Name: stimulation of notch signaling in mouse osteoclast precursors
Uploaded: 2017-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).

척추 동물과 관련된 모든 연구는 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 1. 문화 미디어 준비 <ol><li> 100 ml의 열, 900 ML의 H 2 O의 최소 필수 배지 (MEM) 분말 1.9 g의 탄산 수소 나트륨을 용해하여 α-MEM을 준비하고 2 mM L- 글루타민, 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신과 보완 불 활성화 된 소 태아 혈청. 0.22 ㎛의 폴리 에테르 설폰 (PES) 필터를 이용하여 멸균. </li><li> 35 NG로 α-MEM을 보충하여 식세포 매체를 준비 / ml의 재조합 마우스 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) </li><li> 100 NG / ㎖ RANKL과 식세포 매체를 보충하여 파골 세포 배지를 준비 </li></ol> 2. 골수 세포 분리 <ol><li> 10 ㎖의 α-MEM와 마우스 당 25⅝ 게이지 바늘 한 10 ML의 주사기를 입력합니다. </li&gt; <li> 1.3 L / min의 유량으로 CO 2 10 분간 노출을 통해 마우스 안락사. 해부를 진행하기 전에 자궁 경부 전위와 CO 2 노출에 따라 동물의 죽음을 확인합니다. </li><li> 깨끗한 기술을 사용하여, 해부 및 경골과 대퇴골을 분리합니다. 경골과 대퇴골을 노출 각 뒷다리의 앞쪽 표면을 따라 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 마우스 피부를 소독. <ol><li> 대퇴골의 말단을 무료로 무릎 관절을 잘라, 가능한 한 골반에 가까운 대퇴골을 잘라. 대퇴골를 제거하고 최대한 부드러운 조직을 청소합니다. 발목을 절단 경골을 제거하고 가능한 한 많은 연부 조직을 제거합니다. </li></ol></li><li> 2.5 ml의 실내 온도 α-MEM은 하나의 튜브에 하나의 마우스에서 골수 플러시 조합과 15 ML 원뿔 관에 집게와 플러시 골수와 뼈를 잡습니다. 참고 : 성공적인 골수 플러시 t의 착색이 변경됩니다그는 빨간색에서 뼈 베이지합니다. </li><li> 파편은 튜브의 바닥에 정착 이물질 전송을 방지하기 위해 깨끗한 15 ML 원뿔 튜브 돌보는에 뜨는을 전송 할 수 있습니다. 참고 : 일부 세포는 골수 파편으로 정착 할 수 있습니다. 셀들의 많은 수는 필요한 경우 골 플러시 깨끗한 15ml를 튜브에 70 μm의 세포 여과기를 통해 여과 될 수있다. </li><li> 실온에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브 (들) 세포 펠렛합니다. </li><li> 진공 용균 완충액 0.5 ml의 암모늄 염화 칼륨 (ACK)에 재현 탁하고 상등액 세포 펠렛을 대기음 적혈구를 용해시키기 위해 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 솔루션 및 원심 분리기 세포 ACK로 직접 10 ml의 PBS를 추가합니다. 주 : 이전에 붉은 세포 펠렛은 이제 베이지 색이어야한다. </li><li> 100 밀리미터 조직 문화 처리 접시에 진공 흡인 상층 액과에 resuspend 펠렛을 10 ml의 α-MEM, 그리고 판. 가습에 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어조직 문화 인큐베이터. 참고 : 세포를 계산하면이 단계에서 필요하지 않습니다. 이 시간 동안 골수 부착 세포 배양 표면에 부착한다; 비 부착 골수 세포 인구는 현탁액에 남아 있습니다. MCSF이 초기 배양시 배양액에 존재하지 않는다. </li></ol> 파골 세포 전구체 3. 심화 <ol><li> 골수 플러시 한 50㎖에 비 부착 세포를 함유하는 원뿔형 튜브 전사 배양 상등액의 하룻밤 배양 후. 참고 : 골수 중간 엽 전구 세포를 포함 부착 세포와 문화 요리, 폐기 될 수있다 또는 다른 실험을 위해 필요한 경우, 신선한 α-MEM으로 공급. 주 : 파골 세포가 5 일 동안 격일 파골 매체 상쾌한 배지에서 4 × 105 세포 / ㎠의 밀도로 조직 배양 처리 된 요리로 도금하여이 비 부착 골수 세포에서 직접 분화 될 수있다. </l난&gt; <li> 18 ㎖의 최종 부피 비 - 부착 세포 용액 α-MEM을 첨가하고 35 NG / ml의 최종 농도로 M-CSF를 추가한다. </li><li> 6 60mm 현탁 배양 접시에 세포 현탁액 각 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 가습 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 번호판을 품어. 이 시간 동안, M-CSF도 아닌 조직 배양 처리 된 표면에 부착 할 수 대식 세포의 분화를 자극 할 것이다. </li><li> 밤새 3 ㎖ 식세포 신선한 배지로 재 공급 파골 세포 전구체를 배양 후. 이 대 식세포로 분화하지 않은 비 부착 세포를 제거합니다. </li><li> 2 일 또는 문화가 약 70 %의 합류에 도달 할 때까지 CO 2를 37 ° C에서 배양 파골 세포 전구체를 계속 5 %. </li></ol> 4. 파골 세포의 분화 <ol><li> CEL 때까지 실온에서 1 ml의 해양 기원의 단백질 분해 / collagenolytic 효소로 세포를 5 ml의 PBS와 파골 세포 전구체를 씻고 치료LS는 접시의 부드러운 도청에 의해 빠질 수 있습니다. 주 :이 정지 접시에서 배양하는 경우 파골 세포 전구체가 해제 될 수있다; 전구체 해제 할 조직 문화 처리 된 표면에 너무 단단히 연결합니다. 트립신은 파골 세포 전구체를 활성화 할 수 있습니다 피해야한다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 각각의 접시 및 전송 세포에 4 ㎖의 α-MEM을 추가합니다. 혈구를 사용하여 세포를 세어 mL를 5 × 104 세포 / 밀도로 세포를 희석시키고 100 NG / ml의 최종 농도로 35 NG / ㎖ 및 RANKL의 최종 농도로 M-CSF를 추가한다. </li><li> 조직 배양 - 처리 된 플레이트에 2.6 × 104 세포 / ㎠의 밀도로 시드 세포는 2 일 동안 가습 된 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. 분화는 전형적으로 5 × 104 세포를 각 웰에 시딩 24- 웰 플레이트에서 수행된다. </li><li> 이일 1 ml의 신선한 osteoc와 매체를 대체하여 분화, 재 공급 셀의 시작 후마지막 매체. 참고 : 파골 세포의 분화는 일반적으로 3 일내 완료됩니다. 결과 파골 세포는 TRAP 염색 쉽게 정량화 및 형태 학적 분석을 할 수 있습니다. </li></ol> Jagged1 코팅 된 표면과 노치 신호 전달의 5 연속 자극 <ol><li> 10 ㎍ / ml의 농도로 PBS에 염소 항 - 인간 IgG 항체의 Fc 일시 중단 (1 : 10 ㎎ / ㎖의 스톡 1000 희석). 1.3 μg의 / ㎠의 밀도로 배양 표면 항체 용액을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 24 웰 플레이트의 경우에, 웰 당 250 μL (2.5 μg의)를 추가한다. </li><li> 진공 흡인 우물과 1 ml의 PBS로 리필. 이 과정을 2 회 반복합니다. </li><li> 10 μg / ml의 농도에서 재조합 Jagged1 PBS-Fc 융합체 단백질을 일시. 1.3 μg의 / ㎠의 밀도에서, 항체 - 코팅 된 배양 표면 Jagged1-FC 용액을 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 배양 표면 항체 ONL 도포Y는 컨트롤로서 사용될 수있다. </li><li> 진공 흡인 우물과 1 ml의 PBS로 리필. 이 과정을 2 회 반복합니다. 건조에서 그들을 방지하기 위해 시드 셀하기 직전까지 우물에서 PBS를 유지합니다. </li><li> 시드 2.6 × 10 4 파골 세포 전구체 / 코팅 표면 위에 cm 2. 노치 신호 전달은 연속적으로 적어도 3 일간 자극한다. </li></ol> Jagged1 코팅 비즈와 노치 신호 전달 6. 임시 자극 <ol><li> 1.5 ㎖의 최종 부피로 0.5 μg의 / cm 2 Jagged1-FC, 21 μL / cm 2 G 단백질 아가 로스 비드, 및 PBS : 적절한 크기의 튜브에 다음을 결합한다. 24 웰 플레이트의 1도에 대한 Jagged1 구슬의 적절한 수를 준비 1.5 ml의 1 μg의 Jagged1-FC, 40 ㎕의 단백질 G 아가로 오스 비즈와 PBS를 결합합니다. </li><li> 4에서 회전 튜브를 품어 2 시간 동안 C를 °. </li><li> 펠렛 비즈에 1 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 1.5 ml의 PBS에 재현 탁 구슬. 이 세척을 반복2 번 이상. </li><li> 130 μL / cm 2 배지에서 재현 탁 Jagged1 구슬과 배양 세포에 적용됩니다. </li><li> 원하는 기간 동안 CO 2를 37 ° C에서 구슬과 세포를 품어 5 %. PBS 또는 배지 여러 세척과 구슬을 제거합니다. </li><li> 노치 대상 유전자 전 사체 (10)의 측정을 통해 노치 신호 전달 활성화를 확인합니다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

프로토콜 내에서 중요한 단계 문화와 파골 세포 전구체의 체외 분화는 파골 세포 및 골 재생과 뼈 질량의 보존을위한 치료 대상의 식별 분자 메커니즘의 조사를위한 유용한 플랫폼을 제공합니다. 마우스 파골 세포 전구체를 배양 할 때, 가장 중요한 요소는 나이브 상태의 전구체를 유지한다. 마크로파지 유사 세포로, 파골 세포 전구체는 박테리아 성분 및 염증성 사이토...

포유류 노치 신호 전달 경로는, 초파리 melanogaster의에서 동일한 경로에 상동이며, 네 횡단 노치 수용체 (Notch1-4) 및 가변 (JAG1 및 JAG2) 및 델타처럼 (DLL1, 3의 다섯 막 결합 리간드로 구성 및 4) 가족 (1). 수신 셀에 노치 수용체가 투과 셀이 리간드에 의해 결합 될 때 노치 신호 전달이 개시된다. 이 트랜스 활성화 중에 막 결합 노치 리간드는 막 결합 수용체의 노치 (3, 4)에 인장력을 생성한다. 리간드 결합의 인장력은 프레 함유 감마 - 세 크레타 제 복합체 (γ 세 크레타 제)에 의해 매개되는 세포 내 절단 이벤트 뒤에 효소 (TACE)에 변환 TNF- 알파에 의해 수용체의 세포 분열을 촉진 노치 수용체의 구조적 변화를 유도한다. γ 세 크레타 자료 노치 INT이 CBF -1- 쓰 (H) - lag 여기서 -1- (CSL), 배후 형상 (MAML)과 전사 활성 복합체를 형성하는 핵으로 전위 시키며, 세포 유형 특이 적 인자 발현을 구동 racellular 도메인 (NICD) 유전자 5를 대상으로. 시험관 내에서 노치 경로의 활성화 방법의 고유 한 필요성 노치 신호 전달 활성 결과의 기계적 요소. 가용성 노치 리간드는 수용체를 노치에 결합하지만, 동시에 경쟁적으로 세포 관련 노치 리간드의 결합을 억제하면서 NICD 해제에 필요한 힘을 스트레칭 생산하기 위해 실패 할 수 있습니다. 따라서, 배양 배지에 용해 노치 리간드 첨가 6,7 시그널링 정상 노치를 감쇄 할 수있다. 이들이 적절 리지드 기판 (5), (8, 9)에 고정되는 경우 다행히도 노치 리간드 NICD 방출을 유도 할 수있다,10. 리간드 피복 된 배양 세포를 기판 상에 시드 또는 세포 리간드 피복 된 비드를 적용 모두 노치 신호를 활성화하고, 그들 사이의 선택은 노치 자극 원하는 타이밍에 주로 의존 할 수있다. 기능 분석 또는 분화의 중간 동안 소망되는 바와 같이 즉각적인 임시 노치 신호의 활성화를 들어, 노치 리간드는 배양 된 세포에 적용 비드를 아가 로스에 바인딩 될 수 있고 언제든지 세척. 배양 기간의 시작 부분에서 더 지속 노치 시그널링, 조직 배양 플레이트를 세포 시딩 이전 리간드로 코팅 될 수있다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 방법은 마우스 파골 세포 전구체를 사용하여 수행되지만, 여기에 기술 된 방법에 대한 방법과 유사 세포 타입 6, 11, 12, 13의 다양한 적용하고, </SUP&gt; 14. 파골 세포는 말단 골 조직의 재 흡수에 대한 책임 분화 조혈 세포 계보이며, 그들은 골 소실 (15)의 여러 질환에 연루되어있다. 따라서, 자신의 단핵구 / 대 식세포 계통의 전구 물질로부터 파골 세포와 그 기능이 파골 세포와 새로운 뼈 재생 치료의 개발의 더 나은 이해에 필수적인 제어하는 분자 메커니즘의 분화의 생체 외 연구한다. 지금 일반적 해당 노치 시그널링은 파골 세포의 분화와 기능에 긍정적 인 역할을 허용하는 동안, 모두 노치 신호 자극 및 파골 세포 전구체의 배양과 분화의 변화는 초기 상반된 결과 16, 17, 18, 19되었다. 가까이 방법의 차이 검사와 유전자의 사용모델은 크게 파골 노치 신호 전달의 역할을 명확히했지만, 표준화 노치 자극 배양 방법의 적용은 다른 세포 유형 20, 21, 22, 23 노치 신호의 향후 연구에서 이러한 논쟁을 방지 할 수있다. 노치 신호 전달을 자극위한 다양한 방법과 같이, 가장 좋은 방법은 실험 문제에 달려있다 배양 마우스 파골 세포 전구체의 분화를위한 여러 방법이 있으며. 여기서, 마우스 긴 뼈에서 플러시 골수 세포의 부착 및 비 부착 분수를 배양하는 우리의 선호하는 방법이 표시됩니다. 이 방법은 분화 된 다양한 방법에 적용 할 수있는 세포를 본질적으로 특별한 장비가 필요없고, 제조의 이점을 갖는다.

<table><tbody><tr><td>Recombinant mouse M-CSF</td><td>Biolegend</td><td>576402</td><td>Available from multiple suppliers, test activity before experiments</td></tr><tr><td>Recombinant mouse RANKL</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>200-04</td><td>Available from multiple suppliers, test activity before experiments</td></tr><tr><td>Recombinant human Jagged1-Fc</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1277-JG-050</td><td>Available from multiple suppliers, test activity before experiments</td></tr><tr><td>Protein G agarose beads</td><td>InvivoGen</td><td>gel-agg-2</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgG Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-001-008</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>Accutase cell dissociation reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Used to lift osteoclast precursors</td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>Used to stain differentiated osteoclasts</td></tr></tbody></table>

stimulation of notch signaling in mouse osteoclast precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

이 방법의 목적은 문화이며, 파골 세포 전구체에 노치 신호를 자극한다. 때 제대로 배양, 파골 세포 전구체는 부드러운 세포질 (그림 1A)와 주로 긴 스핀들 모양의 형태를 나타낸다. 주의가 파골 세포 전구체의 면역 활성화를 피하기 위해주의해야한다. 활성화되면, 전구체 확산과 거품 세포질 (그림 1B)로 평평하게됩니다. 이러한 &quot;기름에 튀긴 ?...

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Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

stimulation-of-notch-signaling-in-mouse-osteoclast-precursors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.8K 조회수.  Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania. Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

비디오: Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

연구

발생학

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

소설<em&gt; 생체</em&gt; 유전자 전달 기술과<em&gt; 시험관</em근골격계 질환의 뼈 손실의 연구를위한&gt; 셀 기반 분석 실험

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

의학

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

생물학

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases (e.g., osteoporosis and bone cancer) and are therefore important objects of research. In vitro, their activity can be analyzed by the formation of resorption pits. In this protocol, we describe a simple pit assay method using calcium phosphate (CaP) coated cell culture plates, which can be easily visualized and quantified. Osteoclast precursors derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured on the coated plates in the presence of osteoclastogenic stimuli. After 9 days of incubation, osteoclasts were fixed and stained for fluorescence imaging while the CaP coating was counterstained by calcein. To quantify the resorbed area, the CaP coating on plates was stained with 5% AgNO3 and visualized by brightfield imaging. The resorption pit area was quantified using ImageJ.

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Here, we present a simple and effective assay procedure for resorption pit assays using calcium phosphate coated cell culture plates.

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

골격 기계 생물학을 탐구하기 위한 폐포골 리모델링 분석

Using Inducible Osteoblastic Lineage-Specific Stat3 Knockout Mice to Study Alveolar Bone Remodeling During Orthodontic Tooth Movement

The alveolar bone, with a high turnover rate, is the most actively-remodeling bone in the body. Orthodontic tooth movement (OTM) is a common artificial process of alveolar bone remodeling in response to mechanical force, but the underlying mechanism remains elusive. Previous studies have been unable to reveal the precise mechanism of bone remodeling in any time and space due to animal model-related restrictions. The signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is important in bone metabolism, but its role in osteoblasts during OTM is unclear. To provide in vivo evidence that STAT3 participates in OTM at specific time points and in particular cells during OTM, we generated a tamoxifen-inducible osteoblast lineage-specific Stat3 knockout mouse model, applied orthodontic force, and analyzed the alveolar bone phenotype. 
Micro-computed tomography (Micro-CT) and stereo microscopy were used to access OTM distance. Histological analysis selected the area located within three roots of the first molar (M1) in the cross-section of the maxillary bone as the region of interest (ROI) to evaluate the metabolic activity of osteoblasts and osteoclasts, indicating the effect of orthodontic force on alveolar bone. In short, we provide a protocol for using inducible osteoblast lineage-specific Stat3 knockout mice to study bone remodeling under orthodontic force and describe methods for analyzing alveolar bone remodeling during OTM, thus shedding new light on skeletal mechanical biology.

저자 스포트라이트: 폐포와 장골 리모델링을 비교하여 OTM 모델 잠재력 탐색 

This study provides a protocol for using inducible osteoblast lineage-specific Stat3 knockout mice to study bone remodeling under orthodontic force and describes methods for analyzing alveolar bone remodeling during orthodontic tooth movement, thus shedding light on skeletal mechanical biology.

유도 가능한 조골 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정 치아 운동 중 치조골 리모델링 연구

The alveolar bone, with a high turnover rate, is the most actively-remodeling bone in the body. Orthodontic tooth movement (OTM) is a common artificial ...

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

요약

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RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

소설

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

유도 가능한 조골 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정 치아 운동 중 치조골 리모델링 연구

유도 가능한 조골 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정 치아 운동 중 치조골 리모델링 연구

유도 가능한 조골 계통 특이적 Stat3 녹아웃 마우스를 사용하여 교정 치아 운동 중 치조골 리모델링 연구