전자 현미경 분석은 빈번히 복잡합니다. 당사는 당사의 프로토콜이 대규모 샘플 표면 및 중간 부피에서 EM 데이터의 처리 및 수집을 용이하게 한다고 믿습니다. 우리의 프로토콜은 직렬 섹션에서 대상 구조를 찾는 데 도움이됩니다.
데이터 레코딩은 필요한 것으로 제한됩니다. 전체 조직 블록의 데이터 수집과 비교하여 기록 시간이 단축되고 데이터 분석이 쉬워집니다. 접근의 전반적인 용이성을 감안할 때, 우리는 과학적인 질문뿐만 아니라 진단 도구로도 해결할 수 있다고 믿습니다.
분석을 위한 어레이를 생성하려면 먼저 샘플을 초미세토메 홀더에 고정시키고 면도날을 사용하여 샘플 주위의 수지를 대략 다듬습니다. 다이아몬드 트리밍 도구를 사용하여 시료를 미세 다듬고 20도 또는 90도 경사의 트리밍 나이프를 사용하여 블록의 상단 및 하단 표면이 칼의 절삭날과 평행하도록 합니다. 자일렌과 접착제를 3:1 비율로 섞고 이쑤시개에 부착된 속눈썹을 사용하여 트리밍 된 블록의 위쪽과 아래쪽 가장자리에 혼합물을 적용하십시오.
혼합물이 건조되는 동안 웨이퍼 클리닝 도구를 사용하여 웨이퍼 조각을 해석에 적합한 크기로 자른다. 웨이퍼를 증류수로 청소하여 이물질을 헹구고 웨이퍼가 건조한 후 플라즈마로 표면을 청소하십시오. 어레이 단층 촬영 나이프를 준비하려면 거품이 많은 끈적끈적한 테이프를 사용하여 히스토 점보 나이프 의 바닥에 바늘을 부착하고 칼을 초미세톰 홀더에 0도 로 넣습니다.
칼의 가장자리를 블록 표면에 평행하게 조정하고 절제 할 준비가된 위치에서 잘라진 블록을 칼 가장자리로 가져옵니다. 깨끗한 웨이퍼를 칼 분지에 넣고 분지를 칼 가장자리와 같은 수준으로 채우는 다음, 부착된 주사기를 사용하여 칼의 다이아몬드 가장자리가 제대로 가습하여 필요에 따라 물을 추가하거나 인출하십시오. 어레이 단면의 경우 마이크로토메를 50 내지 100 나노미터의 절삭 범위와 초당 6~1밀리미터의 절삭 속도로 설정하고, 표적 Z 부피를 커버할 수 있을 만큼 긴 리본을 얻기 위해 단면편을 시작합니다.
블록 크기, 조직의 균질성 및 수지 의 유형에 따라 리본은 약 직선이 될 것입니다. 속눈썹의 깨끗하고 끈적끈적한 끝을 사용하여 칼 가장자리에서 리본을 분리하십시오. 속눈썹을 사용하여 리본을 지지 매체의 중심으로 부드럽게 이동합니다.
클로로폼 또는 가열 펜은 필요한 경우 섹션을 스트레칭하는 데 사용할 수 있습니다. 스트레칭 후 주사기를 철회하여 물을 배수하기 시작합니다. 더 섬세한 리본이나 느린 물 회수를 위해 주사기를 호스에서 분리하여 물이 떨어지게 합니다.
수위가 웨이퍼 레벨에 도달하면 리본을 분지 중앙으로 부드럽게 밀어 내고 나머지 모든 물이 분지에서 완전히 제거될 때까지 계속 배수합니다. 깨끗한 환경에서 웨이퍼를 건조시키십시오. 건조는 약 30분이 소요됩니다.
시료가 완전히 건조되면 어레이를 단단히 닫힌 상자로 옮겨 먼지 오염으로부터 보호합니다. 그리고 상자를 60도 오븐에 넣고 적어도 30분 동안 보관하십시오. 웨이퍼의 섹션 위치를 보여주는 SEM 이미지의 개요 맵을 획득하려면 내장 된 광학 카메라를 사용하여 섹션의 리본을 덮는 SEM 이미지를 얻습니다.
모자이크를 만들려면 샘플의 카메라 이미지를 클릭하고 드래그하여 자동 수집을 시작합니다. 대상 구조를 찾기 위해 더 높은 해상도로 개요를 획득합니다. 몇 섹션만 이미지화해야 하는 경우 확대 가능한 뷰어를 사용하여 원래 위치에서 획득한 이미지를 볼 수 있습니다.
고해상도로 이미지화해야 하는 섹션이 식별되면 이미징 영역을 만들고 클릭하고 드래그한 다음 고해상도 이미징 설정을 선택하고 템플릿에 설정을 저장하여 특히 작거나 감지하기 어려운 희귀 이벤트를 찾고, 10단 섹션마다 또는 리본당 한 섹션에 고해상도 이미징 설정을 사용하여 수동으로 이미징 영역을 만들고 이미지를 수집합니다. 그런 다음 관심 영역이 포함된 이미지와 마크 섹션을 검토합니다. 10개 이상의 연속 섹션을 가져오려면 섹션 파인더를 사용하여 모든 섹션을 자동으로 찾습니다.
개요 이미지에 관심 영역이 명확하지 않은 경우 섹션의 더 높은 해상도 이미지를 획득하고 섹션 미리 보기 기능을 사용하여 이미지를 자동으로 만들고 획득합니다. 최적의 이미징 설정을 결정하기 위해 현미경 제어 소프트웨어에서 라이브 이미징을 활성화하고 관심 영역으로 이동한 다음, 제조업체의 지침에 따라 이미지가 명확한 관심 영역을 보여줄 때까지 이미징 설정을 조정합니다. 연속 섹션에서 이미징 영역의 위치를 최적화하려면 관심 이미지를 확대/축소하고 위치 수정 을 클릭하여 등록된 섹션 위치의 정밀도를 높입니다.
이미징 영역을 정의하려면 Alt 키를 누를 때 모든 섹션을 클릭하고 드래그하고 팝업 컨텍스트 메뉴에서 타일 집합 배열 만들기를 선택합니다. 이 소프트웨어는 발견되었거나 이전에 표시된 모든 섹션에서 동일한 상대 위치에 이미징 영역을 만듭니다. 그런 다음 필요에 따라 각 이미지 시리즈에서 픽셀 수, 픽셀 크기, 타일링 레이아웃 및 픽셀 거주 시간을 설정합니다.
자동 기능을 구성하려면 입증된 대로 자동 기능에 대한 별도의 이미지 시리즈를 만들고 이미지 시리즈를 고대비 구조가 포함된 섹션의 위치로 이동합니다. 이미지 시리즈를 1024 x 884 픽셀로 설정하고 이미지 시리즈에서 사용되는 가장 높은 해상도에 해당하는 픽셀 크기를 선택합니다. 자동 기능 목록에서 자동 포커스 및 자동 낙인을 확인합니다.
획득 시퀀스 컨트롤에서 양면을 선택하고 자동 함수의 이미지가 목록의 첫 번째 항목인지 확인한 다음 모두 를 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 모든 이미징 시리즈가 만들어지고 설정되면 계열이 작업 큐에 나열됩니다. 저해상도 획득은 단일 또는 모자이크 이미징을 사용하여 섹션의 선택된 부분 또는 전체 섹션에서 수동으로 또는 자동으로 직접 수행한 다음 스티치할 수 있습니다.
선택된 영역의 이미지는 미토콘드리아, 핵 및 마이크로빌리를 시각화하기 위해 고해상도 파라미터를 사용하여 획득할 수 있으며, 예를 들어, 해결된 모자이크 맵의 자동 획득 후, 여러 관심 영역을 잘라내거나 지역 내의 추가 로컬 이미징 영역을 정의하는 데 사용될 수 있다. Drosophila 창자에 있는 다른 특화된 세포 모형은 무작위로 분포하더라도, 그(것)들은 단일 단에서 또는 직렬 이미지의 집합으로 고해상도 매개변수를 사용하여 심상을 사용하여 심상을 선별한 후에 시각적으로 구별될 수 있습니다. 정렬 후 다른 소프트웨어 솔루션을 사용하여 스택을 렌더링할 수 있습니다.
배열 단층 촬영 분석을 사용하면 단일 웨이퍼에서 많은 순차적인 섹션을 생성하고 저해상도 매개 변수를 사용하여 스크리니치하여 일반적인 관심 영역을 지역화할 수 있습니다. 이러한 영역은 고급 수집 매개 변수를 사용하여 추가 분석을 위해 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어, 노텀내의 균주 분단은 세포가 복근 영역에 비해 상대적으로 크므로 초구조적 수준에서 국소화하기가 쉽지 않다.
그러나 이 방법을 사용하여 20~40개의 단면의 도약의 자동 중간 해상도 개요 이미지를 사용하여 분할 셀을 국소화할 수 있다. 어레이 단층 촬영 절차는 보다 간단한 전자 현미경 데이터 분석을 제공합니다. 우리는 시청자가 재생을 마스터하고지도 관련 워크플로우에 익숙해지는 데 투자할 것을 권장하며, 전체 동물이나 전체 장기에 대한 초구조적 분석이 필요한 연구 주제는 거의 없습니다.
우리의 방법은 조직에서 세포와 상호 작용 파트너의 신속한 현지화에 도움이됩니다.
