저자는 기꺼이 CNC 가공과 그의 도움 닐 Whitehouse (WPI, 히긴스의 기계 공장)을 인정합니다. 또한, 우리는 Camtasia와 도움을 MATLAB 프로그래밍뿐만 아니라, 케이트 음료와 요셉 Cotnoir (WPI 학술 기술 센터)와 그녀의 도움 아드리 아나 헤라를 (WPI 컴퓨팅 및 커뮤니케이션 센터) 감사드립니다. 소피 벅 및 Jacleen 베커 (WPI 학술 기술 센터)는 보충 영상을 제공했습니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (R15 HL097332), UMass 의과 대학 - WPI 파일럿 연구 이니셔티브, 미국 심장 협회 (JZH에 학부 연구 활동) 및 우스터 폴리 테크닉 대학 (JZH 및 기관에 여름 대학의 연구 활동에 의해 투자되었다 ) MWR에 자금 업을 시작합니다.

1. 세포 시딩 금형 제조 2mm의 중심지 포스트 직경 15, 둥근 바닥, 환상 우물을 만드는 폴리 카보 네이트의 1 / 2 &quot;두께 부분을 밀링하여 시작합니다. 가공된 채널은 6 깊은 mm 넓은 3.75 mm입니다. 클린 및 폴리 카보 네이트 몰드를 건조 밀링 과정에서 모든 플라스틱 파편을 제거합니다. 모든 공기 방울을 제거하고 폴리 카보 네이트 몰드에 부어으로 치료 대리인, 가스를 제거하다하는 기지의 10시 1분 비율 (W / W)에 혼합 polydimethylsiloxane (PDMS). 가스를 제거하다 다시 남아있는 거품을 제거하고 4 시간 동안 60 ° C에서 오븐에 치료. 일단 치료, 조심스럽게 천천히 폴리 카보 네이트에서 물러나고하여 PDMS 템플릿을 제거 비누와 물로 씻어, 그리고 압력솥. 또한 2퍼센트 아가로 오스 (W / V) Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 용해의 솔루션을 압력솥. 수준의 표면에 PDMS 템플릿을 놓고 용융 아가와 함께 기입<html> 중앙 게시물 금형의 각에 첫번째 pipetting 아가로 오스 상승하고 주변 공간에 pipetting. 아가로 오스가 (약 15 분) 응고하도록 허용 후 PDMS에서 아가로 오스를 공개 금형을 반전. 우물의 각 주위에서 초과 아가로 오스 잘라, 그리고 12 - 잘 접시에 아가로 오스 우물을 넣으십시오. 2. 세포 배양 및 링 시딩 금형의 상단을 포함하지 않고, 아가로 오스 금형의 외부 주위 세포 문화 미디어 (10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM) 추가합니다. 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다하고 세포를 준비하는 동안 그들이 약 15 분 동안 평형 수 있습니다. 90 % 합류에서 쥐의 대동맥 평활근 세포 (rSMCs)을 trypsinize 및 5x10 6 세포 / ML의 농도에 resuspend. 각 잘하는 세포를 적용하는 원운동을 사용하여 고리 모양의 아가로 오스 우물의 각으로 세포 현탁액의 피펫 100 μL. 컨텐츠 &quot;&gt; 있는지 인큐베이터 선반이 수준 아르 확인 후 인큐베이터에서 접시를 배치하고 24 시간 동안 그대로 앉아하실 수 있습니다. 교류 매체는 이틀 이후 잘 주위에서 미디어를 aspirating하여 다시 작성 각 잘 때까지 아가로 오스는 잘 완전 침수입니다. 3. 조직 링 수확 및 두께 측정 문화의 결론에서, 중앙 게시물의 맨 위에 그것을 슬라이딩하여 아가로 오스 금형에서 반지를 제거합니다. 인산염과 작은 배양 접시에있는 반지를 놓고는 식염수 (PBS), 센터에게 샘플을 버퍼 및 디지털 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득. 에지 검출을위한 이미지 분석 프로그램을 사용하고 둘레 약 4 위치 (상단, 하단, 왼쪽 및 오른쪽)에있는 고리의 두께를 측정합니다. 각 반지에 대한 의미 두께 값 (t)를 계산하고, 단면적을 계산하려면이 값을 사용(2π (T / 2) 2). 4. 반지의 기계적 시험 수평 위치에 인장 시험기를 (Instron EPS 1000)를 설정합니다. 1N ± 1mN로드 셀 및 사용자 지정 얇은 와이어를 그립 (스테인레스 스틸 와이어를 절곡하여 만든) 연결합니다. 두 얇은 와이어 그립에있는 반지 샘플을 탑재합니다. 5 MN 살갈퀴로드가 샘플에 적용 때까지 그립를 확장합니다. 단면적을 (두께 측정으로부터 계산)를 입력하고 게이지 길이를 기록합니다. 사전 사이클 8 배 10mm / 분 속도로 살갈퀴 하중 50 kPa 응력 사이의 반지. 미리주기 여덟째 후, 10mm / 분 실패로 당기십시오. 실패 한 측정에서 다음 40 % 강제의 감소로 기록됩니다. 각 반지 샘플은 궁극적인 인장 응력 (UTS)와 파괴 변형도를 측정하고 취득한 데이터의 최대 접선 계수 (MTM)를 계산합니다. 5. 조직 링으로sembly 조직 튜브를 조작하는 사용자 정의 튜브 소유자는 직사각형 단편 (2cm × 3 ㎝)과 원형 5cm 폴리 카보 네이트 디스크에서 가공됩니다. 이 홀더가 함께 끝장 수 있도록이 디스크를 통해 스레드 구멍을 드릴. 사용자 정의 튜브 홀더를 압력솥 다음 biosafety 캐비닛과 빈 배양 접시에있는 곳으로 전송할 수 있습니다. beveled 가장자리를 만들 수있는 각도로 1.9 mm 직경의 실리콘 튜브의 끝부분을 잘라 다음 실리콘 튜브를 압력솥에 외과 가위를 사용합니다. 튜브가 autoclaved되고있는 동안, 미디어 페트리 접시를 입력하십시오. 아가로 오스 우물에서 반지를 제거하고 미디어와 페트리 접시에 놓으십시오. 장소 사용하기 전에 그들을 엿먹일 수 같은 배양 접시에있는 실리콘 튜브를 autoclaved. 고리의 중심에 실리콘 튜브의 끝부분을 beveled 장소 부드럽게 실리콘 튜브에 반지를 슬라이드 집게를 사용하십시오. RI의 원하는 번호와 반복ngs. 부드럽게 튜브를 따라 양쪽 방향으로 연속 그들을 밀어 서로 접촉으로 반지를 슬라이드. 이 방법은 문화의 한 다음날 수확 고리 사용할 수 있습니다. 일단 고리는 폴리 카보 네이트 홀더 내에 실리콘 튜브를 정렬하고 함께 홀더의 두 부분을 나사, 탑재하고 있습니다. 100mm 배양 접시에있는 홀더를 놓고 55 ML 미디어를 추가합니다. 문화의 기간 동안 교환 언론 매 3 일. 조직 튜브를 제거하려면, 폴리 카보 네이트 홀더에서 실리콘 튜브를 출시하고 실리콘 튜브를 끄고 PBS 가득한 페트리 접시에 조직 튜브 슬라이드 집게를 사용합니다. 6. 대표 결과 : 프로토콜이 올바르게 수행되면, 세포는 24 시간 이내에 대응하는 금형 게시물의 직경과 동일 내부 직경 조직 반지를 형성 집계. 링 가장자리는 보통 외모에 부드럽고 (있다면 cultur수준의 표면에 에드), 전체 원주 주위의 두께를 균일하고 있습니다. 조직 반지는 취급하기 쉽고 후속 기계 및 histological 분석을 위해 자신의 우물 (Gwyther 외에 참조하십시오. 2011 년 8)에서 제거할 수 있습니다. 조직 링 형태, 매트릭스 구성과 기계적 성질이 씨앗 세포의 수와 유형에 따라 다릅니다. , 세포 유형을 다양한 조건을 퍼뜨리고, 문화의 길이로 만들어진 조직 링의 대표 결과는 표 1에 표시됩니다. 5x10 5 rSMCs에서 만든 두 mm ID의 고리는 우리 이전에 출판 2mm 고리 (6.6x10 5 rSMCs로 만든)에서 만든 반지보다 높은 UTS를 전시. 쥐의 세포, 인간의 평활근 세포 (hSMC)와 마찬가지로 8 즉시 조직을 형성하는 총체적 문화의 겨우 14 일 (데이터가 표시되지 않음) 후 콜라겐의 큰 금액을 포함 반지. 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)도 집계와 응집 고리를 형성하지만, LAuniaxial 인장 시험의 초기 precycling의 단계에서 cked 기계적 강도와 부러 졌어요. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> N </td><td> 핸드폰 번호 </td><td> 두께 (mm) </td><td> 문화의 길이 (일) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> 파괴 변형 (㎜ / ㎜) </td></tr><tr><td> rSMC 반지 </td><td> 6 </td><td> 660,000 </td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMC 반지 </td><td> 4 </td><td> 500,000 </td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> hSMC 반지 </td><td> 3 </td><td> 750,000 </td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSC 반지 </td><td> 3 </td><td> 750,000 </td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 표 1. 문화 매개 변수와 다른 세포 유형, 시딩 농도, 그리고 문화에서 발생 기간이 2mm 반지의 기계적 성질을 보여주는 표. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" /> 그림 1. 조직 링 생성 과정 (A) 도식. 가공된 환상 웰스와 (B) 정의 폴리 카보 네이트 몰드. 중앙 포스트 지름은 2mm입니다. 그것은 폴리 카보 네이트 몰드 멀리 벗겨 이후 (C) PDMS 템플릿. (D) 집계 조직 반지는 2mm 포스트와 아가로 오스의 금형에 교양. PBS에서 (E) 2 mm 직경 조직 반지. 스케일 바 = 6mm (B, C)와 2mm (D, E). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" /> 그림 2. 응력 - 변형 곡선 produ 대표 플롯uniaxial 인장 시험에서 뭐하는거야.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

최근 셀 기반 또는 &quot;비계 - 이하&quot;조직 공학 방법 발판 기반 조직 공학 접근의 한계 중 일부를 주소에 관심이 증가되었습니다. 셀 - 파생 조직이 세포에서 생성되고 그들이 생산 매트릭스가, 그들은 본질적으로,보다 높은 세포 밀도를 포함하는 더 외인성 물질을 포함하지 않으며, 인간의 세포와 단백질에서 완전히 만들 수있는 것으로 감안할 때. 인간의 세포로 만든 혈관 이식은 외인성 공사장 공중 발판의 부재 (예 : 버스트 압력 인간 saphenous 정맥을위한 1600 mmHg에 비해 3400 mmHg) 12 상당한 기계적 강도를 얻을 수 있습니다. 셀 기반의 혈관 조직이 개선 세포 밀도와 기계적 강도, 최신 제조 방법 (예 : &quot;시트 기반 엔지니어링&quot;3,4,12 또는 &quot;bioprinting&quot;5,13 등) 전시 있지만 광범위한 문화 기간 (&gt; 3 개월) 필요하거나 3D 조직 건설을위한 전문 장비. 셀 - 파생 조직 링 메스OD 시간이 짧은 기간 내에 그리고 전문 장비를 사용하지 않고 강력한 3D 조직 구조를 형성 급속한 세포 자기 조립을 가능하게 여기 설명했다. 이 프로토콜은 자세한 내용은 우리가 2mm 내경 쥐 평활근 세포 - 파생 조직 반지를 작성하기 위해 개발된 프로 시저를. 현재 예제에서는, 조직 링은 7 일 (다음 링 융합 및 튜브 형성을위한 추가 7 일 동안 교양)에 대한 교양되었습니다. 그러나, 세포 시딩 후 하루가 일찍 2mm의 쥐 (인간) 평활근 세포 고리가 우물에서 제거 (실리콘 튜브에 예를 들어, 전송)을 처리하기에 충분한 응집 아르 수 있습니다. 또한, 내부 지름 (2, 4 및 6mm)을 변화와 함께 강력한 조직 고리는 단순히 원래의 폴리 카보 네이트 몰드의 게시물 직경을 변경하여이 방법으로 만들 수 있습니다. 여덟 우리는 또한 최근에 오 2를 사용하는 폴리 카보 네이트 금형 설계를 수정 하나의 멀티 - 글쎄 아가로 오스 챔버에서 주조 수 mm의 시딩의 우물, 어떤PDMS와 아가로 오스 이하를 사용하고, 6 자 플레이트 (데이터가 표시되지 않음) 중 하나에 잘 맞는 데요. 포스트 직경의 변화는 잘 시딩의 너비가 둥근 하단의 곡률 반경은 시딩의 우물, 또는 시딩의 우물의 깊이의 숫자는 모두 CNC를위한 CAD 파일의 규격을 변경하여 간단하게 수정할 수 있습니다 폴리 카보 네이트 금형의 가공. 마지막으로, 하나의 폴리 카보 네이트 몰드는 PDMS 템플릿 무제한를 조작하는 데 사용할 수 있으며 각 PDMS 템플릿 청소 수 autoclaved와 수십 번 재사용. 기본 쥐 SMCs (셀 응용 프로그램, R354 - 05), 기본 인간의 관상 동맥 SMCs (Lonza, CC - 2583), 기본 인간 : 조직 반지의 크기를 변경하는 것 외에도, 우리는 다음을 포함한 여러 세포 유형에서 반지를 만들었습니다 피부 섬유아 세포 11 조 (박사 조지 핀의 관대한 선물, 의생명 공학의 WPI 공학과), 쥐의 폐 섬유아 세포 (RFL - 6, ATCC CCL - 192) 및 mesenchymal 줄기 세포 (Lonza, 태평양 표준시-2501). 이러한 셀 형식 집계 및 조직 고리를 형성하는 중심 포스트 주위에 계약의 각, 세포 조직, ECM 구성 및 구조의 기계적 물성은 각 세포 유형에 따라 다를 있지만. 각 세포 유형에 대한 시딩 매개 변수는 경험적으로 세포의 크기와 능력 총계에 기초하여 결정되어야합니다. 셀 - 파생 조직 반지를 만드는이 시스템은 매우 다양한 반면 따라서, 프로토콜은 서로 다른 세포 유형과 최적의 조직 형성에 대한 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 설명한대로 조직 링 기하학은 uniaxial 인장 시험에 의해 조직 재료 특성을 쉽게 로딩 및 평가를 용이하게합니다. 혈관 수축과 생리 기능을 측정하기 위해 혈관 링 세그먼트를 사용하기위한 실질적인 전례도있다. 예비 연구는 세포 - 파생 조직 반지는 약리 반응의 측정을위한 와이어 myograph 장치에 설치할 수 있습니다함을수축성 힘 세대 (데이터가 표시되지 않음). 모두, 빠르게, histological 기계적, 생리적 및 생화 학적 분석을 위해 자기 조립 셀 반지를 조작하는 능력은 건강과 질병에 혈관 조직 구조와 기능을 모델링하는 데 유용할 수 있습니다 강력한 새로운 도구를 제안합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> 다우 코닝 </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> Lonza </td><td> 50,000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017 - 이력서 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05 - 201 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Mediatech </td><td> 30-002 - CI </td></tr><tr><td> 디지털 이미징 시스템 </td><td> DVT 주식 회사 </td><td> 모델 630 </td></tr><tr><td> Uniaxial 시험기 </td><td> Instron </td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td> 가장자리 감지 소프트웨어 </td><td> DVT 주식 회사 </td><td> 프레임 워크 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering

매년 환자의 수천 수백 미국의 관상 동맥 바이패스 수술을 받고있다. 이들 환자 중 1 약 1 세 번째 질병의 진행 또는 이전 수확에 의한 적합한 autologous 기증자 선박이 없습니다. 혈관 조직 공학의 목적은 이러한 바이패스 이식에 적합한 대체 소스를 개발하는 것입니다. 또한, 설계된 혈관 조직이 심장 질환을 공부 혈관 모델을 생활로 귀중한 증명할 수 있습니다. 엔지니어링 혈관에 여러 약속 접근이 많은 최근의 연구는 셀 기반 방법의 개발과 분석에 초점을 함께 살펴왔다. 2-5 계약은, 우리는에서 사용할 수있는 3 차원 조직 반지에 신속하게 자기 조립 전지하는 방법을 제시 체외은 혈관 조직을 모델로. 이렇게하려면, 평활근 세포의 정지는 둥근 바닥 환상 아가로 오스 우물에 씨앗을 품고있다. 아가로 오스의 비 접착 특성은 일 수전자 세포가 응집 조직 고리를 형성하기 위해 우물의 중심에 게시 주위, 집계 및 계약을 해결합니다. 6,7이 반지는 이전 기계, 생리, 생화학, 또는 histological 분석을 위해 수확 몇 일 동안 교양 수 있습니다. 우리는이 세포 - 파생 조직 반지 비슷한 기간이 (&lt;30 kPa)에 대한 교양 다른 조직 공학 혈관 구조에 대해 보고된 값을 초과 100-500 kPa 최고의 인장 강도 8시 항복하는 것으로 나타났습니다. 9,10 우리의 결과는 강력한 세포를 입증 - 파생 혈관 조직 고리 생성은 짧은 기간 내에 달성하고, 세포 및 혈관 조직 구조와 기능 세포 파생 매트릭스 (CDM)의 기여의 직접적이고 양적 평가에 대한 기회를 제공하실 수 있습니다.

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Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.7K 조회수.  Worcester Polytechnic Institute. 이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

연구

생체공학

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

에 내장 혈관 신생에 의하여 조직 공학<em&gt; 생체</em&gt; 조직 공학 상공 회의소

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...