이 작품은 영국의 재생 의학 플랫폼에서 상 (MRC MR / L022974 / 1, MR / K026666 / 1) 중국 장학금으로 지원되었다.

참고 :이 프로토콜에 사용 된 모든 시약 공급 업체 정보는 표 1에 나열되어있다. 세포가 그들과 직접 접촉을 할 때 모든 미디어 / 판 멸균 적어도 실온에서해야한다. 1.과 Passaging 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs) 라미닌 (521) 상에 참고 : 아래에서 설명하는 세포 계대 절차는 하나의 셀을 기반으로 hPSCs에서 간세포와 같은 세포의 균일 한 인구의 유도에 이상적이다. 콜로니 도금에도 적용 이전 24 설명되었다. <ol><li> 필요에 따라 라미닌 - 코팅 된 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 4 ° C에서 재조합 라미닌 521 (LN-521)의 100 μg의 / mL의 주식을 녹여. </li><li> 얼음처럼 차가운 1X DPBS에서 해동 LN-521을 희석 (칼슘과 / 마그네슘 2+) 5 μg의 / mL의 용액을 확인합니다. </li><li> 5 μg의 1 ml의 추가 / mL의 LN-521 6 웰 플레이트의 용액을 코팅 한 잘바위는 잘에 균등하게 확산합니다. </li><li> 긴급 사용 또는 밤새 4 ° C 냉장고에 4 시간 - 2 37 ° C / 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 필요에 따라 4 ° C 냉장고에있는 라미닌 - 코팅 된 플레이트를 저장합니다. 평평한 표면에 접시를 유지하고 증발과 오염을 방지하도록 밀봉. 참고 : 코팅 우물이 건조하게하지 마십시오; 필요한 경우 (칼슘 / 마그네슘 2+)와 추가 1X DPBS로 그들을 위로. 이주 내에서 판을 사용합니다. </li></ol></li><li> 1 시간 - 예비 코팅 된 플레이트의 필요한 수가 0.5 37 ℃에서 플레이트를 사용하기 전에 실온에 도달하거나 배양 허용. </li><li> 조심스럽게 코팅 된 표면에 손상을주지 않고 코팅 LN-521 솔루션을 대기음. 참고 : 그것에 세포를 파종하기 전에 코팅 표면이 손상되지 중요합니다. </li><li> 즉시 10 μM의 Rho 관련 키나제 (ROCK) 억제제 Y2 보충 미리 예열-mTeSR1 매체의 1 mL를 넣어7632 6 웰 플레이트 잘 하나. 세포를 수신 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 떠난다. 참고 : 라미닌 코팅 우물이 건조 할 수 있도록하지 마십시오. </li><li> 약 75 % ~ 85 %의 포화 상태로 잘 유지 hPSCs에서 매체를 기음. 상온 1X DPBS 1 ㎖ (없음 칼슘 / 마그네슘 2+) 한 번 6 웰 플레이트의 한 우물에서 세포를 씻으십시오. </li><li> 셀에 1 배 Accutase 0.5 mL를 넣고 6, 37 ° C에서 부화 - 세포를 해리 8 분. 참고 : 소화가 충분히인지 여부를 확인 부드럽게 판을 누르고 세포가 쉽게 분리 할 수 ​​있는지 여부를 확인합니다. 그렇다면, 그것은 효소 반응을 정지하는 시간이고; 2 분 -하지 않을 경우, 별도의 1의 소화를 확장합니다. </li><li> 세포를 10 μM Y27632 보충 mTeSR1 신선한 배지 2ml를 첨가하여 분해를 종료한다. 피펫 및 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 P1000 팁 여러 번 사용하여 다운. </li><li> 혈구를 사용하여 생존 세포 수를 계산.얼룩에 트리 판 블루를 사용하여 제외 죽은 세포 (14) </li><li> 필요한 세포의 수를 계산한다. 일상 hPSC의 계대를 들어, 6 웰 플레이트의 웰 당 4 × 10 5 5 10 × 5 세포를 시드 (즉, 4.21 × 10 4cm 2 당 5.26 × 10 4). 간세포 분화 hPSCs를 계대를 들어, 6 웰 플레이트의 웰 당 6.5 × 10 5-7.5 × 105 (즉, cm 2 당 7.89 × 10 4-6.84 × 10 4) 세포를 시드. 주 : 각 세포주에 대한 시딩 밀도는 간 차별화 여기 주어진 경험적 밀도에 따라 약간의 최적화를해야 할 수도 있습니다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 115 XG에 멸균 15 ㎖의 50 mL의 원심 분리 튜브에서 원심 분리에 필요한 세포 현탁액을 전송. </li><li> 천천히 뜨는을 대기음 후 10 μM의 Rho 관련 키나제 (ROCK) inhibito 보충 신선한, 따뜻한 mTeSR1 매체에있는 세포 펠렛을 resuspendR Y27632 원하는 세포 밀도 있도록 적절한 매체를 사용. 주 : ROCK 억제제의 사용은 고도의 세포 부착 및 생존율을 향상시키기 위하여 권장된다. </li><li> 제조 된 플레이트에 세포를 시드 및 균등 셀을 분배하도록 좌우 전후 측면을 요동. 참고 : 세포 플레이트 일상적인 세포 배양 또는 간세포 분화 실험에 대한 여부를 우물에 균일하게 분포되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. </li><li> 세포 배양기에서 접시를 놓고 그들을 연결하고 복구 할 수 있도록 24 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 세포를 유지한다. </li><li> 세포 다음날 검사 및 세포 - 세포 접촉이 설정되어있는 경우 ROCK 저해제를 철회. 루틴 mTeSR1 배양 배지에서 세포를 유지 또는 필요에 따라 분화 배지로 전환. 참고 : 세포가 언급 한 밀도로 접종 한 경우, 포화 상태는 일상적인 유지 보수 또는 간세포 differentiatio에 적합해야한다엔. </li></ol> 2. 재조합 라미닌에 간세포와 같은 세포에 hPSCs 차별화 <ol><li> 차별화 매체를 준비합니다. <ol><li> 인간 티빈 원액을 인간에게 티빈 멸균 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA) / DPBS에 100 μg의 / ㎖의 스톡 용액을 만드는 분말을 녹인다. 작은 분취 량을 확인하고 -20 ° C에 저장합니다. 1 사용 : 1,000. </li><li> 마우스의 Wnt 3A 원액을 확인 : 멸균 0.2 % BSA / DPBS에서 10 μg의 / mL의 원액을 만들기 위해 마우스의 Wnt의 3A 분말을 용해. 작은 분취 량을 확인하고 -20 ° C에 저장합니다. 1 사용 : 200. </li><li> 인간 간세포 성장 인자 (HGF) 스톡 용액을 제조 : 멸균 된 0.2 % BSA / DPBS에서 10 μg의 / ㎖의 원액을 만들어 인간 HGF 분말을 녹인다. 작은 분취 량을 확인하고 -20 ° C에 저장합니다. 1 사용 : 1,000. </li><li> 온코 스타틴 M (OSM) 원액을 확인 : 멸균 0.2 % BSA / DPBS에서 20 μg의 / mL의 원액을 만들기 위해 온코 스타틴 M (OSM) 분말을 용해. 작은 분취 량과의 확인-20 ° C에서 그들을 찢었다. 1 사용 : 1,000. </li><li> 내배엽 프라이밍 스톡 배지 500 mL로 : 2 % B27 보충제 (50X, 마이너스 비타민 A)와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 IU / ㎖ 및 100 μg의 각각 / ㎖에서, 최종 농도); 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 (1640 RPMI) 기초 배지를 사용하여 500 ㎖까지 가기. 참고 : 4 ° C에서 주식을 저장하고 2 주 이내에 사용한다. 주식에서 나누어지는 매체와 각 매체 변경시 (100 NG / mL의 50 NG / mL로, 각각에 최종 농도) 신선한 티빈 A와의 Wnt의 3A를 추가합니다. </li><li> 80 % 녹아웃 DMEM (KO-DMEM), 20 % 넉 아웃 혈청 교환 (KSR) 0.5 % 루타, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 0.1 mM의 베타 머 캅토 에탄올 : KSR / DMSO 분화 배지 500 mL로 1 % DMSO, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 IU / ㎖ 및 100 μg의 / ㎖, 각각의 최종 농도). 진공 상태에서 필터. 4 ° C에서 보관하고 2 주 이내에 사용한다. </li><li> 1 % 미군 병사 : HepatoZYME 성숙 매체의 500 mL로utaMAX 10 μM의 하이드로 코르티손 21- 헤 미숙시 네이트 나트륨 염 (HCC)와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 IU / ㎖ 및 100 μg의 각각 / ㎖에서, 최종 농도); HepatoZYME 기초 배지를 사용하여 500 ㎖까지 가기. 참고 : 4 ° C에서 주식을 저장하고 2 주 이내에 사용한다. 나누어지는의 주식에서 매체 및 각 매체의 변화 (10 NG / mL의 20 NG / mL로, 각각에 최종 농도) 신선한 HGF 및 OSM을 추가합니다. </li></ol></li><li> LN-521 / LN-111은 기판으로서 사용되는 경우 제 1 절에 설명 LN-521에 간세포 분화 시드 hPSCs, 코트 LN-521, LN-111와 플레이트 (1 : 3 비율)에서 5 μg의 / ㎖의 최종 농도 라미닌; 나머지 처리는 순수 LN-521 코팅 된 플레이트와 동일해야한다. 참고 : LN-521 / LN-111 hPSCs의 일상 문화에 적합하지 않다; 만 분화 실험을 위해 사용된다. </li><li> 파종 후 세포 포화 상태를 24 시간을 확인합니다. 세포 생장이 약 40 %에 도달하면 세포 분화를 시작. 아르 자형폐 mTeSR1 매체를 가져 가십시오 100 NG / mL의 티빈 A와 50 NG / ㎖의 Wnt의 3A와 보충 신선한 내배엽 흡입 매체를 추가합니다. 이 분화 일 1 호출합니다. 참고 : 높은 세포를 파종 후 하루 분화를 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 인간 배아 줄기 세포에 대한 삼일 (hESCs는)에 대한 내배엽 흡입 매체마다 24 시간을 변경합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에 관해서는, 최종 내배엽과 같은 세포에 주요 2 일 이상 세포를이 단계를 확장하지만, 100 NG 만 보충 내배엽 프라이밍 매체를 사용하여 / mL의 티빈이 두 가지 일 12 . 참고 : 성공적으로 내배엽 사양을 보장하기 위해, 하나는 FOXA2 및 SOX17으로 내배엽 마커의 발현을 검사 할 수 있습니다. 면역 형광 염색법에 따르면, 유래 세포의 80 % 이상이 우리의 실험실에서 두 마커에 대한 긍정적이다. </li><li> (hESCs는 용) 하루 4 KSR / DMSO 차별화 매체 / (hiPSCs에 대한) 하루 6로 전환합니다. 매체 d를 변경처음 3 일 동안 다음이 분화 단계의 다섯 번째 날에 aily. 참고 : 공급이 분화 단계의 네 번째 날에 필요하지 않습니다. 많은 죽은 세포가있는 경우 매체 변경 전에 한 번 세포를 씻어 비추 ​​KO-DMEM을 사용합니다. 이 단계에 대한 분화 성공 여부를 확인하거나하지 않는 하나는 AFP, CK19 및 HNF4A 같은 간 전구 세포 마커의 발현을 검사 할 수있다. 세포의 약 90 %는 우리의 경험을 바탕으로 이러한 마커에 대한 긍정적 인 것입니다. </li><li> KSR / DMSO 분화 단계 5 일 후, HepatoZYME 성숙 단계로 전환합니다. KSR / DMSO 매체를 제거한 후 일반 HepatoZYME 기초 배지로 한 번 세포를 씻으십시오. 매체 (10) NG / mL의 HGF 20 NG / ML의 OSM 보충 HepatoZYME 성숙을 추가합니다. </li><li> 세포가 표준 특성이나 더 사용할 준비가되는 시점에서 10 일 - 7 매체마다 48 시간을 변경합니다. 주 : 간세포 마커 발현 검사, 대사우레아 알부민 분비 검사, 글리코겐 저장 테스트 및 인도 사이 아닌 그린 (ICG) 흡수 검사 (예 시토크롬 P450 활성 등) 기능 테스트는 전형적인 특성화 방법이다. 참고 : 분화 프로토콜의 타임 라인은 그림 5에 표시됩니다. 우리가 실험실에서, 우리는 일상적으로 파생 된 HLCs &#39;간세포 특이 적 마커의 발현 수준, 알부민 분비와 사이토 크롬 P450 (CYP) 3A 및 1A2 활동을 확인합니다. </li></ol>

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Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin.</a> Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).</li><li>Lorenzini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+a+stereotypical+cellular+and+extracellular+adult+liver+progenitor+cell+niche+in+rodents+and+diseased+human+liver.">Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver.</a> Gut. 59 (5), 645-654 (2010).</li></ol>

박사 데이비드 C. 헤이 Stemnovate Limited의 공동 설립자이자 감독이다.

현재 좋은 제조 관행 가이드 라인이 필요 준수 인간 다 능성 줄기 세포 연구 및 병진 의학, 이종없는 시스템을 진행합니다. 임의의 분화 과정을 키는 세포 외 기질 (ECM)이다. 전자 재료뿐만 세포 부착을 지원뿐만 아니라, 세포의 결정 및 표현형 25, 26에 영향을 미치는 주요 신호 요소에 대한 액세스를 제공합니다. 라미닌 생체 다기능 세포 외 기질 단백질이다. 간에서, 라미닌 분비 부분 절제 후 27 일 간 재생에 중요한이며 간 전구 세포 유지 28에 요구한다. 간 유지 및 재생에 라미닌의 중요성은 우리 간세포 분화 시스템에서 시판되는 재조합 인간 라미닌을 테스트하기위한 기초이다. 페리 그마트 리겔에 비해 patocyte 차별화는 LN-521 및 LN-521 / LN-111 기판 상에 달성되었다. 파생 HLCs 명확 편광 및 접시 조직 및 젤라틴 단백질 혼합물 상대 비교할 때 그 세포 기능이 크게 향상되었다 하였다. 이러한 개선 밑바탕 fibroblast-, 결장 오염의 하향 조절했고 세포 연관된 라미닌의 유전자뿐만 아니라, 세포의 증식 및 이동과 연관된 유전자 발현 감소 10 줄기. 결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 성인 인간 간세포 본질적 가까운 간세포 - 유사 세포를 생성한다. 이 프로세스는 자동화, 재현 의무이며, 비용 효율적으로 응용 프로그램에 대한 확장 할 수 있습니다. 중요한 뱃치 변화가 현저이 필드 내 연구를위한 개선 된 시스템의 분화의 결과 마트 리겔을 사용 기술에 비해 감소되었다. </P&gt;

차 인체 조직 및 세포 유형 유도체 정기적 세포 기반 스크리닝 및 클리닉 모두 사용된다. 그러나, 이러한 세포에 대한 액세스 권한이 심각하게 부족으로 인해 장기 기증 및 사후 분리 한 세포 표현형의 손실로 제한됩니다. hPSCs 차 조직 유망한 대안을 나타내는 유전 정의 재생 인간 체세포의 생성을 촉진한다. hPSCs에서 유래 간세포와 같은 셀 (HLCs)는 이미이 분야에서 가능성을 보여 주었다. HLCs 약물 바이러스 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 세포 형태, 간세포 유전자 발현, 대사 기능, 감도 등 다양한 측면에서 차 인간 간세포를 닮아. 또한, 무한 증식모두 Researcher 섹션 및 GMP 수준의 hPSCs의자가 재생 능력은 그들의 응용 프로그램 9, 10 용이하게한다. 연구 십년 효과적인 간세포 분화 절차 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20의 숫자를 제작했다. 그러나, 이러한 시스템은 대부분 간세포 사양을 정의 구동 요소 및 / 또는 바이러스 전달을 사용한다. 규모 기술의 신뢰성을 향상하기 위해서는 강력한 간세포 분화를 개발하는 것이 중요이종없는 진정한 정의 시스템 및 GMP 호환. 라미닌 (림프절)는 세포 부착, 증식, 이동 및 분화에 영향을 미칠 수있는 중요한 세포 외 기질 단백질이다. 라미닌은 α 한 번 β 및 γ 한 체인으로 이루어지는 이종삼 당 단백질이다. 최근에, 재조합 인간 라미닌 생산 및 세포 생물학에서 사용되어왔다. LN-521, E-cadherin의 혼합물이 유도 클론 인간 배아 줄기 세포 (22)의 팽창을 허용하면서 LN-511 hPSCs (21)의 유지를 지원하기 위해 보여왔다. LN-111, 반면에, hPSCs (23)로부터 유래 hepatoblast 유사 세포의 유지 보수를 지원한다. 그러나, 우리의 보고서 전에 521 라미닌 및 111 hPSCs 10에서 성숙 특성을 가진 HLCs를 생성하는 데 사용되지 않았다. 여기에, LN-521에 hPSCs을 배양 우리 세부 절차그리고 그들을 차별화 중 하나 LN-521 또는 LN-521 및 LN-111 (LN-521 / LN-111)의 조화. 우리는 많은 형식 14 HLCs의 높은 재현성과 균일 한 단일 층을 생성하는 단일 셀 시드를 사용하여 분화 프로토콜을 최적화. 우리는 우리의 정의 분화 시스템 분야에서 순방향 중요한 단계를 나타내는 어플리케이션 활성 HLCs를 제조하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 나타낸다고 믿는다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 111</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN111-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined and scalable generation of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 생물 의학 연구에 큰 가치를 가지고있다. hPSCs는 스케일링과 인간의 몸에있는 모든 세포 유형으로 분화 될 수있다. 인간 간세포 - 유사 세포 (HLCs)에 hPSCs의 분화는 광범위하게 연구되었고, 효과적인 분화 프로토콜이 확립되었다. 세포 외 기질 및 성장 인자, 사이토 카인, 및 작은 분자를 포함한 생물학적 자극의 조합이 가능 차 인간 간세포를 닮아 HLCs를 생성하도록 만들었다. 그러나, 절차의 대부분은 여전히 ​​뱃치 변화로 초래하는, 정의 구성 요소를 채용한다. 이 기술의 응용에 큰 장벽으로 작용한다. 이 문제를 해결하기 위해 무 혈청 분화 과정과 함께 외 기질 재조합 인간 라미닌을 이용한 간세포 분화에 대해 정의 된 시스템을 개발 하였다. 고효율 간세포 사양 드으로 이루어졌다HLC 기능과 표현형 모두 개선 monstrated. 중요한 것은,이 시스템은 연구 및 GMP 수준의 hPSC 라인을 셀 기반 모델링 및 치료에 유망한 발전을 사용하여 확장이 용이하다.

hPSCs에서 간세포의 분화 한 인간 배아 줄기 세포주 H9, 한 사람의 유도 다 능성 줄기 세포주, 33D6는 간세포 분화에 사용 하였다. 도 4는 그 33D6 세포로부터 동안도 1 내지도 3의 결과는, H9 세포로부터이다. 라미닌에 접종 한 세포는 24 시간 후 세포 - 세포 접촉을 설립했다. 세포가 40 % 컨 플루 주위에 도달 한 후, 분화 과정은 (도 1a 및도 4a)를 개시 하였다. 라미닌에서 (LN-521 및 LN-521 모두 / LN-111),이 세포는 순차적 형태 학적 변화를 통해 갔다 및 편광 HLCs (그림 1과 그림 4A)로 상승했다. 간세포와 유사한 세포 특성 다Y 18 HLCs 수집 대표적인 간세포 마커 HNF4A와 ALB (도 2a)의 발현에 대해 평가 하였다. 하루 18 HLCs의 면역 염색은 세포의 약 90 % HNF4α (그림 2B)을 표현 것으로 나타났다. E-cadherin의와 F - 굴지 표현 (그림 2B)로 표시 이러한 세포는 다각형 모양을 라미닌에 편광 및 전시. 시토크롬 P450 (CYP) 활성을 또한 평가 하였다. CYP450s은 간세포의 중요한 신진 대사 기능을 수행. 이러한 마트 리겔, LN-521, 또는 LN-521 / LN-111과 같은 젤라틴 단백질 혼합물에서 파생 된 날 (18) HLCs는, CYP3A 활동에 대해 시험 하였다. HLCs는 마트 리겔보다 라미닌 기판 (그림 3)에 상당히 높은 CYP3A 활동을 보여 주었다. 상업 인간의 기본 간세포에 비해 중요한 것은, (HU1339)이 기판 상에 재 도금, HLCs 거의 10 배 높은 수준을CYP3A 활동 10. hiPSCs의 분화는 hESCs는 유사 하였다. 세포는 외관 (도 4a)에서 순차 변화를 나타냈다. 파생 키는 HLCs 간세포 전사 인자, HNF4α (도 4b)를 표현하고, CYP3A 활동 및 분비 알부민 (도 4c 및 D)를 보유. 특히, 33D6로부터 유도 HLCs는 HLCs (도 3) 유래 H9 세포에 비해 감소 CYP3A 표시되지만 여전히 인간 간세포 주 (10)에 필적 하였다. 그러나 이러한 HLCs의 알부민 분비 차 간세포 (10)보다 훨씬 낮았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" /> 그림 1 : 간 차별화 동안 연속 형태 학적 변화. &lt;하나의 세포가 40 % 컨 플루 주위에 파종 후 24 시간에 도달로 / strong&gt;을 (A) 미분화 hESCs는 시드. (B) 프라이밍 후에, 세포들은 일 9 (D)에 분명 다각형 형상을 보였다 성숙 단계 후, 편광 HLCs을위한 준비이었다 hepatoblast 같은 단계에 도달하면 일 4 (C)에 대한 전형적인 내배엽 형태를 나타내 하루 18 스케일 바 = 200 μm의에서 여기에 표시된 추가 특성. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" /> 그림 2 : HLCs의 특성. (A) 간세포 특이 마커의 유전자 발현, HNF4A (왼쪽)와 ALB (오른쪽). 발현 수준은 18 일을 유도 HLCs를 사용하여 분석 하였다LN-521 및 LN-521 / LN-111 모두 hESCs는에서, 그리고 가사 유전자 GAPDH에 정상화이었고, hESCs는를 기준으로 표시. 결과는 세 개의 복제 생물을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타낸다. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01; 짝 t-test를. 키 간 마커, HNF4α, 편광 마커, E-cadherin의와 F - 굴지의 (B) 단백질 식입니다. LN-521 및 LN-521 / LN-111은 위의 마커 염색 훽스트 33342. 음성 대조군으로 대조 한에 주 18 HLCs은 해당 면역 글로불린 G (IgG를) 수행 하였다. HNF4α 양성 세포의 비율과 SD가 표시됩니다. 이것은보기의 네 랜덤 필드에서 계산 하였다. 이미지는 20 배 배율로 촬영되었다. 스케일 바 = 100 μm의. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3 : HLCs의 대사 기능 특성. 마트 리겔 (MG), LN-521, 또는 LN-521 / LN-111에 배양 된 세포의 CYP3A의 사이토 크롬 P450 활성을 시험 하였다. 데이터는 세 개의 복제 생물을 나타내고, 오차 막대는 SD를 나타낸다. ** P &lt;0.01; 편도 ANOVA Tukey에의 사후 검사와 함께. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" /> 그림 4 : HLCs의 표준 특성. LN-521에 배양 hiPSCs는 HLCs로 분화되었다. 표준 특성 시험은 하루 17 HLCs에서 수행 하였다. (A) 간 동안 분화 세포의 연속 형태; 시간 포인트 도시 R<html> epresent 일 1, 4, 9 세포 및 HNF4α 발현의 17 (B) 면역 염색. 양성 세포의 비율과 SD는보기의 네 랜덤 필드를 기반으로 표시됩니다. 이미지는 20 배 배율로 촬영되었다. 스케일 바 = 100 μm의. 하루 17 HLCs에 (C) CYP3A 활동. 데이터는 여섯 생물학적 복제를 나타내고, 에러 바는 SD를 나타냅니다. 문화에 24 시간 이상 파생 HLCs의 (D) 알부민 분비. 데이터는 네 가지 생물학적 복제를 나타내고, 오차 막대는 SD를 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" /> 그림 5 : 차별화 프로토콜의 도식 타임 라인.t = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K 조회수.  University of Edinburgh.  여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 - 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다. 

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Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

연구

발생학

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...