망막 조직은 절개에 존재 가까이 될 것입니다. 단계 3.8에서 망막이 손상되지 않도록 다음주의하십시오. </li><li> 집게로 공막을 잡고 조심스럽게 따로 조직을 찢어. 이 단계에서 망막 파열되지 필수적이다. 필요한 경우 집게로 조직의 공막 부분을 흔들리지 조심스럽게 다른 집게와 망막 박리하여 오라 세라의 망막을 분리합니다. 포셉를 닫아 두십시오; 재 처리하지조직 이후 집게와 티나는 매우 부드럽고 방법 즉시 제공 할 것입니다. 주 :이 단계에서는, 망막과 세안 컵의 나머지 부분은 시신경 헤드에 연결된다. </li><li> 스프링 가위로 시신경 유두에 부착 사이트를 잘라. 망막은 이제 자유롭게 에임스 &#39;중간에 조직의 한 조각으로 떠되어야한다. </li><li> 위치로 조작하려면 집게로 가장자리를 따라 망막을 잡고 곡선 메스 블레이드를 사용하여 약 23mm의 6 작은 사각형 - 4로 망막을 잘라. 사각형 내에서 망막 조직을 곤란하게하지 마십시오. 망막이 아닌 지금까지 주변의 중앙 부분에서 조각을 가라. </li><li> 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 대경 플라스틱 파스퇴르 피펫 망막 부분을 이동시켜 하부있는이 1mm 미만인 격자 크기의 메쉬로 대체되었다. 비커 나 삼각 플라스크의 상부 셋째 내에서 페트리 접시를 수정하고 에임스 &#39;중간 버퍼에 망막 조각 잠수함carbogen와 bbled. </li></ol> 아가로 오스의 망막 조각 4. 퍼가기 <ol><li> 에임스 &#39;매체의 일부와 함께 35mm 플라스틱 페트리 접시에 3 망막 조각 - 조심스럽게 2를 전송합니다. 전송 대경 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하는 것이 가장 편리하다. 이 단계에서 망막 부분의 정확한 방향은 중요하지 않다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫으로 나머지 에임스 &#39;매체의 가능한 한 많이 제거합니다. 즉시 유체가 제거 된 바와 같이 단계 4.3를 진행합니다. 망막 조직 건조하게하지 마십시오. </li><li> 바로 아가로 오스 용해 2 ㎖ (37 ° C)와 망막 조각을 커버한다. 단계 3.10에서 언급 한 크기 감안할 때, 조각은 아가로 오스 내에 컬하지 않을 것이다. </li><li> 액체 아가로 오스 내에서 조심스럽게 페트리 접시의 바닥에 망막 조각을 밀어 넣습니다. 신경절 세포 층이 아래로 향하게해야합니다. 정확한 위치의 판단에 대한 스테레오 현미경을 사용합니다. 측위 망막 PI 처리작은 주걱 eces. 아가로 오스 빠르게 응고하기 때문에 가능한 한 빠르고 정확한 망막을 배치합니다. <ol><li> 망막 조각이 유리 접시의 바닥에 평행하게 배열; 그렇지 않으면 섹션 접선 또는 경사 될 것입니다. 각각의 조각은 서로 접촉하지 말아야하지만, 또한 너무 멀리 떨어져이어야한다. 동일한 수평 수준에서 망막 조각이 더 많거나 적은 곳에 위치 시키십시오. </li></ol></li><li> 최소 2 분 - (6 °의 C 4) 냉장고에 내장 된 망막 조각과 유리 페트리 접시를 넣어. 이 신속하게 추가 처리를 위해 아가로 오스를 강화합니다. 즉시 아가로 오스는 중합 것처럼 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> 망막 조각의 5 장착 <ol><li> 조심스럽게 페트리 접시에서 망막 조각을 포함하는 아가로 오스 블록을 제거합니다. 유리에서 아가로 오스 블록을 들어 올려 주걱 또는 유사한 장치를 사용하십시오. 때문에 접착 힘이 매우 어려운 것으로 판명 할 수 있습니다. 그러나, 파괴 방지아가로 오스 블록. 실온에서이 이후의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 유리 커버 슬립에 아가로 오스 블록을 놓고 메스 블레이드와 크기를 조정합니다. 망막 조각의 각 측면에 아가로 오스의 2mm - 1 둡니다. 블록의 최종 크기는 약 1,066mm이어야 (10mm 블록, 에지 길이 6mm의 높이를 말한다). </li><li> 순간 접착제를 사용하여 vibratome의 시험편 홀더에 아가 블록을 붙인다. 하부가 상기 홀더에 부착 된 상태에서 망막 부분은, 그 표면에 상기 10mm 높은 블록의 위쪽 및 배향과 평행에 위치한다. </li><li> vibratome의 버퍼 트레이에 이전에 버블 에임스 &#39;매체를 부어 바로 블록을 커버. </li></ol> 수평 Vibratome 섹션 6. 준비 <ol><li> 절편 시작합니다. 망막 조직의 조각이 조각에 나타날 때까지 처음에 수동으로 슬라이스의 두께를 설정합니다. 다음 단계 2.3의 설정을 변경할 수 있습니다. 이후아가로 오스 블록 당 3 조각 - 마우스 망막은 더 이상 2보다가있을 것입니다, 약 200 μm의 두께이다. </li><li> 유리 막대와 버퍼 트레이에서 섹션을 제거하고 35mm 페트리 접시에 2 ml의 에임스 &#39;매체로 전송. </li><li> 바로 37 °의 C (5 % CO 55분의 2 %의 O 2)에서 인큐베이터에 보관 섹션. 섹션을 둘러싸는 아가 인큐베이터 고체 유지되고 망막을 손상시키지 않고 부분을 처리하기 위해 사용될 수있다. RT에서 산소 에임스 중형에 비해 각각의 분위기 내에서 37 ℃에서 보관시 더 슬라이스 품질이 얻어진다. 섹션 바로 사용하거나 우수한 생리 결과 인큐베이터에서 4 시간까지 저장 될 수있다. </li><li> 6 - 아가 로스를 반복 섹션 4에서 다음 망막 조각을 포함. </li></ol>

<ol>
	<li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse.">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li><li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response.">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li><li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods.">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li><li>Singer, J. H., Lassov&#225;, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse.">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li><li>Peichl, L., Gonz&#225;lez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae:+a+comparison+of+rat,+mouse,+gerbil,+and+guinea+pig.">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+and+function+of+mammalian+horizontal+cells.">Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells.</a> Development of the Retina. , (1998).</li><li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light/dark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina.">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li><li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slice+preparation+of+the+retina.">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).</li><li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses.">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li><li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+(Commentary+on+Feigenspan+&amp;+Babai).">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan &amp; Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

세로 슬라이스와 달리 수평 무 축삭 세포 및 세포 등을 방사상 배향 뉴런의 수지상 형태가 잘 유지된다. 전체 망막 제제에 비해, 이들 세포 유형은 마이크로 전극에 대한 접근이 용이하고 전기 생리 두 이미징 기술에 의해 조사 할 수있다. 여기서는 외부 망막 집중; 그러나, 유사한 접근 방식은 특히 내부 망막 (10)의 무 축삭 세포가보고되고있다. 수평 슬라이...

시각 정보는 시각 활성화 동적 시공간 패턴으로 부호화되고, 감광체와 2 차 뉴런 사이의 시냅스 리본 시각 정보의 다운 스트림 전송을 결정한다. 포유류 망막의 수직 슬라이스 제조 즉 감광체 바이폴라 셀 사이, 및 바이폴라 전지 및 무 축삭 세포 1, 2, 3, 4의 일부 유형 사이에서 수직 통로에 신호 처리를 연구하는 매우 유용한 도구이다. 그러나, 수직 절편은 항상 시냅스 접촉의 상당한 손실로 이어지는, 많은 망막 신경 세포의 수지상 필드의 심각한 절단됩니다. 특히 외부 망막에, 수평 세포는 그들의 옆으로 퍼져 확장 된 수지상 필드와 축삭 터미널 시스템 (5)에 영향을 받는다. 수직에서슬라이스 제조 수평 셀의 돌기에 콘 감광체 단자 수백 시냅스 입력 따라서 약간 부족한 접촉 감소된다. 이것은 개별 시냅스의 특성을 연구하기에 충분할 수 있지만, 어떠한 수단은 감광체 리본 시냅스 동기 작동의 기초가되는 신호 처리 기능을 나타내는 않음으로써는 않는다. 따라서 우리는 그대로하고 기능적인 수평 세포의 수상 돌기에 거의 모든 콘 광 수용체의 시냅스 입력 잎 수평 슬라이스 준비를 개발했다. 절편 런 평면은 수평 적으로 무 축삭 세포와 세포 사이의 내부 핵 층을 절단하는 망막의 표면에 평행. 따라서, 외부 망막의 수평 슬라이스가 포함 생성, 시냅스 사이트, 시냅스 사이트의 내부 및 외부 세그먼트뿐만 아니라 시냅스 터미널, 수평 세포와 쌍극 세포 광 수용체. 이 준비는 잘 t을 적합오의 수지상 필드 내의 모든 콘 광 수용체에 의해 수평 세포의 수상 돌기에 통합 된 시냅스 입력을 조사합니다. 따라서 그것은 더 시냅스 반응에 감광체 활성화 매트릭스로부터 시각 정보 전송을위한 중요 감광체 리본 시냅스의 동작을 이해하는 데 유용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ames&#39; Medium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1420</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbogen</td>
			<td style="width:125px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35-mm petri dish (plastic)</td>
			<td style="width:125px;">Nunc Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:125px;">Chemoline</td>
			<td style="width:119px;">50-1470-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:125px;">Dispensary university hospital</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome injector blade</td>
			<td style="width:125px;">Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vibratome</td>
			<td style="width:125px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">VT1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vibrocheck</td>
			<td style="width:125px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water bath</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20-gauge needles</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Curved scalpel blades</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Pasteur pipette</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of horizontal slices of adult mouse retina for electrophysiological studies

세로 슬라이스 제제 아니라 성인 포유류 망막 회로 및 신호 전달을 연구하기 위해 설립된다. 이 제제에서 절편의 비행기는 광 수용체 및 양극성 세포와 같은 방사상 중심의 신경 세포의 연구에 이상적, 망막 표면에 수직이다. 그러나, 수평 세포, 넓은 필드 무 축삭 세포 및 신경절 세포의 큰 수지상 아버 이들 세포에서 현저하게 감소 시냅스 활성을두고 주로 절단된다. 신경절 세포 변위 무 축삭 세포는 망막의 전체 실장 준비 연구 될 수있는 반면, 수평 세포 및 내부 핵 층에있는 무 축삭 세포는 잘못 전체 망막 조직에 전극 용 접근 가능하다. 최대 접근성 시냅스 무결성을 달성하기 위해 마우스 망막의 수평 조각 제제를 개발 및 감광체 및 수평의 시냅스에서 신호 전송 공부세포. 수평 절편 수평 세포의 수상 돌기에 손상 및 기능 콘 시냅스 입력을위한 전제 조건으로, 전극 타겟팅 수평 세포 기관 (1) 간단하고 명확한 시각적 식별 및 확장 된 수평 세포 수지상 필드 (2) 보존 할 수 있습니다. 수평 조각에서 수평 세포는 어둠 속에서 토닉 시냅스 활성을 나타내, 그들은 안쪽으로 전류 감소 시냅스 활동의 감소와 빛의 섬광을 브리핑하는 반응. 면역 세포 화학 증거는 수평 세포의 수지상 분야 내에서 거의 모든 콘이 그 주변 수상 돌기과 시냅스를 설정을 나타냅니다. 수평 슬라이스 준비 따라서 잘 선택 시냅스에 걸쳐 수평으로 확장 망막 신경 세포의 생리 학적 특성뿐만 아니라 감각 신호 전송 및 통합을 연구하기에 적합합니다.

<html> 마우스 망막의 수평 슬라이스에서, 수평 세포 기관을 쉽게 다각형 세포체 (그림 1A)에서 나오는 여러 주요 수상 돌기과의 독특한 형태에 따라 식별 할 수 있습니다. 슬라이스의 표면 근처에있는 수평 세포 기관은 패치 클램프 전극 용 일상적으로 접근 할 수 있었다. 녹음하는 동안 세포는 밀접 그대로 마우스 망막 8 (그림 1B)의</strong...

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Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K 조회수.  Friedrich-Alexander-University (FAU) Erlangen-Nürnberg.  우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다. 

비디오: Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

전체 두께 성인 돼지의의 망막의 Organotypic 문화

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...