We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

프로토콜은 아래의 C57BL / 6 및 C3H / 그는 (retinally 퇴화) 마우스의 신경 조직의 제조 방법을 설명하지만, 유사한 기술들이 다른 종에도 적용 할 수있다. 모든 동물은 건강하고 표준 온도 조건, 습도, 12 시간 조명 / 어두운주기, 음식과 물을 무료로 이용할 취급했고, 어떤 의도 스트레스 자극없이. 모든 실험 승인 및 웨스턴 시드니 대학 동물 관리 및 윤리위원회에 따라 수행하고 동물 사용 및 관리 지침 (동물 연구 기관 # A9452, # A10396 및 #의 A8967)에 따라되었다. 1. 뇌 조각 준비 <ol><li> 이소 플루 란 (5 %)의 흡입에 의해 동물을 마취 및 설치류 단두대를 사용하여 목을 벨. 이전 9 설명한대로, 신속하게 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 생리 솔루션 (ACSF) (단위 : mm)를 포함 넣 : 125 염화나트륨,의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2를 25 2.5의 KCl, 1NaHCO3을 25 덱 스트로스 carbogen 포화 (95 % O 2 / 5 % CO 2 혼합물 310 mOsm하여 pH 7.4). </li><li> 진동 마이크로톰 300 μm의 두께, 관심 영역에서 뇌 조각을 잘라. </li><li> 이전 10 11 바와 같이 carbogen 흐름 및 온도 - 밀접하게 모니터링하여 pH 수준 (7.4의 pH 7.2)을 제어 주문품 배양 시스템 슬라이스 전송. </li><li> 15 ~ 35 ° C로 초기 챔버 온도를 설정 - 30 분, 천천히 15로 감소 - 그림 1C에서와 같이 16 ° C. 필요할 때까지 다음 중 전기 생리학 또는 이미징, 배양 시스템에서 슬라이스를 품어. 참고 : 슬라이스가 칼슘 이미징에 사용하는 경우, RT 아래 조직을 냉각하기 전에 다음 단계를 수행합니다. </li></ol> 2. 망막 Wholemount 준비 및 내부 경계 막 제거 <ol><li> 두 정상에서 망막 wholemounts을 준비실험실 조명 조건이나 어두운 레드 / 적외선 빛. </li><li> 자궁 경부 전위 즉시 명백히하다 눈으로 동물을 안락사. 에임스 미디어, 또는 ACSF 포함하는 하나의 작은 오라 세라 따라 잘라 내기, 장소 (MM) 확인 : (125)의 NaCl을, 25의 NaHCO3, 3의 KCl, 2 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2, 10 글루코스, 0.5 L 글루타민, 및 carbogen로 포화 (2 / 5 % CO 2 혼합물을 95 % O; ~ 300 mOsm하여 pH 7.4)에서 RT. </li><li> 즉시 작은 가위로 오라 세라 따라 절단 집게로 렌즈와 유리체를 제거하여 각막, 렌즈 및 유리체를 제거합니다. 실온에서 배양 시스템에서 조직을 놓습니다. 참고 : 망막 조직이 15 느린 온도 감소 후, 눈 컵에서 유지 될 수있다 - 필요할 때까지 배양 시스템에서&gt; 24 시간 동안 16 ° C. </li><li> Earl&#39;s- 30 U / mL의 파파인, 1 MM의 L - 시스틴, 0.5 mM의 EDTA와 0.005 %의 DNase의를 포함하는 작은 유리 항아리에 망막을 포함한 눈 컵을 전송의 ILM을 제거하려면20 분 동안 37 ° C에서 균형 소금 용액 (BSS). 뚜껑을 통해 용액에 95 % O 2 / 5 % CO 2를 적용하지만 거품하지 않습니다. 젊은 동물 (&lt;6 주)에서 조직을 사용하는 경우, 반 강도 솔루션을 희석. <ol><li> 얼 BSS에서 10 분 동안 ovomucoid (10 ㎎ / ㎖) 및 BSA (10 ㎎ / ㎖) 용액에 조직을 배치하여, 소화 효소를 중지. 16 ° C - 워시 조직을 철저하게 ACSF와 배양 시스템에 전송하기 전에 15에 온도를 줄일 수 있습니다. </li></ol></li><li> 필요할 때까지 눈 컵에서 망막 조직을 유지한다. 현미경에 전송, 눈 컵에서 망막을 분리하고 면도칼 4 조각으로 잘라. 전체 망막이 필요한 경우에는 평평 할 수 있도록 망막의 주위에 4 개의 작은 상처를 만든다. 참고 : 이미징 실험, 배양 시스템에 전송하기 전에 칼슘 염료와 부하 내용은 아래를 참조하십시오. </li></ol> 3. 인큐베이터에서 조직을 유지 <ol><li&gt; pH와 온도 측정 용 프로브 (그림 1A, B)를 포함하는 메인 챔버에 넣어 조직. </li><li> 용액에 떠있는 박테리아를 방사하다하기 위해 (5W / 2P 살균기 UV 램프, 254 ㎚) 주 챔버로부터 분리 및 UVC 빛 W 1.1에 노출 (이전 12 설명한 바와 같이 내장, UVC 실) 두 번째 챔버를 통해 ACSF를 순환 (그림 1A). ACSF의 과열을 방지하기 위해 30 분 - 15 분마다 15 사이에 26 다양한 시간에 ON이 임의의 기능을 사용하여 프로그램 타이머를 통해 제어 UVC 빛 타이밍. </li><li> 12 mL의에 UVC 챔버 내의 유량을 설정 / 분으로 12 이전보고 하였다. 신경 조직을 손상시킬 수있는 챔버, UVC 외부 조명을 방지하는 알루미늄 호일로 UVC 챔버 커버. 주 : 어두운 적응 망막 조직의 경우, 빛을 제외 할 주요 챔버로 맞춤 커버를 적용합니다. </li><li> circula하는 연동 펌프를 사용하여TE 두 챔버를 통해 용액 (ACSF)와 0의 범위 내의 원하는 온도로 냉각 또는 주 챔버를 가열하거나 냉각 기능 펠티에 열전 냉각 판 - 50 ° C. 장기 생존을위한 16 ° C - 최적의 조직 배양를 들어, 15을 사용합니다. </li></ol> 4. 칼슘 염료로드 <ol><li> 개별 연구자의 선호도에 따라 칼슘 염료를 선택합니다. 여기에서 우리는의 Fura-오전 2시, FLUO-오전 8시 또는 FLUO-오전 4시를 사용합니다. 그러나,이 방법은 또한 다른 염료에 적용될 수있다 : 1 mM의 용액 및 1 %의 블록 공중 합체에 DMSO 칼슘 염료를 용해 (예를 들어, 플루로 닉 산 (127))를 10 분 동안 최종 50 μL의 부피 및 초음파 처리한다. </li><li> 망막 10 μM, 뇌 조각 0.01 %의 블록 공중 합체, 및 20 μM (망막), 0.02 %의 블록 공중 합체의 최종 농도로 용액 ACSF 추가. F 37 ° C (의 Fura-2 AM) 또는 실온에서 (FLUO-4를 오전 젊은 동물, 45 분 동안 화장실에 부하로부터 망막 (파파인 치료) 및 뇌 조각에서루오-8 AM). <ol><li> 성인 동물 (&gt; 12 주)에 대한 직접 뇌 조각 위에 염료 (50 μL)를 피펫, 그리고 깊은 층에 염료를 더 잘 침투 할 수 있도록 75 분 동안 유지한다. </li><li> 염료 배양 동안 침수 슬라이스의 충분한 산소를 보장하기 위해, ACSF 2.5 mL에 희석 칼슘 염료와 닫힌 뚜껑 (직경 2.5 cm의 원형 항아리, 3.5 cm 높이)와 유리 로딩 챔버를 준비합니다. 95 % O 2 / 5 % CO 2으로 연속적 네이트. 거품하지 마십시오. </li></ol></li><li> 실험 사용할 때까지 16 ° C - 염료로드를 따라 천천히 15 온도를 감소 배양 시스템에 ACSF 및 전송과 조직을 씻는다. </li></ol> 5. 전기 생리 녹음 및 이미지 <ol><li> 현미경 침수 기록 챔버 내에서 조직을 배치하고, (4)의 유량으로 산화 된 ACSF으로 관류 - RT (~ 22 ° C) 또는 생리적 온도에서 5 mL / 분 중 (~ 35 ° C). 홀리신장과 금 또는 백금 와이어의 U 자 모양의 조각을 통해 접착 나일론 골드 스레드로 만든 &#39;하프&#39; &#39;만든 사용자 정의를 사용하여 장소에 D 조직. </li><li> 전기 생리학의 경우 : <ol><li> 5-6 MΩ의 최종 저항을 달성하기 위해 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 1.5 mm (1.19 mm의 ID) 붕규산 유리에서 기록 피펫을 준비합니다. </li><li> 이전 13 설명 된 바와 같이 내부 솔루션의 4 μL와 CCD 카메라를 사용하여 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC)에서 세포를 시각화 - 3 피펫을 입력합니다. 세포 내 용액을주의 깊게 실험 결과를 달성하기 위해 각각의 실험에 맞게 조정되어야한다. </li><li> 위치 피펫 양압을 유지하면서 미세 조작기를 이용하여 세포막에 피펫 홀더 흡입구를 통해서 주어지는. ILM이 망막에서 제거 된 이후, 더 이전에 막 스크래핑 필요가 없습니다. 피펫은 셀되면, 부드러운 음을 적용피펫에 압력이 기가 옴 밀봉을 달성했다. 이어서 부압 짧은 양의 세포막을 파열. </li><li> 해당 표준 기술을 사용하여 전체 셀 전류 또는 전압 클램프 녹음을합니다. </li></ol></li><li> 칼슘 이미징 : <ol><li> 의 Fura-2의 비율 적 이미징, 340 nm 내지 380 nm 인 여기 파장을 제공하는 초고속 파장 스위처를 사용한다. 510 ± 20 ㎚의 방출 필터를 사용하여 각 셀로부터 방출 된 광을 전달하고 고감도, 고속 디지털 카메라로 촬영. </li><li> 550 nm의 대역 통과 필터 - 515 내지 490 nm의 대역 통과 필터 및 출사 광 - FLUO-4, 필터의 여기 광 460 내지 단일 여기 파장. 가장 빠르고 가장 민감한 녹화 등의 고속 디지털 카메라를 사용합니다. 필요에 따라 이미지를 획득. </li><li> 시간의 함수 중 어느 하나의 파장 (FLUO-4) 또는 파장 비율을 이용로 형광의 변화를 측정방법은 (는 Fura-2), 미리 14 8 바와 같이. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3.">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves.">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li><li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina.">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396 (2014).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina.">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588 (2015).</li><li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells.">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li><li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue.">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li><li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons.">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braincubator:+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology.">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li><li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Device+for+storing+a+tissue+sample.">Device for storing a tissue sample.</a> WIPO Patent. , (2015).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li><li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices.">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

이 문서함으로써 실험 목표를 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄이고, 이미징 및 전기 생리학 실험에 급성 신경 조직의 생존을 연장하는 배양 방법을 설명합니다. 두 가지 방법은 시간에 신경 조직의 열화 관장 : ⅰ) 증가 박테리아 수준 및 방출 박테리아 독소의 동반 증가 및 외상성 슬라이싱 절차 (10)를 다음과 ⅱ) 흥분 독성. 급성 신경 조직 환경 무방비 바와 같이, 산도, 온도,...

전기 생리학 및 기능적 영상 (칼슘, 전압 감응 염료) 신경에 가장 일반적으로 사용되는 실험 기술이있다. 뇌 슬라이스 준비하고 여기에 검사됩니다 망막 wholemount은 마취제 나 근육 이완제에서 오염없이 전기 생리 특성과 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공합니다. 뇌 슬라이스와 망막의 특정 회로 뇌 네트워크 (1)의 연구를 허용, 문화 또는 세포 균질 달리 구조적 무결성을 유지 wholemount. 격리 된 조직에서 녹음은 심장 박동 및 호흡과 관련된 운동으로 생체 내 녹음을 통해 이점을 제거해야합니다. 또한, 직접 시각화 대상이되는 세포의 특정 클래스 및 약리 도구 2, 3의 로컬 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 패치 클램프 녹음 및 CALCIUM은 로딩 염료 망막 wholemount에는 망막 신경절 세포 (RGC) 층을 포함하고, 세포에 직접 액세스를 방지 멤브레인 (ILM)를 제한 이너의 존재에 의해 복잡하다. 일반적으로이 멤브레인은 하나의 셀에 기가 옴 씰의 패치 피펫 및 형성의 직접 적용 할 수 있도록 유리 피펫으로 긁어된다. 또한, 목욕 적용 칼슘 염료는 ILM을 통과하지 않고 하나 역행 시신경 5에서 다음 주사를 운반 또는 조직 (6)를 통해 전기 천공,이 멤브레인 (4) 아래에 주입해야합니다. 색소 성 망막염의 설치류 모델을 사용하는 경우 또한,의 RD / RD 마우스는 ILM은 두껍고 더 꿰 뚫을 수있다. 여기서는 패치 클램프 recordi 대한 망막 신경절 세포에 편재 칼슘 염료 로딩 및 직접 액세스를 모두 허용하는 효소 소화 7과 ILM을 제거하는 방법을 사용하여NGS 8. 뇌 조각 또는 망막 wholemount 중 하나에서 성공적인 녹음 해부하고 가능한 신경 조직의 배양에 따라 달라집니다. 통상적으로, 조직을 실험의 아침 추출하고,이 기록을 위해 사용될 때까지 인공 뇌척수액 (ACSF)에서 배양 하였다. 이 시간 창 다음 중요한 저하, 8 시간 - 일반적으로 조직은 6 가능한 남아있다. 그러나, 뇌 조각 wholemount 망막 제제 모두는 일반적으로 짧은 시간주기 내에서 기록 될 수있는 것보다 더 많은 조직을 생성한다. 결과적으로, 조직은 종종 일의 마지막 폐기 및 박리 후속 일 다시 종료된다. 이것은 또 다른 동물 사용 및 설치 및 해부 / 반복 염색 ~ 2 시간을 의미합니다. 다음 프로토콜이 이용되는 소수의 동물을 의미 이상을 24 시간 동안 신경 조직의 수명을 연장하는 방법을 설명하고, 실험적인 시간이 가능하다. 조직의 생존 w전기 생리 특성과 칼슘 역학을 기록을 통해 평가하고, 이러한 속성은 &lt;4 시간과&gt; 24 시간 postdissection 사이의 구별 할 수 있었다있다. 이러한 결과는 장기간 배양 후 하나의 셀 속성은 그대로하고 기능뿐만 아니라 나타냅니다 만, 칼슘 이미징 및 전기 생리 녹음에 의해 평가로 네트워크 활동은, 24&gt; 변경 시간 postdissection입니다. 또한, 우리는 칼슘 염료가 어떤 해로운 영향을주지 않고 장기간 세포에 남아있을 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜의 적용은 외부 환경이 고도로 조절되면 급성 신경 조직에서 신경 세포의 기능 활성이 장기간 유지 될 수 있음을 보여준다. 조직 생존 인해 상이한 배양 프로토콜 실험실간에 크게 변화 더욱이,이 방법은 급성 NEU의 상태에서 변화를 줄이기 위해 적용되어야 이상적인 파라미터 금 표준을 확립RONAL 조직.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="831">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich VETEC</td>
			<td style="width:135px;">V800372</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P9333</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M2004&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">D-glucose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5767</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S6014</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S2554</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M9272&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">223506</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:159px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:135px;">LK003150</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">276855</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;">Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td>
			<td style="width:159px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">P-6867</td>
			<td style="width:225px;">20% solution in DMSO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fura-2 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Anaspec</td>
			<td style="width:135px;">84017</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-4 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">F23917</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-8 AM</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">Ab142773</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:315px;">Vibrating blade microtome&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Biosystem</td>
			<td style="width:135px;">VT1200 S</td>
			<td style="width:225px;">Equiped with Leica&#8217;s Vibrocheck&#8482; measurement device&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Antivibration table</td>
			<td style="width:159px;">Kinetic Systems Vibraplane&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Vibraplane 9100/9200&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">BX51WI&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">20X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">LUMPlanFLN 60x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">60X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Ixon +</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">High speed wavelength switcher</td>
			<td style="width:159px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:135px;">Lambda DG-4&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Data acquisition system</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:225px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">BF150-86-10</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">P-97</td>
			<td style="width:225px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:135px;">RC-40LP</td>
			<td style="width:225px;">Low Profile Open Bath Chambers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Software</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">pClamp 10.2</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Andor iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Andor iQ3</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Braincubator</td>
			<td style="width:159px;">Payo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BR26021976</td>
			<td style="width:225px;">www.braincubator.com.au</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CP-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Controller</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-36-25 RS232</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

해부 다음 8 시간 - 신경 조직 준비, 뇌 조각 망막 wholemount 급성, 보통 6 유지 될 수있다. 이 실험 시간을 제한 한 연구에 따라 이용되는 동물의 수를 증가시킨다. 이러한 목욕 적용 염료의 장기간의 사전 배양을 필요로 칼슘 이미징이 제한은 특별히 영향 프로토콜을. (3) 내의 박테리아 성장 지수 - 슬라이싱 후 4 시간 단단히 조직 상태의 감소와 관련된다. 본 연구는 성장 인자를 함유하는 항생제, 멸균 방법, 또는 조직 배양 배지 없이도 시간의 장기간 (&gt; 24 h)에 대한 가능한 신경 조직을 유지하기 위하여, 급성 제제 세균의 증식을 제한하는 방법을 설명한다. UV 조사에 의해 세포 외 유체를 순환 15에서 사용자 지정 유지 챔버 내에서 조직을 유지함으로써 - 16 ° C는, 조직은 전기 생리 특성, 또는 칼슘시의 차이를 보여줍니다&gt; 24 시간 postdissection에서 세포 내 칼슘 염료를 통해 gnaling. 이러한 방법은 급성 신경 조직을 사용하는 사람들에 대한 실험 시간을 연장 할뿐만 아니라, 실험 목적을 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄일 것이고, 급성 신경 조직 배양 용 금 표준을 설정한다.

배양 중에 ACSF의 세균 부하 및 온도의 긴밀한 조절은 신경 조직의 생존을 유지하는 것이 필수적이다. 16 ° C (도 1) - 이는 UVC 광 조사 15에서 ACSF의 온도를 유지 통해 최적화 될 수있다. (도 1C APS), 다음 경우 사이의 변동성을 줄일 신경 조직을 배양 할 때 따라서 매개 변수를위한 황금 표준을 제공하고, 환경 조건의 기록 (pH와 온도.)와 실험자를 제공?...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저&gt; 24 시간 동안 연장 될 수있다.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K 조회수.  Western Sydney University.  8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저> 24 시간 동안 연장 될 수있다. 

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Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

고도의 연결을 강화 문화의 생성을위한 두피 조직 블록의 Cryopreservation

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

연구

신경과학

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽​​에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes and nanosensors, optimized for repeated use in awake, behaving animals. The microinjectrode system can be configured for multiple purposes: (1) simple arrangement of the cannula for placement of an experimental probe that would otherwise be too fragile to penetrate the dura mater, (2) microfluidic infusion of a drug, either independently or coupled to a cannula containing an experimental probe (i.e., microelectrode, nanosensor). In this protocol we explain the step by step construction of the microinjectrode, its coupling to microfluidic components, and the protocol for use of the system in vivo. The microfluidic components of this system allow for delivery of volumes on the nanoliter scale, with minimal penetration damage. Drug infusion can be performed independently or simultaneously with experimental probes such as microelectrodes or nanosensors in an awake, behaving animal. Applications of this system range from measuring the effects of a drug on cortical electrical activity and behavior, to understanding the function of a specific region of cortex in the context of behavioral performance based on probe or nanosensor measurements. To demonstrate some of the capabilities of this system, we present an example of muscimol infusion for reversible inactivation of the frontal eye field (FEF) in rhesus macaque during a working memory task.

We present a microinjectrode system designed for electrophysiology and assisted delivery of experimental probes (i.e., nanosensors, microelectrodes), with optional drug infusion. Widely available microfluidic components are coupled to a cannula containing the probe. A step-by-step protocol for microinjectrode construction is included, with results during muscimol infusion in macaque cortex.

결합 된 약물 주입 및 전기 생리학을위한 마이크로 인젝트 로드 시스템

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

고도의 연결을 강화 문화의 생성을위한 두피 조직 블록의 Cryopreservation

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

결합 된 약물 주입 및 전기 생리학을위한 마이크로 인젝트 로드 시스템

세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

요약

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고도의 연결을 강화 문화의 생성을위한 두피 조직 블록의 Cryopreservation

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽​​에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

결합 된 약물 주입 및 전기 생리학을위한 마이크로 인젝트 로드 시스템

세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양

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