SCJ는 심장에 대한 국제 사회와 폐 이식 연구 활동 및 의사의 왕 대학 및 Fellowship.SM 여행 캐나다 Detweiler의 외과 의사에 의해 지원되었다 심장과 (SCJ에) 폐 이식 경력 개발 수상 국제 사회에 의해 부분적으로 지원되었다. SS는 건강 연구 옥스포드 생물 의학 연구 Centre.JH의 국립 연구소에 의해 지원되었다하는 것은 신장 연구 UK 수석 비 임상 원정대의받는 사람입니다. 웰컴 트러스트 프로그램 그랜트 (082519Z07Z), 영국 심장 재단 프로그램 그랜트 (PG / 10 / 62.28504) 및 EU 프레임 워크 프로그램 7 (; BioDRIM 한 연구) :이 작품은 AB와 KW에 다음과 보조금에 의해 투자되었다. 저자는 같이 ImageStream 마크 X의 악기에 대한 액세스 및 지원을 제공하기 위해 마이클 파슨스와 Lunenfeld - 타넨 바움 연구소에서 유동 세포 계측법 핵심 시설, 시나이 의료 시스템, 토론토 감사드립니다.

저자가 공개하는 게 없다.

이미징 유동 세포 계측법 단클론 T 세포와 항원 제시 사이 또는 초 항원 24, 25, 26, 27, 28의 존재하에 면역 시냅스 형성을 설명하기 위해 사용되었다. 이 방법은 생산 T 세포 APC 접촉 한 후, T 세포는 접촉 (21)의 위치를 향해 편광 그 액틴 세포 골격 재 배열된다는 사실을 이용한다. 이 재 배열 TCR 시그널링없이 발생하지 않으며, 따라서, T 세포의 활성화 (19), (20), (21)의 초기의 상관 관계이다. 여기에 제시된 방법은 폴리 클로 날 T 세포 개체군 alloreactive T 세포 주파수의 측정에이 방법을 적응시킨다. 따라서, 그것은 미래에 기증자 reactivi에 대한 분석의 개발을위한 기반이 될 수 있습니다<html> 임상 이식에 타이. 직접적인 비교는 아직 이루어지지 않았지만, alloreactive 면역 시냅스의 검출은 기존의 MLR보다 뛰어난 예측 능력을 가지고 나타납니다. 내성 프로토콜은 상술 한 예를 들어, 이전의 연구는 것을 보여 주었다 MLR 결과 확실 그래프트 2 상관 결과 못한다. 이러한 alloantigen에 응답 이펙터 세포의 기능을 측정하지는 않지만 분석법 수많은 인간 9, 10, 11에서의 동작 적 상태에 대한 내성이 개발되어왔다. 반대로, IFNγ ELISPOT 8 계수 이펙터 T 세포 기능 분석되지만, IL-17 (38)와 같은 급성 및 만성 동종 이식 거부 반응과 관련이있다 사이토 카인 분비의 전체 스펙트럼을 캡처 할 수있는,&gt; 39. 노동 집약적 인 제한 희석 분석 4, 쥐를 필요로하는 트랜스 - 생체 분석 (6), 임상 환경에서 자신의 응용 프로그램을 방해 할 중요한 실질적인 한계가 있습니다. MLR에 응답 T 세포의 TCR 서열 분석을 이용하여 세포 증식 분석의 최근 개선이 값이 될 수 있지만 여기에 제시된 분석과 같은, 임상 시험 18 40 추가 검증을 필요로한다. 면역 시냅스 탐지 분석의 추가 개발은 중요한 질문의 번호가 대답하는 것이 필요합니다. 먼저 개발로 분석은 직접 alloreactivity을 측정한다. 직접 경로는 도너 유래 장갑차에 동종 MHC / 펩티드 복합체의 표현을 포함한다. 후자는 일반적으로 이식 후 신속하게 제거하고, 또한 alloantigen 발표되어있다 CARRI그대로 공여 MHC (세미 직접 경로)을 제시받는 장갑차 또는 자기 MHC (간접 경로)에 처리 도너 항원하여 에드. 간접 경로는 만성 동종 이식 거부 (33), (41)의 중요한 드라이버이다. 원칙적으로,이 분석을 이용하여 간접 면역 시냅스를 검출하는 것이 가능해야하지만, 간접적 alloreactive T 세포는 이벤트의 많은 수의 분석이 요구된다는 것을 의미 직접들 (42), (43)보다 훨씬 낮은 주파수를 가지고있다. 두 번째 고려 사항은 우리가 단지 CD8 + T 세포는 항 - 공여 반응의 중요한 구성 요소 인 반면, CD4 + T 세포를 사용하여이 시험을 시험 한 점이다. 다시,이 방법으로 CD8 + T 세포 APC 시냅스를 검출 할 수 있어야한다. 또 다른 한계는 본 방법은 최종 MEMB의 수동 검토 및 세포 영상 분석을 필요로한다는 것이다rane 사용자 연락처 게이트, 우리는 현재이 단계의 자동화에 노력하고 있습니다. 마지막으로, 방법은 인간을 대상으로 테스트 및 개발을 필요로하고, 인간의 샘플 예비 연구는 현재 수행되고있다. 이식 수혜자의 면역 시냅스의 검출과 함께 또한 표현형 T 세포의 부분 집합 분석 (즉, 이펙터, 메모리, 규제 등) alloreactive T 세포 레퍼토리를 특성화하기위한 강력한 접근 방식을 나타내는 것이며, 중요한 초점이 될 것이다 향후 연구.

고형 장기 이식은 신장, 간, 심장, 폐의 말기 질환 환자의 치료를 변형시켰다. 면역 억제제를 사용하지 않을 경우 크고 작은 조직 적합성 항원의 불균형으로 인해, 그러나, 동종 이식은 즉시받는 사람 T 세포에 의해 거부됩니다. 이러한 에이전트는 암과 장기 기능 장애에 대한 위험 등 다양한 부작용을 가지고있다. 주요 임상 목표는 동종 이식 거부 반응을 방지하기 위해 필요한 최소 수준으로 면역 억제제의 용량을 절감하는 것이다. 이 수준은 선천성 면역 시스템의 활성화 정도에 따라 달라질 가능성이 높습니다; 기증자받는 사람 alloantigen 불일치의 정도; 면역 기능, 약동학 및 약력학 및 환자 간 차이. 불행하게도, 이식 임상 정확하게 개별 환자의 1에 기증자의 반응성을 평가하기위한 어떤 도구를 필요가 없습니다. 혼합백혈구 반응 (MLR)의 도너 반응성을 검출 할 수 있지만, 확실 그래프트 결과 (2, 3)를 예측하지 못한다. 제한적인 희석 세이, 사이토 카인 ELISPOTs 및 트랜스 - 생체 분석 중 하나는 반응의 제한된 범위를 측정 또는 연산 오차 9, 10, 11에 관련된 4, 5, 6, 7, 8 개 .Gene 발현 프로파일 밝혀냈다 서명은 실용적이지 않다 (12)과 거부 13, 14, 15, 그러나 이들은 항상 인구 16에서 일반화 할 수없는 궁극적으로 개별 환자의 유용성을 제한 할 수 있습니다. 순서 기반 analyMLR 18 말초 혈액 17에서 증식 T 세포의 T 세포 수용체 (TCR)의 SES도 개발하지만 추가 검증을 요구하고있다. 개념적으로 도너 항원에 의해받는 T 세포 활성화에 필요한 초기 단계를 검출하는 분석을 갖는 것이 바람직하다. 유물을 소개 할 수 있습니다합니다 (MLR 같이) 일 동안 세포를 배양하기 때문에, 이러한 테스트는 이상적으로 이러한 확산 또는 이펙터 기능과 다운 스트림 이벤트의 측정을 필요로하지 않을 것입니다. 테스트는 순전히 기술적 인 평가하기 때문에, T - 세포 기능의 일부 요소에 의존하는 동등하게, 그러나, 그것은 또한 바람직 할 것이다 (예를 들면, TCR 시퀀싱) 아네 르기 기능적 T 세포를 구별 할 수 없을 수도있다. 수많은 연구들은 장기간 T-APC 연락 필수 최초 면역 시냅스의 형성에 필요한 것을 나타낼T 세포 반응 19, 20, 21, 22 단계를 포함한다. 마우스의 10 % CD4 + T 세포가 동종 골수 유래 수지상 세포 (BMDCs) (23) 오래 지속되는 접점을 형성 - 우리는 최근 체외 시간 경과 영상, 약 5 동적 동안, 보도했다. 장시간의 접촉 빈도가 마우스에서 이전에 동일한 항원에 대한 내성을 표현하는 반면, 그래프트 거부 동물이 증대하고, 그것을 쥐 untransplanted 23에서 볼 수준에서 유지되었다. 지속적인 상호 작용을받는 Tregs의 존재 하에서 환원들이 없을 증가, 우리는 인간 T 세포와 동종 단핵구 유래 수지상 세포 (MoDCs) (23)를 사용하여 유사한 현상이 관찰되었다. 그러나, 장기간의 콘택트의 열거는 폴리 클로 날 T 세포 populatio 이내에여기서 n은 시간과 노동 집약적이다. 따라서 우리는 이미지의 사용은 동종 면역 시냅스 형성을 검토하는 유동 세포 계측법했다. 이미징 유동 세포 계측법 계측법, 형광 현미경의 단일 셀 이미징 능력을 가진 종래의 흐름 multiparametric 데이터 획득 및 분석 기능을 포함한다. 이 기술은 단일 클론 T 세포 24, 26, 27 또는 초 항원 (28)의 존재 면역 시냅스 형성을 연구하기 위해 다른 연구자에 의해 사용되어왔다. alloreactive T 세포는 일반적으로 전체 T 세포 레퍼토리 29, 30, 31, 32 5-15 %를 차지하도록 예상되는 반면, 이러한 설정에서, 그러나, 응답 T 세포의 빈도는 30-100 %의 범위이다. 중요한 것은, 우리는 이미징 흐름 세포 계측법 AV를 생성 할 수 있음을 보여 주었다ERY alloreactive T 셀 (23)의 주파수 및 폴리 클로 날 T 세포 집단 내에서 시냅스 주파수의 변화 그래프트 결과 (23)의 예측되는 것을 비교 측정. 현재,이 방법은 원칙적으로 CD4 + T 세포의 직접 alloreactivity을 측정하기 위해 최적화되었지만, 또한 CD8 + T 세포와 간접 경로를 조사하기 위해 개발 될 수있다. 간접 alloreactivity는 이식 후 33 긴 시간에 점점 더 관련 될 것으로 추정된다. 우리는 현재 환자에서 테스트 할 수 있도록 인간의 세포를 사용하려면이 방법을 개발하고있다. 따라서, 미래에 전반적인 접근 방식은 이식 전에 이식에 T 세포 반응의 기능 평가에 유용 할 수있다; 즉시 이식 후; 그리고 장기적으로, 경우에 약물 최소화 중요한 목표된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="706">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Various</td>
			<td align="left" style="width:119px;">Varies</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:287px;">Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="left" style="width:119px;">AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Triton X-100 nonionic detergent</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="left" style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="left" style="width:119px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="left" style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Formaldehyde</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="left" style="width:119px;">F1635</td>
			<td align="left">Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainers, 70 &#956;m pore size</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="left" style="width:119px;">08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Phalloidin-fluorescein isothiocyanate</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="left" style="width:119px;">P5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:287px;">7-aminoactinomycin D</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="left" style="width:119px;">A1310</td>
			<td align="left">Reconstitute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:287px;">Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2</td>
			<td align="left" style="width:133px;">eBioscience</td>
			<td align="left" style="width:119px;">17-0902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:287px;">Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b</td>
			<td align="left" style="width:133px;">eBioscience</td>
			<td align="left" style="width:119px;">48-0112</td>
			<td align="left">Pacific blue has been replaced by eFluor 450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotinylated anti-mouse CD3</td>
			<td align="left" style="width:133px;">eBioscience</td>
			<td align="left" style="width:119px;">13-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotinylated anti-mouse MHC class II</td>
			<td align="left" style="width:133px;">eBioscience</td>
			<td align="left" style="width:119px;">13-5321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotinylated anti-mouse B220</td>
			<td align="left" style="width:133px;">eBioscience</td>
			<td align="left" style="width:119px;">13-0452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotinylated anti-mouse CD8</td>
			<td align="left" style="width:133px;">eBioscience</td>
			<td align="left" style="width:119px;">13-0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotinylated anti-mouse CD19</td>
			<td align="left" style="width:133px;">eBioscience</td>
			<td align="left" style="width:119px;">13-0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-biotin microbeads</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td align="left" style="width:119px;">130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">LS columns</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td align="left" style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">MidiMACS magnetic cell separator</td>
			<td align="left" style="width:133px;">MIltenyi Biotec</td>
			<td align="left" style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">recombinant mouse GM-CSF</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td align="left" style="width:119px;">315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">recombinant human TGF&#946;1</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td align="left" style="width:119px;">100-21</td>
			<td align="left">Human TGF&#946;1 has activity on mouse cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:287px;">Amnis ImageStream X Mark II</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Amnis/EMD Millipore</td>
			<td align="left" style="width:119px;">N/A</td>
			<td align="left">Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:287px;">IDEAS Software</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Amnis/EMD Millipore</td>
			<td align="left" style="width:119px;">N/A</td>
			<td align="left">Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell culture medium&#160;</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Various</td>
			<td align="left" style="width:119px;">Varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Fetal bovine serum</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Various</td>
			<td align="left" style="width:119px;">Varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell culture plates</td>
			<td align="left" style="width:133px;">Various</td>
			<td align="left" style="width:119px;">Varies</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of t cell alloreactivity using imaging flow cytometry

이식에서 공여 항원에 대한 면역 반응의 측정은 성공적으로 감소 또는 면역 억제의 철수에 중요한 될 가능성이 높습니다. 혼합 백혈구 반응 (MLR), 제한 희석 분석 및 트랜스 생체 지연 형 과민 (DTH) 분석이 모든 문제에 적용되어 왔지만,이 방법은 예측 기능 및 / 또는 유용성을 줄이는 중요한 실용적인 한계를 제한. 이미징 유동 세포 계측법 계측법, 형광 현미경의 이미징 기능과 흐름의 양적 multiparametric 전력을 결합하는 기술이다. 최근 도너 항원 제시 세포 (APC를) 성숙한 면역 시냅스를 형성 할 수있는 수신자 T 세포의 비율을 정의하는 촬상 유세포 방식을 사용했다. 잘 특성화 된 마우스 심장 이식 모델을 사용하여, 우리는 결과에 의하면 T-APC의 membr 중 체외 면역 시냅스의 주파수메탄 연락처 이벤트가 강하게 동종 이식 거부, 허용 오차의 결과 및 이식 생존을 유도 규제 T 세포에 의존하는 상황을 예측했다. T-APC 연락처의 주파수는 급성 거부 반응 동안 마우스로부터 T 세포를 증가 alloantigen하는 응답 렌더링 마우스로부터 T 세포를 감소. 시험 관내 시스템 조절 T 세포의 첨가는 장기간 T-APC 접점을 감소시켰다. 결정적으로, 이러한 효과는 또한 자연적으로 인간형 마우스 모델에서 인체 조직의 거부 반응을 제어하기 위해 공지 된 조절 T 세포를 발생 확장 인간 polyclonally으로 보였다. 이 방법의 추가 개발은 이식의 alloreactive T 세포 구획의 깊은 특성을 허용 할 수있다. 향후 발전과 인간의 세포를 사용하여이 방법의 평가는 면역 최소화를위한 환자를 선택하기 위해 사용되는 분석의 기초를 형성 할 수 있고, tolerogen의 영향을 측정하는데 사용될 수있다IC는 병원에서 치료.

이 방법은 이소성 심장 동종 이식하기 전에 공여자 alloantigens 내성 렌더링 마우스에서 CD4 + T 세포 alloreactivity을 조사 하였다. CBA 마우스 (H-2 k)는 (H-2 B B6) 비 - 고갈 CD4 항체 일개월 결합 수혈 전에 B6 심장 이식의 수신에 도너 특정 이루어진 내성 프로토콜을 받았다. Foxp3의 + T 조절 세포 (36) (37)에 의존 장기 이식 생존율이 프로토콜 결과. tolerized B6 및 심장 동종 이식 비 tolerized받는 공동 배양이 프로토콜에 따른 B6 골수 유래 수지상 하였다로부터 이식 후 7 일 후에는, 비장 CD4 + T 세포를 얻었다. 도 2는이 실험의 대표 데이터를 도시한다. 멤브레인 컨택 게이트는도 2에 도시A, 녹색 십자선 시냅스 이벤트에 배치하여 (좌측 패널 (1)) 및 비 이벤트에 시냅스 (오른쪽 패널). 도 2b는이 이벤트의 시야와 형광 채널을 나타낸다. 편견을 줄이기 위해, 데이터 처리 할당 (23)에 눈을 멀게 관찰자에 의해 분석 하였다. 모두 비 tolerized에서도 3에 여러 실시 예에 도시 된 바와 같이 (도 3A-B) 및 tolerized (도 3C-D) B6 하트 CBA 수신자는 시냅스는 T-APC 계면에서 고밀도 FITC 양성 리지의 존재에 의하여 비 시냅스 접촉으로부터 쉽게 구별된다. 이러한 결과는 수신자 T 세포에 의한 면역 시냅스 시각적 검출 수신자에 alloreactivity 정도에 트랙을 보여준다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> 막과 T-APC는 이중의 그림 2. 확인연락처 및 면역 시냅스 형성. 최종 이중 게이트 (도 1F)의 이벤트는 분석된다. 는 APC 객체 마스크 A. T 세포 마커 형광은 DC 객체 마스크 APC 형광 마커에 대해 도시된다. 일부 이중 이벤트가 세포 - 세포 접촉없이 APC와 T 세포가 있고 플롯의 왼쪽 하단 모서리에 표시 (이미지가 표시되지 않음). 멤브레인 컨택 게이트 따라서 T 세포와 항원 제시가 접촉하는 유일한 이중선를 포함 그려 질 수있다. 이 게이트의 각 이벤트의 이미지는 팔로이 딘-FITC 채널에서 액틴 세포 골격 재 배열 증거 검토 및 분석 소프트웨어를 사용하여 태그 될 수있다. 왼쪽 패널은 오른쪽 패널 면역 시냅스 형성없이 막 접촉 이벤트를 나타내는 반면, 면역 시냅스 이벤트 (1로 표시된 녹색 십자선으로 나타냄)를 나타내는 (2로 라벨링 및 녹색 십자선으로 나타냄). 시냅스 형성의 결정은 이들의 수동 검토가 필요이미지, B. B.에 도시 윗줄은 면역 시냅스와 이중선 대한 시야와 형광 채널 영상을 나타낸다 (A 이벤트의 1에 해당); 하단 행 막 접촉하지만 부족한 시냅스 형성 (A 2의 이벤트에 대응)와 이중선을 나타낸다. 데이터 처리 할당에 대하여 맹검 방식으로 분석하고 이전에 출판 실험 23가 됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> T-APC 시냅스 형성의 그림 3. 예. CBA 마우스는 (하나 없음 전처리 (AB) 후, 또는 비 - 고갈 항 CD4 항체의 언더 커버 B6 전혈 내성 유도 후 B6 공여자 심장 동종 이식을받은 <st<html> 룽&gt; CD). 7 일 후, 비장 CD4 + T 세포와 수지상 B6 시냅스 형성에 대해 시험 하였다. A. 비 tolerized 동물에서 막 접촉 비 시냅스 이중선의 세 가지 예를 도시한다. B. 비 tolerized 동물에서 면역 시냅스의 세 가지 예. C. tolerized 동물에서 막 접촉 비 시냅스 이중선의 세 가지 예를 도시한다. D. tolerized 동물에서 면역 시냅스의 세 가지 예. 시냅스 형성은 T-APC 인터페이스 (CH03)에서 밝은 FITC 양성 리지의 존재에 의해 표시된다. 데이터 처리 할당에 대하여 맹검 방식으로 분석하고 이전에 출판 실험 23가 됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> AYS &quot;&gt; <tbody><tr><td> 항체 / 염료 </td><td> 형광 색소 </td><td> 채널 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> 중 CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5 ㎍ / ㎖, 경험적 적정 </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 ㎍ / ㎖, 경험적 적정 </td></tr><tr><td> Phalloidin의 </td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0.05-0.5 ㎍ / ㎖의 </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> CH05 </td><td> 25 ㎍ / mL의 </td></tr></tbody></table> 표 1. 항체이 연구에 사용 된 염료. 형광 색소 - 복합 된 항체, 염료, 공급자, 권장 농도는 표에 제시된다. 각각의 형광 색소를 검출하기 위해 사용 된 채널 사이토 촬상 유량은 표에 도시된다.

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Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이 논문 계측법 촬상 흐름을 사용하여 T 세포의 혼합 집단에서 alloreactivity를 측정하는 방법을 설명한다.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

measurement-of-t-cell-alloreactivity-using-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K 조회수.  University of Toronto and University Health Network.  이 논문 계측법 촬상 흐름을 사용하여 T 세포의 혼합 집단에서 alloreactivity를 측정하는 방법을 설명한다. 

비디오: Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, transports immune complexes, and participates in humoral and cellular immune responses. CR1 is present on the surface of many cell types, including erythrocytes, and exhibits polymorphisms in length, structure (Knops, or KN, blood group), and density. The average density of CR1 per erythrocyte (CR1/E) is 500 molecules per erythrocyte. This density varies from one individual to another (100&#8211;1,200 CR1/E) and from one erythrocyte to another in the same individual. We present here a robust flow cytometry method to measure the density of CR1/E, including in subjects expressing a low density, with the help of an amplifying immunostaining system. This method has enabled us to show the lowering of CR1 erythrocyte expression in diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD), systemic lupus erythematosus (SLE), AIDS, or malaria.

The aim of this method is to determine the CR1 density in the erythrocytes of any subject by comparing with three subjects whose erythrocyte CR1 density is known. The method uses flow cytometry after immunostaining of the subjects&#39; erythrocytes by an anti-CR1 monoclonal antibody coupled to an amplified system using phycoerythrin (PE).

유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

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