Name: scaling of engineered vascular grafts using 3d printed guides and the ring stacking method
Uploaded: 2017-03-27T11:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
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저자는 조직 학적 및 세포 문화의 일부와 그 종류 도움을 우리의 동료 램 실험실 동료 아마르 Chishti 및 Bijal 파텔에게 감사의 말씀을 전합니다. 자금은 웨인 주립 대학의 나노 의학 원정대 (CBP)에 의해 제공되었다, - 시작 업 자금 및 심장 혈관 연구소 씨 그랜트 (MTL).

1. 세포 배양 준비 <ol><li> 시중에서 구입 한 인간의 대동맥 평활근 세포를 활용합니다. </li><li> 88.6 %로 이루어지는 평활근 세포 증식 배지에서 세포를 유지 231 미디어 0.1 % 재조합 인간 인슐린 (RH 인슐린), 재조합 인간 섬유 아세포 성장 인자 (RH-FGF), 재조합 인간 상피 성장 인자 (RH-FGF)의 각 아스코르브 산; 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 L- 글루타민 각각; 1 % 항생제 / 항진균제. 참고 : 각 성장 인자, FBS와 L 글루타민은 혈관 미디어의 성장 키트로 구입하고 있습니다. </li><li> 변경 미디어가 셀 때까지 48 시간마다 약 90 %의 합류 및 조직 시딩에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 확장을위한 미디어의 변화 사이에 인큐베이터에 보관 세포. </li></ol> 2. 3D 프린터로 삽입 및 사용자 정의 실리콘의 제조 성형 판 <ol><li> (예를 들어, 플리 미니) 3D에이 판 인서트를 인쇄 상업용 3D 프린터를 사용합니다. <ol><li> 연산을 사용하여소스 3D 설계 소프트웨어 욕실 등 블렌더로 인쇄 된 외부 쉘과 게시물의 3D 모델을 만들 수 있습니다. </li><li> 3 차원 프린터의 소프트웨어의 이식성을 위해 허용하는 .STL 형식을 통해 모델의 드라이버 파일을 내 보냅니다. </li><li> 3 차원 프린터에 넣은 폴리를 사용하여 인쇄 게시물과 외부 쉘 (젖산) 필라멘트 (PLA) 생성합니다. </li><li> 인쇄 후, 30 분마다 삽입 살균하는 70 % -100 %의 에탄올 용액에 담근 수행한다. </li></ol></li><li> 폴리 (디메틸 실록산) 중합체의 혼합물 (PDMS) 실리콘 중합체를 기반으로 10 분 동안 실온에서 탈기 혼합물 있도록 1:10 경화제를 준비한다. <ol><li> 페트리 접시 소형 (35mm)로 사용 크기 (60mm) 중간 및 대형 (100mm)를 정의합니다. </li><li> 이 용액 4 mL를 각각 각 작은 중간 큰 접시에 경화 실리콘의 6 mL를 넣어 페트리 접시의 전체 바닥에서 얇은 층을 만들 수 있습니다. </li><li> 에 PDMS를 부어 작은 판에 대한 게시물을 작성7mm의 높이 100mm 기판과는 2 ~ 3 시간 동안 60 ℃에서 핫 플레이트 경화 할 수있다. 그런 다음 원통형 게시물을 펀치하기 위해 5mm 생검 펀치를 사용합니다. 각 실린더 PDMS 각각 작은 접시의 중앙에 고정 경화 PDMS의 작은 금액을 사용합니다. </li><li> 중간과 큰 판의 경우, 사전은 판의 하단에있는 PDMS의 경화를 완료 3D 인쇄 게시물을 각각 10mm와 중앙 각 중간과 큰 판에 직경 20mm를 배치합니다. 큰 판의 경우, 추가로 3D 인쇄 된 외부 쉘에게 포스트에서 직경 등거리 약 66.7 mm를 배치합니다. <ol><li> 각 접시 중합체의 탈 18 시간 허용, 2-3 시간 동안 60 ℃에서 핫 플레이트상에서 야외에서 경화 할 수있다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 적절한 영역과 방향으로 판에 인쇄 된 구성 요소를 수정합니다. </li></ol></li><li> 모든 PLA의 내부에 30 분 동안 30 % 증류수 70 % 에탄올의 용액을 추가다음 멸균 TES 및 각 판 커버. </li><li> 조심스럽게 각 플레이트에서 에탄올을 기음과 공기 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 뚜껑, 페이스 업 옆에 생물 안전 캐비닛 (BSC)의 각 판을 정렬합니다. 멸균을 완료하기 위해 30 분 동안 BSC하에 UV 광에 접시 뚜껑을 노출. 무균 기법은 UV 노광 후의 모든 단계를 수행한다. </li></ol></li></ol> 평활근 세포 및 플레이트의 유지 관리와 시드 섬유소 히드로 겔 3. 준비, <ol><li> 각각 작은 중간 큰 접시 크기 0.5 ㎖, 1.1 mL의 1.81 (M1)의 양으로 성장 배지 + 0.01 %의 TGF-β1을 포함 피브린 겔 용액을 혼합한다. <ol><li> 각각, 각 작은 중간 큰 판의 미디어에 100 U / mL로의 재고에서, 40 μL, 88.4 μL 및 트롬빈의 145 μL를 추가합니다. 조심스럽게 그 트롬빈 균등 미디어 내에서 혼합 보장하기 위해 손으로 각각의 판을 소용돌이 친다. </li><li> 다음에, (160)을 추가(1) 20 mg을 주식에서 L, 354 μL 580 μL 피브리노겐은 / mL의 드롭 현명한 원을 트롬빈 미디어 혼합물에 각각의 작은 중간 큰 판에 각각. 부드럽게 더 레이어로 혼합하여 하이드로 겔의 분포를 확인하기 위해 손으로 소용돌이 친다. </li><li> 하이드로 겔은 실온에서 10~15분에 대한 치료 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 를 Trypsinize 평활근 세포는 표준 프로토콜에 따른 150mm 세포 배양 접시와 원심 분리기에서 확장. 미디어 (231), 1 % FBS, 1 % 항생제 / 항진균제 - 생성 된 펠렛을 98 %로 구성된 분화 매체 3 ㎖에 재현 탁한다. <ol><li> 적극적으로 모든 세포 덩어리를 깨고 2 mL를 피펫와 적정에 의해 아래로 세포를 혼합한다. 혈구와 세포를 계산 및 / mL의 작은 중간 큰 판에 대한 각각 2 × 10 6 세포 / ㎖, 1.0 × 10 7 세포 / ㎖의 1.4 × 10 7 세포의 세포 현탁액을 만들 수 있습니다. </li><li> 각각의 세포 현탁액의 INT의 1 ML을 추가합니다OA 50 ML 원뿔을 대응하는 작은 중간 및 대형 레이블. 원하는 각 추가 조직 링이 방식으로 추가로 50 ML 원뿔을 설정합니다. </li><li> 각각, 각 작은 중간 및 대형 선박 2 mL를 4 mL의 5 ㎖의 최종 시드 볼륨을 얻기 위해 각 원추형으로 차별화 미디어를 추가합니다. 그런 다음, 조심스럽게 적가 각 해당 판에서 제조 된 하이드로 겔 위에 셀 솔루션을 피펫. </li><li> 37 ° C에서 인큐베이터 5 % CO 2에 장소 플레이트. </li></ol></li><li> 변경 차별화 미디어 각 판마다 48~72시간. 큰 플레이트의 경우에, 그 후, 처음 24 시간 후에 매체를 변경 대 세포 접종 밀도를 보상하도록마다 48-24시간 변경. <ol><li> 반지로 2-4일 완전히 포스트쪽으로의 계약을 체결 한 것입니다 후, 각각 각 작은 중간 및 대형 링에 10 μL, 20 μL 및 TGF-β1의 35 μL를 추가합니다. TGF-β에 노출 된 후1 최소 24 시간, 고리는 처리 할 준비가 된 것입니다. </li></ol></li></ol> 혈관 구축 및 유지 보수 4. 조립 <ol><li> 최종 혈관 구조의 제조하기 전에, 전문 용기는 완성 된 선박을 보유 만들어집니다. <ol><li> 작은 용기를 들어, 50 mL의 폴리 카보네이트 원뿔 관의 맨 오프 2 인치 부분을 절단하여 링 스태킹 키가 큰 판을 만든 다음 PDMS 35 밀리 판으로 절단 가장자리를 붙입니다. 판 덮개로 원추형 뚜껑을 사용하십시오. </li><li> 판을 적층 중간 및 대형 용기 키 링의 경우, 길이 키가 큰 판 벽 역할을하는 2.5 인치 섹션으로 1.75 인치 직경의 폴리 카보네이트 튜브를 잘라. 키가 큰 접시 바닥의 경우, 2 인치 직경의 원형 조각으로 0.125 인치 두께의 폴리 카보네이트 시트를 잘라. 아크릴계 시멘트 용매를 사용하여 원형 절단 부분에 폴리 카보네이트 튜브 섹션을 결합한다. 키가 큰 접시의 뚜껑으로 60mm 페트리 접시에서 뚜껑을 사용하십시오. </li><li> 3D 피RINT 포스트 (5)의 직경 (10)과 20 mm, 길이 50 ​​mm이다. </li><li> 각 컨테이너에 경화 실리콘의 10 ML을 추가합니다. 앞서 PDMS의 전체 경화, 중앙 각 작은 중간 및 대형 용기에 단계 4.1.3에서 만든 각 게시물을 배치합니다. </li><li> 2-3시간 60 ° C에 핫 플레이트 세트에 치료 할 수 있습니다. </li><li> 30 분 동안 30 %의 증류 물을 70 % 에탄올 용액으로 소독. </li><li> 조심스럽게 각 컨테이너에서 에탄올을 대기음 후, BSC 공기 건조를 할 수 있습니다. 다음, 뚜껑, 페이스 업 옆에 배치 각 플레이트와 후드의 컨테이너를 정렬합니다. 상기 멸균 추가 30 분 동안 BSC하에 UV 광에 노출 용기. 자외선 노출 후 모든 단계 멸균 기술을 사용합니다. </li></ol></li><li> 아주 좋은 집게를 사용하여 조심스럽게 게시물에서 각 단단히 압연 평활근 하이드로 겔 링을 제거하고 높은 게시물과 그에 대응하는 더 큰 용기에 전송할 수 있습니다. <ol><li> 한 쌍을 사용하여각 손에 집게와는 게시물에서 반지의 한쪽을 들어 올린 다음 다른. 보호하고 루멘 유지에주의해야합니다. </li><li> 키가 큰 포스트에 첫 번째 측면, 반지의 다음 다른 쪽을 슬라이딩,이 두 손 방법으로 전송을 수행합니다. 부드러운, 점진적으로 운동을 사용하여 원주 작업, 천천히 키가 큰 포스트에 내려 반지를 밀어 넣습니다. 원하는 선박 길이가 각 원형은 완성 된 구조체에 길이 약 1-2mm를 추가로 획득 할 때까지 계속해서 조직 고리를 스택. </li></ol></li><li> 포스트는 작업 표면과 평행이되도록 키가 큰 3D 인쇄 된 게시물에 위치 링 스택, 접시를 켭니다. <ol><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 각각, 각 작은 중간 큰 용기의 외면에 부드럽게 100 U / ㎖의 농도로 트롬빈의 40, 80, 160 μL를 추가한다. 트롬빈을 추가하는 동안 천천히 구조의 모든 표면의 범위를도 보장하기 위해 판을 돌립니다.이 건설 후 초기 일 링 스택 구조를 확보하기 위해 사용되는 섬유소 접착제의 기본이 될 것입니다. </li><li> 다음으로, 빨리 구조체를 회전시키면서 마이크로 피펫을 사용하여 각각, 각 작은, 중간, 큰 구성하는 20 ㎎ / ㎖ 농도의 피브리노겐 40, 80, 160 μL를 추가한다. 트롬빈 및 섬유소원 빠르게 한 번 혼합 회사 겔로 설정합니다. 때문에 짧은 경화 시간에 가능한 한 신속하고 균일하게 피브리노겐을 적용합니다. </li></ol></li><li> 구조물을 들고 각 컨테이너에 분화 매체의 20 ML을 추가합니다. 37 ° C를 인큐베이터에 배치 용기가 필요할 때까지. 모든 3~5일 미디어를 변경합니다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

반지 스태킹 방법은 현재의 혈관 조직 설계 구조 기술을 통해 여러 이점을 제공합니다. RSM은 단순히 포스트 및 외부 쉘 크기를 사용자 정의하여 모든 규모의 인간의 혈관을 생성하도록 할 수 있습니다. 우리의 방법은 인간 세포만을 급속 신체의 자연적인 상처 치유 과정에서 발견 된 지지체 물질을 분해 이루어지는 중합체 프리 설계된 선박 개발을 허용한다. 폴리머 이식은 병원에서 재 협착을 일...

관상 동맥 질환 (CAD)의 치료에있어서, 환자 자신의 혈관 우회로 수술 이식 재료로서 수거된다. 그러나, 자주, 병 환자는 자신에 기부 가능한 용기를 가지고 있지 않으며, 그들이 할 경우, 기증자 사이트는 상당한 추가 피해를 발생 및 감염에 대한 심각한 위험이있다. 1 엔지니어링 혈관 이식이 필요를 채울 수있다. 확장 성 환자의 혈관 크기 요구의 넓은 범위를 충족하기 위해 설계 선박 가장 중요하다. 그러나, 엔지니어링 선박에 대한 본 발명의 방법은 쉽게 확장하지 않고, 일반적으로 복잡한 금형 또는 고분자 지지체의 재생산을 필요로한다. 대부분의 이식 혈관 섬유 아세포, 평활근, 또는 내피 세포 시딩 중합체 관형 지지체를 이용하거나 설계; 또는 맨드릴 주위에 세포 시트를 압연 조직 튜브를 만들 수 있습니다. 임상 시험에서 두 설계 혈관 이식은 decellularize을 기반으로D 폴리머 ECM 플랫폼입니다. 혈관 복구에 사용 가능한 2, 3, 4 중합체 이식 이미 지속적인 중합체 존재감 그래프트 장기간 용도에 중요한 문제로 발생할 수있는 문제 개통을 갖는 것으로 알려져있다. 관형 주형 절차는 다양한 크기의 혈관을 생성하기 위해 사용자 정의 금형 추가적인 설계 및 공구 제조를 필요 13 된 완전 세포 선박, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12를 제조하는데 사용되어왔다 . 본원에 기재된 방법은 쉽게 확장 설계 혈관을 생성하기위한 신규 한 기술을 포함사용자 정의 3D 인쇄 인서트와 전통 문화 판을 사용하여 접목. 셀 (14)은 중앙 후와 외피의 인서트 플레이트에 시딩 하였다. 포스트 컨트롤은 직경 루멘과에 세포 단층 조직의 반지에 자기 조립 수 있습니다. 외측 링의 쉘 두께를 제어하고, 따라서 최종 용기의 벽 두께. 완성 된 티슈 링 후 관상 혈관 그래프트를 형성하기 위해 적층된다. 이 방법의 장점은 &quot;링 스태킹 방법&quot;를 지칭하는 부착 성 세포 유형 단순히 수정 가이드 삽입함으로써 생성 될 수있는 플레이트 셋업 및 조직 환 또는 원하는 응용에 필요한 크기의 튜브에 접종 될 수 있다는 것이다. 조직의 조직 공학 작성 반지의 비교 기술은 각각의 원하는 크기 금형의 재생산을 필요로하는 규모, 15, 16 어려운 남아있다. 또한, 혈관 이식이 생성 될 수있다이 방법을 사용하여 만든2-3 주 내에 D는 몇 주 빨리 다른 설계 선박에 비해. 도 6은 병원,이 시간 차이는 저하 환자의 치료에 유의 한 차이를 만들 수있다.

<table><tbody><tr><td>Human Aortic Smooth Muscle Cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td>vascular smooth muscle cells</td></tr><tr><td>Medium 231</td><td>Gibco (Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>M-231-500</td><td>media specific to vascular smooth muscle cells</td></tr><tr><td>Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PSC-100-042</td><td>growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability</td></tr><tr><td>Replicator Mini 3D printer&amp;nbsp;</td><td>MakerBot&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)</td><td>MakerBot&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D printer filament</td></tr><tr><td>Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)</td><td>Ellworth Adhesives&amp;nbsp;</td><td>3097358-1004</td><td>polymer for gluing plate parts</td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Hyclone Labratories, Inc.</td><td>SH30256.01</td><td>fibrin gel component</td></tr><tr><td>Thrombin&amp;nbsp;</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>F3879-5G</td><td>fibrin gel component</td></tr><tr><td>Tranforming Growth Factor-Beta 1&amp;nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>growth factor for stimulating collagen production</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Polycarbonate tubing&amp;nbsp;</td><td>US Plastics&amp;nbsp;</td><td>PCTUB1.750X1.625</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Polycarbonate sheet&amp;nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>409497</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Adhesive polymer solvent&amp;nbsp;</td><td>SCIGRIP</td><td>10799</td><td>material for making tall, ring stacking plates</td></tr><tr><td>Instron 5940</td><td>Instron</td><td>N/A</td><td>tensile testing machine</td></tr><tr><td>U-Stretch</td><td>Cell Scale</td><td>N/A</td><td>tensile testing machine</td></tr><tr><td>Smooth Muscle Actin&amp;nbsp;</td><td>MA5-11547</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Tropomyosin</td><td>MA5-11783</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr></tbody></table>

scaling of engineered vascular grafts using 3d printed guides and the ring stacking method

관상 동맥 질환은 수백만의 미국인에 영향을 미치는 주요 사망 원인이 남아있다. 가능한자가 혈관 이식의 부족으로 설계 이식 환자의 치료에 큰 잠재력을 제공합니다. 그러나, 설계 혈관 이식은 일반적으로 쉽게 확장되지 않은 시간과 비용이 많이 드는 연습을 구성, 서로 다른 크기를 사용자 정의하기 위해 사용자 정의 형 또는 폴리머 튜브의 제조를 요구. 인간의 동맥은 약 2.0-38 mm에서 약 0.5-2.5 mm의 벽 두께 내강 직경에 이르기까지 다양합니다. 우리는 방법을 만들었습니다, 원하는 세포 유형의 조직 가변 크기 반지, 혈관 평활근 세포 여기 입증하는 &quot;반지 스태킹 방법&quot;(SMCs을)라고, 내강 직경을 제어하는 ​​중앙 포스트의 가이드를 사용하여 만들 수 있습니다 및 외부 쉘은 혈관 벽 두께를 지시합니다. 이러한 티슈 링 후 혈관의 자연적인 형태를 모방하는 관형 구조물을 만드는 적층된다. 혈관 길이는 수 b즉 단순히 필요한 길이를 구성하는 데 필요한 벨 횟수 적층 원단. 우리의 기술로, 혈관 유사 관 형태의 조직 용이 병원 및 환자의 요구에 맞는 치수 및 다양한 길이로 제조 될 수있다.

여기에 입증 된 것은 반지 스태킹 방법 (RSM)는 확장 성이 있음을 보여주는 3 가지 설계 혈관 이식 크기 (그림 1)의 제조입니다. 적용 가능성을 증명하기 위해, 3 개의 다른 용기 크기는 동맥 좌전 하행에 대한 실제 인간의 혈관 크기에 상관 관계를 선택 (작은 직경 루멘 = 4mm) 17 (중간 직경 루멘 = 10mm) 대동맥 내림차순과 상행 대동맥 (대형; 내강 ?...

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Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

확장 가능한 설계 혈관 임상 적용 가능성을 향상시킬 것입니다. 쉽게 상당한 3D 인쇄 가이드 사용, 혈관 평활근의 고리가 생성되었고, 혈관 이식을 형성, 튜브형 형태로 쌓여있다. 이식 단순히 3D 인쇄 된 안내서의 크기를 변화시킴으로써 인간 동맥 치수의 범위를 만족하는 크기로 할 수있다.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K 조회수.  Wayne State University.  확장 가능한 설계 혈관 임상 적용 가능성을 향상시킬 것입니다. 쉽게 상당한 3D 인쇄 가이드 사용, 혈관 평활근의 고리가 생성되었고, 혈관 이식을 형성, 튜브형 형태로 쌓여있다. 이식 단순히 3D 인쇄 된 안내서의 크기를 변화시킴으로써 인간 동맥 치수의 범위를 만족하는 크기로 할 수있다. 

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

연구

생체공학

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

티슈 엔지니어링 혈관 이식 및 이후의 이식을위한 수술 기법<em&gt; 생체</em&gt; 모니터링

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, structures, phenotypes, and performance depending on each specific perfused tissue. The field of tissue engineering, which aims to repair or replace damaged or missing body tissues, relies on controlled angiogenesis to create a proper vascularization within the engineered tissues. Without a vascular system, thick engineered constructs cannot be sufficiently nourished, which may result in cell death, poor engraftment, and ultimately failure. Thus, understanding and controlling the behavior of engineered blood vessels is an outstanding challenge in the field. This work presents a high-throughput system that allows for the creation of organized and repeatable vessel networks for studying vessel behavior in a 3D scaffold environment. This two-step seeding protocol shows that vessels within the system react to the scaffold topography, presenting distinctive sprouting behaviors depending on the compartment geometry in which the vessels reside. The obtained results and understanding from this high throughput system can be applied in order to inform better 3D bioprinted scaffold construct designs, wherein fabrication of various 3D geometries cannot be rapidly assessed when using 3D printing as the basis for cellularized biological environments. Furthermore, the understanding from this high throughput system may be utilized for the improvement of rapid drug screening, the rapid development of co-cultures models, and the investigation of mechanical stimuli on blood vessel formation to deepen the knowledge of the vascular system.

Engineered tissues heavily rely on proper vascular networks to provide vital nutrients and gases and remove metabolic waste. In this work, a stepwise seeding protocol of endothelial cells and support cells creates highly organized vascular networks in a high-throughput platform for studying developing vessel behavior in a controlled 3D environment.

스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

Standardized Technique of Aortic Valve Re-implantation for Valve-sparing Aortic Root Replacement

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures prevents a number of cardiac surgeons from incorporating them into their practice. The aim of this protocol is to describe a simplified and user-friendly technique of an aortic valve-sparing root replacement (VSRR) procedure by re-implantation of the aortic valve. Proper selection of patients and limitations of the technique are discussed.
In 54 consecutive patients, normal appearing aortic valves were re-implanted in a commercially available polyester prosthesis with pre-shaped sinuses by a simplified and standardized technique. Placement of the first row of the proximal suture line, choice of the prosthesis size, and adjustment of the height of the commissures of the patient to the fixed height of the sinus portion of the prosthesis were slightly modified from the reference techniques with the aim of increasing its feasibility for use by other cardiac surgeons. Early mortality and morbidity as well as 5-year survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were collected in all patients.
Thirty-day mortality, re-sternotomy for bleeding, re-sternotomy for mediastinitis, and the incidence of stroke were very low, 1.8% for each (1 of 54). No patient required permanent pace-maker implantation. At 5 years, survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were 97.5%, 95.2%, and 91.6%, respectively.
Mid-term results of our standardized technique of re-implantation of the aortic valve for valve-sparing aortic root replacement are very good and compare with more complex techniques reported by experienced surgeons. By following the present protocol of the standardized re-implantation technique, a greater number of cardiac surgeons can perform this procedure with comparable good results.

Valve-sparing aortic root replacement has the advantage of preserving the patient&#39;s own aortic valve. The complexity of the reported techniques to date restricts their use to a limited number of cardiac surgeons. This protocol describes step-by-step a standardized technique reproducible by a greater number of cardiac surgeons.

대동맥 밸브 밸브 스페어링 대동맥에 다시 주입의 표준화 된 기술 루트 교체

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures ...

의학

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

복잡 한 대동맥 변칙의 3 차원 인쇄

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...