골격 구조의 이질성은 연골과 뼈를 개발하는 유전자 발현을 연구하는 데 하나의 장애물입니다. 이 프로토콜은 인접하지만 다른 조직의 정밀한 격리방법을 제공합니다. 당사는 크레실 바이올렛 스테인링을 사용하여 연골및 뼈에 대한 레이저 포획 마이크로디스섹션을 최적화하여 후속 분석을 위해 높은 RNA 무결성을 유지하여 정확한 수집을 위해 이러한 조직을 시각화합니다.
크레실 바이올렛이 표적 조직의 충분한 구별을 제공하고 RNA 품질이 우리의 처리 방법 후에 높게 남아 있는 경우에 그밖 조직은 격리될 수 있습니다. 이러한 조직은 두개안 면봉과 뇌를 포함한다. 극저온 절제는 이 프로토콜에서 가장 까다로운 기술입니다.
RNA의 최고 무결성을 유지하기 위해 조직이 해부되고 빠르게 내장되어 있는지 확인하십시오. 이 절차를 시작하려면 관심있는 태아 또는 조직을 해부하십시오. 최적의 절삭 온도 화합물과 일회용 포함 금형에 샘플을 포함하고, 팁 이나 바늘로 시편의 방향을 조정.
드라이 아이스와 메틸-2-부틴 목욕에서 샘플을 신속하게 동결합니다. 다음으로, 냉동 절제 시 해부 샘플 슬라이드를 임시보관하기 위해 건조 얼음에 알루미늄 호일 시트를 배치하여 드라이 아이스가 있는 뚜껑이 달린 용기를 준비합니다. 신선한 냉동 표본을 드라이 아이스 버킷으로 옮기습니다.
최적의 절삭 온도 화합물층을 극저온 시편 홀더에 놓고, 시편을 부드러운 압력으로 최적의 절삭 온도 화합물 위에 즉시 놓습니다. 최적의 절삭 온도 화합물이 완전히 동결되면 표본으로 홀더를 냉동 암절단 암에 고정시하십시오. 샘플을 15분 동안 냉동에 두어 절단 온도에 상형화합니다.
그런 다음 조직을 12 마이크로미터 두께로 섹션화하고 PEN 멤브레인 슬라이드에서 슬라이스를 수집합니다. 멤브레인에 연속 섹션을 정렬합니다. 슬라이드가 완료되면 섹션이 몇 분 동안 건조한 다음 필요한 모든 슬라이드가 수집될 때까지 슬라이드를 드라이 아이스 용기의 호일로 옮기도록 합니다.
슬라이드 상자에 영하 80도의 슬라이드를 저장합니다. 시작하려면 15밀리리터 원심분리관으로 표시된 3개의 원심분리관을 준비하십시오. 각 튜브에 80%에탄올의 45밀리리터를 추가합니다.
얼음에 튜브 3개를 놓습니다. 95%에탄올의 45밀리리터가 들어 있는 튜브와 얼음 위에 100%에탄올이 들어 있는 튜브를 놓습니다. 다음으로 실온에서 50밀리리터 원심분리기 튜브에 45밀리리터의 자일렌을 추가합니다.
펜 멤브레인 슬라이드를 장갑에 대고 짧게 해동하고, 최적의 절삭 온도 화합물을 제거하기 위해 교반으로 80 %에탄올을 포함하는 각 튜브에서 30 초 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 알루미늄 호일 시트에 놓습니다. 파이펫 8 밀리리터 1% 크레실 바이올렛과 50% 에탄올을 슬라이드와 스테인에 30초 동안 장착합니다.
80%에탄올을 함유한 세 번째 튜브에서 슬라이드를 30초 동안 세척합니다. 30초 동안 95%에탄올을 함유한 튜브를 통과하여 슬라이드를 탈수하고, 30초 동안 100% 에탄올을 함유한 튜브를 30초 동안, 마지막으로 자일렌을 함유하는 튜브를 30초 동안 탈수한다. 그 후, 미끄러를 섬세한 작업 와이퍼에 5분간 배치하여 자일렌이 배수하고 단면을 건조시키도록 합니다.
먼저 레이저 포획 미세 절 현미경, 레이저 및 컴퓨터를 켭니다. 컴퓨터에 로그온하고 소프트웨어를 시작합니다. 녹색 표시등이 켜지면 빨간색 버튼을 눌러 레이저를 활성화합니다.
표시등이 빨간색으로 바뀌면 레이저를 사용할 준비가 되었습니다. 5 밀리리터 PCR 튜브의 캡을 수집가에 삽입합니다. 피펫 50 마이크로리터추출 버퍼는 캡에 넣고 수집 장치를 현미경에 삽입합니다.
변경 수집기 장치 창에서 참조 점 버튼으로 이동을 클릭하여 수집기를 참조점으로 이동합니다. 기준점을 명확하게 보려면 초점을 조정합니다. 다음으로 도구 모음의 왼쪽 언로드 버튼을 클릭하여 슬라이드 홀더를 낮춥춥니까.
슬라이드를 아래쪽을 향하여 홀더에 넣고 홀더를 다시 스테이지에 삽입합니다. 변경 표본 창에서 계속하려면 클릭합니다. 레이저 매개 변수를 설정하려면 레이저 메뉴의 제어 옵션을 선택하거나 레이저 아이콘을 클릭합니다.
레이저의 힘인 필요에 따라 다음 매개 변수를 조정, 레이저의 힘인 파워, 레이저의 폭인 조리개, 그리고 속도, 이는 그리기 및 절단 모드에서 절삭 속도입니다. 5X 목표로 시작하여 관심 영역을 찾고 관심 영역을 가장 잘 보여주는 목표로 전환합니다. 수집가의 마크를 클릭하여 수집튜브를 선택한 다음 이동 및 잘라내기 및 잘라냅니다.
절단이 완료되면 PEN 멤브레인을 사용하는 대상 조직이 중력에 의해 수집 튜브의 캡에 빠지게 됩니다. 이 선택 및 절단 프로세스를 반복하여 필요한 경우 여러 관심 영역을 가져옵니다. 이 후 수집기의 하중을 내리고 PCR 튜브를 조심스럽게 닫습니다.
미세 한 분은 마른 얼음에 배치합니다. 실온에서 미세 한 분부를 해동한 다음 원심 분리기를 간략하게 해동하고 샘플을 섭씨 42도에서 30 분 동안 배양하십시오. 그 후, 5 밀리리터 PCR 튜브로 lysis 버퍼를 회전.
제조업체의 지시에 따라 RNA 격리 키트를 사용하여 DNase 치료 및 RNA 추출을 수행합니다. 이 연구에서는 연골과 뼈의 최적화된 레이저 포획 미세 절제가 수행되며, 후속 분석을 위해 높은 RNA 무결성을 유지하면서 정확한 조직 수집을 위해 연골과 뼈를 시각화하는 빠른 절차에서 크레실 바이올렛 염색의 사용을 강조합니다. 슬라이드의 관찰은 검사된 모든 연골이 얼룩진 마젠타이며, 모든 미네랄화된 조직은 갈색 또는 검은색으로 얼룩진 것을 보여줍니다.
연골과 뼈 는 여러 해부학 적 부위의 다른 조직과 쉽게 구별됩니다. 메켈의 연골, 연골 및 하악 골 영역은 레이저 포획 미세 절에 의해 선택되고 격리됩니다. 시퀀싱을 위한 충분한 RNA를 얻으려면, 메켈의 연골 10개 영역, 10개의 연골 영역 또는 하악골 의 4개 부위를 각각 3개의 개별 수집 튜브로 끌어들입니다.
RNA는 그 때 추출되고, 총 RNA는 생물 분석기를 사용하여 분석됩니다. 이 레이저 포획 마이크로디스섹션 프로토콜은 다양한 발달 단계에서 다양한 조직에서 사용되며 RNA 무결성 수 측정은 높은 RNA 품질을 나타냅니다. 차동 유전자 발현 분석은 그 때 수행된다.
하악뼈와 메켈의 연골 사이에는 4, 006개의 유전자가 현저히 다르게 표현되어 있습니다. 골세포 또는 골세포에 특이적인 유전자는 하악뼈에서 더 높게 표현되는 반면 연골 세포 특이적 유전자는 Meckel의 연골에서 더 높게 표현된다. 또한, 골세포 마커는 하악 뼈에서 더 높게 표현되어 표적 조직의 성공적인 격리를 나타냅니다.
이러한 절차에 따라 qPCR 및 RNA-seq를 포함한 유전자 발현 분석을 수행할 수 있다. 이러한 방법은 이질적인 조직 내의 특정 조직 또는 관심 영역에서 전사의 유전자 발현을 분석할 수 있다.
