이 연구는 다음과 같은 NIH 보조금의 지원을 받았습니다: NIH 보조금 R01EY031596(C.M.에게); NIH 보조금 R01EY029985(CM에게); NIH 보조금 P30EY010572(CM에게); NIH 보조금 R01EY032564(학사에게). 망막 절편 준비에 대한 기술적 지원을 아끼지 않은 Tammie Haley와 이 작업에 사용된 mRNA FISH 프로브를 아낌없이 제공한 Charles Allen 박사에게 감사드립니다.

Studying Bipolar and Horizontal Neuronal cells in the murine split retina(쥐 분할 망막의 양극성 및 수평 신경 세포 연구)

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	<li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina.">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li><li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+bipolar+cells:+elementary+building+blocks+of+vision.">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li><li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+analysis+reveals+an+interneuron+with+an+integral+role+in+the+retinal+circuit+for+night+vision.">Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision.</a> eLife. 9, 56077 (2020).</li><li>Janssen-Bienhold, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin57+is+expressed+in+dendro-dendritic+and+axo-axonal+gap+junctions+of+mouse+horizontal+cells+and+its+distribution+is+modulated+by+light.">Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+excitation+and+inhibition+in+the+dendrites+of+mouse+direction-selective+ganglion+cells.">The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells.</a> eLife. 9, 52949 (2020).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability,+affinity,+and+chromatic+variants+of+the+glutamate+sensor+iGluSnFR.">Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR.</a> Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).</li><li>Strauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Center-surround+interactions+underlie+bipolar+cell+motion+sensitivity+in+the+mouse+retina.">Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina.</a> Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+in+vivo+imaging+of+GABA.">A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA.</a> Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).</li><li>Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+Proton-Mediated+Inhibitory+Feedback+at+the+Retinal+Horizontal+Cell-Cone+Synapse+with+Genetically-Encoded+pH+Probes.">Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).</li></ol>

저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.

광수용체가 광자 흡수를 신경전달물질 방출로 변환한 후, BC와 HC는 시각 신호를 처리하는 최초의 망막 뉴런이다23. 이러한 뉴런의 중요성은 잘 알려져 있지만, 뉴런의 기능 중 많은 부분이 불완전하게 이해되거나 완전히 탐구되지 않았습니다. 많은 BC 및 HC 생리학 연구는 측면 연결성을 유지하면서 INL 뉴런에 대한 접근을 개선하는 플랫마운트 망막 제제의 이점을 누릴 수 있습니다. 분할 망막 분석법의 개발은 플랫마운트 방향에서 BC 및 HC로부터 고품질 전기생리학적 기록 및 현미경 데이터를 수집하기 위한 간편한 프로토콜을 제공하기 위한 노력의 일환입니다. 여기에 설명된 분할 망막 제제는 특수 장비를 사용하지 않고 망막 분리 후 마우스당 약 20분(망막당 10분)에 수행할 수 있습니다. 이 방법은 기존의 광수용체 제거 절차에서 영감을 얻었지만 단순성, 속도 및 다양성 면에서 상당한 개선을 제공합니다 4,10,11,12,13. 망막층을 분리하는 이전 방법과 달리 망막 분할은 동결, 동결건조 또는 망막에 접착제를 반복적으로 도포할 필요가 없습니다. 실제로 거의 모든 광수용체는 니트로셀룰로오스 막으로 한 번의 찢어짐으로 제거할 수 있습니다. 이 접근법의 속도와 용이성은 망막이 탄화된 에임에서 소비하는 시간을 최소화하여 장기간 높은 세포 생존력을 가능하게 합니다. 쪼개진 망막은 쪼개진 후 몇 시간 동안 탄수화된 Ames 배지에서 유지될 수 있습니다. 이 제제에서 INL 뉴런의 건강에 대한 증거로, 살아있는/죽은 세포 염색(그림 4)과 패치 클램프 전기생리학(그림 6)을 통해 분할 후 적혈구 및 HC의 생존력을 확인할 수 있습니다.
분할된 망막에서 광수용체층을 제거하면 항체가 INL로 확산되는 시간을 크게 줄임으로써 면역 표지 중에 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 1차 및 2차 항체 라벨링은 2시간 이내에 완료할 수 있으며, 이는 표적 5,6,7,8,20,22 에 따라 72시간 이상 소요될 수 있는 기존 플랫마운트 염색에 비해 크게 개선된 것입니다. 그 결과, 조직 준비와 같은 날에 현미경 데이터를 획득할 수 있어 면역형광 실험의 속도를 크게 높일 수 있습니다. mRNA 프로브 어닐링을 용이하게 하기 위해 FISH 실험은 일반적으로 면역 표지보다 훨씬 더 긴 고정 시간(~24시간)을 권장합니다18. 그러나 여기에 제시된 실험은 2시간 고정이 여전히 예외적인 FISH 라벨링을 생성한다는 것을 보여줍니다(그림 5). 고정 시간을 30분에서 2시간으로 연장했음에도 불구하고 우수한 면역 표지를 얻기 위해 항원 회수 단계를 수행할 필요가 없었지만 이는 항체 또는 항원에 따라 다를 수 있습니다. FISH 프로토콜의 프로테아제 처리는 표적 항원결정기(epitope)의 파괴로 인해 항체 표지를 방해할 수 있습니다. 이 문제는 여러 에피토프를 표적으로 하는 다클론 항체를 사용하여 에피토프 파괴가 면역 표지를 방해할 가능성을 줄임으로써 우회되었습니다. 또한, 충분한 조직 침투를 제공하면서 과도한 에피토프 변경을 방지하기 위해 중등도 프로테아제 처리(ACD 프로테아제 III)를 사용했습니다.
때때로, 망막은 대신 외부 핵층(ONL)을 통해 분열되어 INL 세포가 보이지 않는 광수용체 층을 남깁니다. 이를 방지하려면 망막이 유리 위에 완전히 평평하게 놓여 있는지 확인하고 망막 주변의 잔류 액체를 제거해야 합니다. 붓으로 니트로셀룰로오스를 더 세게 누르면 ONL이 쪼개지는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 막이 너무 젖거나 망막이 접히면 성공적인 분할의 가능성이 크게 줄어 듭니다. DAPI를 사용하여 세포핵을 염색하는 것은 분할의 품질을 평가하고 나머지 광수용체의 커버리지를 결정하는 데 유용합니다. 광수용체 핵은 더 작고, 더 밝고, 더 표면적인 반면(보충 그림 3A), BC 핵은 더 크고, 더 어둡고, 더 깊습니다(보충 그림 3B). 어떤 경우에는 망막 조각에 따라 찢어진 면이 약간 달라져 광수용체 세포체가 완전히 제거되지 않은 패치가 생깁니다(보충 그림 3C). 현미경 검사 및 전기 생리학 응용 분야의 경우, 이는 광수용체가 적절하게 제거된 영역에서 고품질 데이터를 수집하는 능력을 방해하지 않습니다. 노출된 내부 망막의 넓은 필드는 패치 피펫으로 이미징하거나 기록할 때 쉽게 찾을 수 있습니다. 보다 완전한 광수용체 제거가 필요한 경우 100% 광수용체 제거가 보장되지는 않지만 니트로셀룰로오스 막을 추가로 사용하여 두 번째 절단을 수행할 수 있습니다. 따라서 잔류 광수용체 물질이 결과에 영향을 미칠 수 있는 유전자 발현 또는 단백질체학 연구에서 분할 망막을 사용할 때는 주의가 필요합니다. 단일 세포 응용 분야의 경우 광수용체의 데이터가 분석에서 제외될 수 있으므로 이러한 우려는 부당합니다.
분할 망막 준비의 장점은 아마도 광시야 인터뉴런의 전기생리학적 기록에서 가장 두드러질 것입니다. 전통적인 수직 슬라이스가 광시야 세포의 광범위한 과정을 절단하는 반면, 분할 망막 준비는 OPL 및 IPL을 그대로 두어 수직 슬라이스에서 간과될 수 있는 HC(24), A17s(25), TH ACs(26) 및 NOS-1 ACs(27)와 같은 광시야 세포의 입력을 캡처할 수 있습니다. 따라서 결과를 해석하고 망막 절편에서 수집된 이전 데이터와의 비교는 신중한 생각이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 빛 자극의 약리학적 모방을 이용한 실험에서, 이러한 결과는 망막 절편으로부터 기록된 데이터와 유사하다19. 세포 특이적 프로모터 하에서 ChR2를 발현시킴으로써, 원하는 세포 집단을 자극하는 동시에 INL의 BC에서 기록하여 원하는 세포가 수직 정보 경로에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다. 무축삭 세포와 같은 더 깊은 INL 뉴런에서 직접 기록하는 것도 분할 망막에서 가능합니다. 이 경우 패치 전극은 먼저 더 피상적인 INL 뉴런을 통과해야 하지만, 기존의 전체 마운트 준비와 비교할 때 경로를 방해하는 조직이 상당히 적습니다.
다른 뉴런에 대한 광시야 세포의 영향을 측정하는 것 외에도, 이 방법은 수상돌기가 OPL28에서 광범위한 갭-접합 결합 네트워크를 형성하는 HC로부터 직접 단일 세포 패치 클램핑을 가능하게 합니다. 수평 세포는 망막을 통한 수직 정보 전달을 형성하는 광수용체에 중요한 피드백을 보냅니다. 그러나 HC의 수지상 필드는 수직 슬라이스에서 잘리기 때문에 단일 세포 기록 데이터가 부족합니다. 이 연구는 해부학적으로나 생리학적으로 온전한 HC를 보여주며, 여기서 ChR2 유발 전류가 삼중 형질전환 마우스 라인에 기록됩니다(그림 6 CE). ChR2 자극 외에, 분할 망막은 내인성 HC 전류 및 간극 접합 커플링(28)을 연구하는데 사용될 수 있다. 분할 망막은 화학적 적용 또는 ChR2 자극에 의해 유도된 시냅스 연결성 및 신경 활동을 연구하기 위한 편리한 모델을 제공하지만, 광수용체가 없기 때문에 자연광 반응 또는 빛 적응 메커니즘에 대한 직접적인 탐구는 불가능합니다.
망막의 현장 이미징은 최근 몇 년 동안 놀라운 발전을 이루었습니다. 그러나, 대부분의 이미징 연구는 전체 마운트 망막 제제의 신경절 세포층에 국한되어있다 29. 저자들은 분할 망막에 광수용체가 없기 때문에 OPL 및 INL에서 살아있는 칼슘 이미징에 이상적인 모델이 될 것으로 예상합니다. 칼슘 이미징 외에도 이 모델은 iGluSnFR30,31, iGABASnFR32 및 pHluorin 33과 같은 유전적으로 인코딩된 바이오센서와 함께 사용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 분할 망막 제제와 결합된 이 강력한 도구는 망막의 광 처리에 기여하는 BC 및 HC의 시냅스 상호 작용 및 생물물리학적 특성을 탐구하는 효율적인 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

망막은 눈 뒤쪽에 위치한 얇은 신경 조직으로, 빛을 가로채서 뇌가 해석할 수 있는 전기화학적 신호로 처리합니다. 망막의 뒤쪽에 있는 간상체와 원추세포 광수용체는 빛에 의해 자극되어 신경전달물질인 글루타메이트1의 긴장성 방출 속도를 감소시킵니다. 빛에 의해 유도된 글루타메이트 농도 변화를 경험하고 반응하는 첫 번째 뉴런은 양극성 세포(BC)와 수평 세포(HC)이며, 이들의 소마는 내부 핵층(INL)의 가장 바깥쪽 영역에 있습니다. 이 2차 뉴런은 망막에서 신호 처리의 첫 번째 단계를 수행하고 빛 적응, 대비 감도 및 공간/색 적응과 같은 시각의 중요한 특징을 형성합니다2. 이러한 기능은 BC와 HC에 기인하지만, 이러한 과정의 기초가 되는 회로 및 생화학적 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다3. 따라서 BC 및 HC 생리학을 탐구하기 위한 도구와 방법의 발전이 가장 중요합니다.
수직(횡) 망막 절편은 BC와 HC를 연구하기 위한 가장 실용적인 모델임이 오랫동안 입증되었습니다. 그러나 BC 및 HC 생리학의 특정 측면은 이 모델에서 실험자가 접근할 수 없습니다. HC의 직접 기록 또는 BC에 대한 효과의 간접 측정은 이러한 세포의 측면 돌기가 절단되는 동안 절단되기 때문에 망막의 내인성 연결성을 반영하지 않습니다. 전체 망막 제제는 이러한 측면 돌기를 보존함으로써 이 문제를 피할 수 있지만, 주변 망막층은 이러한 세포에 접근하는 데 어려움을 초래합니다4. 전체 마운트 망막의 INL 뉴 런에서 면역염색 5,6,7,8 및 패치 클램프 기록9의 예가 풍부하지만, 이러한 데이터 수집을 촉진하고 단순화할 수 있는 기회가 있습니다. 따라서 횡단 단면의 고유한 한계와 전체 마운트 모델의 과제는 이 대체 플랫마운트 망막 제제의 개발에 영감을 주었습니다.
다음 연구에서는 살아있는 편평 망막에서 광수용체 층을 쉽게 제거하여 BC 및 HC에 대한 접근성을 향상시켜 패치 클램핑을 단순화하고 더 빠르고 효율적인 면역 표지를 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 분리된 망막의 양쪽에 부착된 두 개의 니트로셀룰로오스 막을 떼어내면 광수용체 축삭돌기를 통해 조직이 찢어져 망막 바깥쪽 망상층(OPL)과 모든 안쪽 망막층을 유지하는 망막이 갈라집니다. 다른 사람들은 망막의 층을 기계적으로 분리하기 위한 프로토콜을 설명했지만, 이러한 방법은 패치 클램핑 및 현미경 검사 응용 분야에 적합하지 않거나 지루한 조직 조작이 필요합니다. 이러한 방법 중 일부는 층 분리를 위해 동결 또는 동결건조된 조직을 필요로 하므로 전기생리학 실험10,11,12와 호환되지 않습니다. 다른 것들은 살아있는 조직을 위해 설계되었지만 광수용체를 제거하기 위해 여과지 4,11로 5-15 번의 순차적 박리 또는 트립신 13으로 처리해야합니다. 여기에 설명된 기술은 광수용체 제거 절차를 단순화하고 다운스트림 응용 분야의 레퍼토리를 확장하여 이전 기술을 개선합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 pairs of Dumont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 nm LED</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>M470L2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-306 curved scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; disposable pasteur pipetes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai80d mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>25109</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:025109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium w/L-Glutamate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1372-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier control software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10.3 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calbindin D28K antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA-5 85669</td>
			<td>RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612044</td>
			<td>RRID:&#160; AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GPR179 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4334</td>
			<td>RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc8393 AF594</td>
			<td>RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610495</td>
			<td>RRID:&#160; AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RGS11 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX;&#160; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin P38 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-S5768</td>
			<td>RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquamount mounting media</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>13800</td>
			<td>slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>000664</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:000664</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbogen tank</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NA</td>
			<td>95% O2 and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom transfer pipette</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitical optical power meter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>&#160;PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS, BX50WI</td>
			<td>Dodt gradient contrast microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 40x/1.3&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 63x/1.40&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Robbins Scientific</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>for RNAscope protocol only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immedge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe (delicate task wipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 X confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium 15 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060-60</td>
			<td>eyes are kept here during retina dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merit 97-275 steel scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm-Gabrd-C2 mRNA probe</td>
			<td>ACD</td>
			<td>459481-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse euthanasia chamber</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>custom build; glass petri dish covering a small glass jar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences; Whatman</td>
			<td>7184-005</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>General Valve Corporation</td>
			<td>Picospritzer II&#160;</td>
			<td>referred to in the text as microcellular injection unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-603</td>
			<td>for connection to carbogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum harp</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>size 0 paint brush</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>for flattening retina during splitting.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36937&#160;</td>
			<td>referred to in the text as anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small 10 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>eyes are placed here following enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small glass pane (7.5 cm x 5 cm)</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>electrostatically-charged glass microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors; straight</td>
			<td>Titan Medical</td>
			<td>TMS121</td>
			<td>not brand specific; any comparable scissors will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGATFLPo mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>29591</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:029591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGlut2Cre mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>28863, 016963</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423105</td>
			<td>referred to in the text as MI-NIR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina

척추동물 망막의 양극성 세포와 수평 세포는 광수용체에 의해 광자가 감지된 후 시각 정보를 처리하는 최초의 뉴런입니다. 그들은 빛 적응, 대비 감도, 공간 및 색상 할당과 같은 기본 작업을 수행합니다. 그들의 행동을 지배하는 정확한 회로와 생화학적 메커니즘에 대한 완전한 이해는 시각 신경 과학 연구와 안과 의학을 발전시킬 것입니다. 그러나 양극성 및 수평 세포(망막 전체 마운트 및 수직 절편)를 검사하기 위한 현재 준비는 이러한 세포의 해부학적 구조 및 생리학을 포착하는 능력에 한계가 있습니다. 이 연구에서는 살아있는 편평한 쥐 망막에서 광수용체 세포체를 제거하여 효율적인 패치 클램핑 및 신속한 면역 표지를 위해 양극성 및 수평 세포에 대한 접근성을 향상시키는 방법을 제시합니다. 쪼개진 망막은 두 개의 니트로셀룰로오스 조각 사이에 분리된 쥐 망막을 끼운 다음 부드럽게 벗겨서 준비합니다. 분리는 망막을 바깥쪽 망상층 바로 위로 분할하여 광수용체 세포체를 포함하는 니트로셀룰로오스 조각과 나머지 내부 망막을 포함하는 두 조각을 생성합니다. 수직 망막 절편과 달리 분할 망막 제제는 내부 망막 뉴런의 수지상 돌기를 절단하지 않으므로 간극 접합 결합 네트워크 및 광시야 무축삭 세포의 기여를 통합하는 양극성 및 수평 세포의 기록이 가능합니다. 이 연구는 전기생리학, 면역조직화학 및 제자리 교잡 실험에서 수평 및 양극성 세포 연구를 위한 이 준비의 다양성을 보여줍니다.

The retina is a thin neural tissue located in the posterior eye where light is intercepted and processed into an electrochemical signal that can be interpreted by the brain. At the back of the retina, rod and cone photoreceptors are stimulated by light, which reduces the tonic release rate of the neurotransmitter, glutamate1. The first neurons to experience and respond to this light-induced change in glutamate concentration are the bipolar cells (BCs) and horizontal cells (HCs), whose somas reside in the outermost region of the inner nuclear layer (INL). These second-order neurons perform the first stage of signal processing in the retina and shape critical features of vision such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial/color opponency2. While these functions have been ascribed to BCs and HCs, the circuitry and biochemical mechanisms underlying these processes are not fully understood3. Therefore, the advancement of tools and methods for exploring BC and HC physiology is of paramount importance.
Vertical (transverse) retina sections have long&#160;proven the most practical model for studying BCs and HCs; however, certain aspects of BC and HC physiology are inaccessible to the experimenter under this model. Direct recordings from HCs or indirect measurements of their effects on BCs do not reflect the retina&#39;s endogenous connectivity since the lateral processes of these cells are severed during slicing. Whole mount retina preparations circumvent this issue by preserving these lateral processes, but the surrounding retinal layers pose a challenge for accessing these cells4. While there are abundant examples of immunostaining5,6,7,8 and patch clamp recordings9 from INL neurons in whole mount retinas, there is an opportunity to expedite and simplify the collection of these data. The inherent limitations of transverse sections and the challenges of the whole mount model thus inspired the development of this alternative flatmount retina preparation.
The following work describes a protocol for easily removing the photoreceptor layer from live, flatmount retinas to enhance access to BCs and HCs for simplified patch clamping and faster, more efficient immunolabeling. Peeling apart two pieces of nitrocellulose membrane attached to either side of an isolated retina tears the tissue through the photoreceptor axons, leaving a split retina that retains the outer plexiform layer (OPL) and all inner retinal layers. While others have described protocols for mechanically separating layers of the retina, these methods are either poorly suited to patch clamping and microscopy applications or require tedious manipulation of the tissue. Several of these methods require frozen or lyophilized tissue for layer separation, making them incompatible with electrophysiology experiments10,11,12. Others are designed for live tissue, but necessitate 5-15 sequential peels with filter paper4,11 or treatment with trypsin13 to remove the photoreceptors. The technique described here improves upon its predecessors by simplifying the photoreceptor removal procedure and expanding the repertoire of downstream applications.

저자 스포트라이트: 접근성 향상 및 실험 가속화를 위한 Split Retina 기법 사용 

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

Our group is interested in the neuronal circuitry and synaptic mechanisms underlying visual processing in the retina. The Morgans Lab is investigating molecular mechanisms of light adaptation in bipolar cells, and the Sivyer Lab is interested in how inner retinal neurons contribute to ganglion cell function. Accessing internuclear layer neurons in whole mount retina is a challenge for both anatomical and physiological studies.Internuclear layer neurons are accessible in vertical sections, but they're very few neurons in the field of view. Furthermore, slicing severs lateral processes and connections which can impact physiological studies. The removal of the photoreceptors in the split retina technique dramatically improves antibody diffusion into the inner retina, which makes immunolabeling of inner retinal targets over 20 times faster when compared to traditional whole mount retina.The split retina also greatly improves access to internuclear layer neurons during patch clamp electrophysiology. The split retina technique will open doors to new approaches and accelerate the pace of our experiments. For example, we plan to use this technique to study bipolar cell inputs to melanopsin ganglion cells by expressing channelrhodopsin in the bipolar cells.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Split Retina Technique for Enhanced Access and Accelerated Experiments at JoVE.com

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by ...

우리 그룹은 망막의 시각 처리의 기초가 되는 신경 회로와 시냅스 메커니즘에 관심이 있습니다. Morgans Lab은 양극성 세포에서 빛 적응의 분자 메커니즘을 연구하고 있으며, Sivyer Lab은 내부 망막 뉴런이 신경절 세포 기능에 어떻게 기여하는지에 관심이 있습니다. 망막 전체에 있는 핵간층 뉴런에 접근하는 것은 해부학적 연구와 생리학적 연구 모두에서 어려운 과제입니다.핵간 층 뉴런은 수직 섹션에서 접근할 수 있지만 시야에는 매우 적은 수의 뉴런이 있습니다. 또한 슬라이싱은 생리학적 연구에 영향을 미칠 수 있는 측면 돌기와 연결을 절단합니다. 분할 망막 기법에서 광수용체를 제거하면 내부 망막으로의 항체 확산이 크게 향상되어 기존의 전체 망막 전산 망막에 비해 망막 내부 표적의 면역 표지가 20배 이상 빨라집니다.분할 망막은 또한 패치 클램프 전기 생리학 동안 핵 간 층 뉴런에 대한 접근을 크게 향상시킵니다. 분할 망막 기술은 새로운 접근 방식의 문을 열고 실험 속도를 가속화할 것입니다. 예를 들어, 우리는 이 기술을 사용하여 양극성 세포에서 채널로돕신을 발현하여 멜라놉신 신경절 세포에 대한 양극성 세포 입력을 연구할 계획입니다.

split-retina-as-an-improved-flatmount-preparation-for-studying-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

1.9K 조회수.  Oregon Health and Science University. 우리 그룹은 망막의 시각 처리의 기초가 되는 신경 회로와 시냅스 메커니즘에 관심이 있습니다. Morgans Lab은 양극성 세포에서 빛 적응의 분자 메커니즘을 연구하고 있으며, Sivyer Lab은 내부 망막 뉴런이 신경절 세포 기능에 어떻게 기여하는지에 관심이 있습니다. 망막 전체에 있는 핵간층 뉴런에 접근하는 것은 해부학적 연구와 생리학적 연구 모두에서 어려운 과제입니다.

비디오: 저자 스포트라이트: 접근성 향상 및 실험 가속화를 위한 Split Retina 기법 사용 

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.