이 프로토콜은 포유동물 두개골 발달 동안 활성인 포스포단백질의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 두 가지 생리학적으로 관련된 맥락, 마우스 안면 과정 및 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 단백질 분리 동안 탈인산화의 공통된 장벽을 극복한다. 모든 시약과 물질을 얼음 위에 유지하면서 신속하게 움직이고 인산화 단백질의 무결성을 유지하기 위해 모든 용해 완충액에 포스파타제 억제제를 사용하는 것이 필수적입니다.
시작하려면 복부 쪽이 위를 향하게하는 해부 보드에 마우스 몸체를 놓고 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 그런 다음 직선 Semken 포셉으로 질 개구부의 앞쪽에있는 피부를 꼬집고 들어 올려 복강을 엽니 다. 다음으로, 양쪽에 45도 각도로 직선 블레이드 수술 가위로 기저층에서 들어 올린 피부를 잘라 네 팔다리와 뒷다리 사이의 대략 절반 정도의 각 측면 표면으로 확장되는 V 자형을 생성합니다.
Semken 포셉을 사용하여 자궁 뿔 중 하나를 잡고 난관 아래와 수술 가위로 자궁 경부 위를 자릅니다. 자궁 경적을 완전히 제거하려면 mesometrium을 잘라 낸 다음 해부 된 자궁 뿔을 10 센티미터 페트리 접시의 조직학 PBS 10 밀리리터로 옮깁니다. 마찬가지로, 복강의 반대쪽에있는 두 번째 자궁 경적을 제거하십시오.
그런 다음 두 자궁 뿔이 들어있는 10 센티미터의 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 해부 스테레오 현미경으로 Dumont 5 미세 포셉으로 자궁 뿔에서 각 배아를 조심스럽게 해부하십시오. 그런 다음 천천히 myometrium, decidua, chorion을 떼어냅니다.
다음으로, 배아를 둘러싸고 있는 비교적 투명한 양수를 찢고 제거하고, 배아를 태반에 연결하는 탯줄을 절단한다. 이어서, 각각의 해부된 배아를 절단된 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 얼음 상의 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에서 2.5 밀리리터의 조직학 PBS로 옮긴다. 조직학 PBS 10 밀리리터가 들어있는 세 개의 10 센티미터 페트리 접시를 준비하고 배아 사이의 회전에 사용할 얼음 위에 보관하십시오.
이어서, 절단된 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 얼음 상의 조직학 PBS가 있는 10센티미터 페트리 접시 중 하나로 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰로부터 하나의 배아를 옮긴다. 해부 현미경 하에서, 먼저 상악 과정에서 측면 비강 과정을 분리하는 자연 압흔을 따라 하나의 상악 과정의 전방 측면에서 절단을 만들어 미세 포셉을 사용하여 얼굴로부터 각 상악 과정을 분리합니다. 다음으로, 자연 압흔을 따라 상악 과정의 후방면을 절단하여 상악 과정과 하악 과정을 분리한다.
그런 다음 위에서 언급 한 자연 들여 쓰기가 끝나는 상악 과정의 눈 쪽에서 상악 과정의 앞쪽에서 후방으로 수직으로 절단하여 상악 과정을 완전히 분리하십시오. 두 밀리리터의 작은 라텍스 전구가 있는 아홉 인치 파스퇴르 피펫을 사용하여, 해부된 한 쌍의 상악 과정을 약 30 마이크로리터의 조직학 PBS의 작은 물방울에 담아 얼음 위에 라벨이 붙은 35밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 한 쌍의 상악 처리 조직을 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 위의 표지 된 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 조직학 PBS의 전달을 최소화합니다.
또한, 파스퇴르 피펫으로 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브 내의 임의의 과량의 조직학 PBS를 제거하였다. 얼음 위에서 사용하기 직전에 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 첨가한 0.1밀리리터의 얼음냉 NP40 용해 완충액을 첨가하십시오. 그런 다음 200 마이크로 리터 PIPETMAN으로 10 번 위아래로 피펫을 만듭니다.
다음으로, 10 초 동안 와류 한 다음 거품 생성을 피하면서 200 마이크로 리터 PIPETMAN으로 10 번 위아래로 피펫을 사용합니다. 섭씨 네 도에서 두 시간 동안 인큐베이션하면서 튜브 리볼버가 있는 1.5밀리리터 또는 두 밀리리터 패들을 사용하여 엔드오버 엔드를 회전시킵니다. 이어서, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 13, 500 x g에서 원심분리하고, 200 밀리리터 PIPETMAN으로 얼음 위에 새로운 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 상청액을 수집한다.
먼저, 진공 시스템에 부착된 5.75 인치 파스퇴르 피펫을 사용하여 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터의 배지를 흡인한다. 그 다음 얼음처럼 차가운 조직 배양 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 마지막 세척 동안 플레이트를 옆으로 기울여 모든 조직 배양 PBS가 흡인되도록 한다. 다음으로, 세포를 용해시키기 위해 얼음 위에 사용하기 직전에 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 첨가된 얼음차가운 NP40 용해 완충액을 첨가한다.
플레이트를 얼음 위에서 다섯 분 동안 인큐베이션하고 플레이트의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 대략 매분마다 회전시킨다. 그런 다음 미리 냉각된 셀 리프터를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내고, 세포 현탁액을 얼음 위에 미리 냉각된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 그 후, 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이션하면서 튜브 리볼버와 함께 1.5밀리리터 또는 두 밀리리터 패들을 사용하여 엔드-오버 엔드를 회전시킨다.
이어서, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 13, 500 x g에서 원심분리하고, 200 밀리리터 PIPETMAN으로 얼음 위에 새로운 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 상청액을 수집한다. 2 내지 15분에서 PDFG-B 리간드로 자극한 후 불멸화된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터의 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 상응하는 총 단백질 밴드의 높이 또는 그 근처에서 실행되는 포스포단백질에 대한 뚜렷한 재현성 밴드를 밝혀냈다. 성장 인자로 처리했을 때 포스포단백질 밴드 강도의 증가가 처리되지 않은 세포의 것과 비교하여 관찰된 반면, 총 단백질 밴드 강도는 샘플 간에 상대적으로 동일하였다.
이 프로토콜은 섭동 및 인산화가 두개골 문맥에서 세포 간 신호 전달, 유전자 발현 및 세포 활동에 직접적으로 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
