이 메토유전학은 조립의 미세한 물질 및 세포를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포의 3D 간구권의 대량. 이 기술의 주요 진보는 괴사 센터의 형성과 표현형의 손실을 제한하는 3D 간 구체의 크기를 제어 할 수 있다는 것입니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 후 유왕이 될 것입니다.
멸균 된 증류수 100 밀리리터에 저용온 아가로즈 2 그램을 용해하여 아가로즈 금형을 제시 할 준비를하십시오. 조심스럽게 완전히 아가로즈를 녹여 간격 흔들림으로 전자 레인지에 혼합물을 가열합니다. 용융 된 아가로즈의 520 마이크로 리터를 256 개의 잘 포맷 금형에 추가하고 고화 할 수 있습니다.
그런 다음 각 아가로즈 마이크로 플레이트를 12웰 플레이트의 단일 웰로 옮기합니다. 칼슘과 마그네슘을 곁들인 DPBS 1.5밀리리터를 각 우물에 넣고 거품을 제거하기 위해 위아래로 파이펫을 넣습니다. 세포 현탁액을 준비하려면 인간 만능 줄기 세포 또는 HPSC의 미분화 배양으로부터 배지를 흡입하여 시작합니다.
실온 DPBS, 칼슘 또는 마그네슘의 5밀리리터를 첨가한 다음 버퍼를 제거하여 세포를 헹구는 다. 세포 해리 시약 5밀리리터를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 6~8분 동안 배양합니다. 현미경으로 세포 분리를 관찰하고 필요한 경우 1~ 2분 동안 인큐베이션을 연장합니다.
세포 해리 시약을 제거하고 신선한 MT의 5 밀리리터를 첨가하여 반응을 중지10 마이크로몰라 암반 억제제, Y27632로 보충 한 배지를 제공합니다. 피펫은 세포를 해리하기 위해 여러 번 위아래로 합니다. 필요한 총 세포 수를 계산하기 위해 혈종계 및 트라이판 블루 염색으로 실행 가능한 세포를 계산합니다.
원하는 수의 세포를 멸균 15 또는 50 밀리리터 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 5분 동안 200회 G로 전달하여 세포를 펠릿한다. 상체를 버리고 MT에서 세포를 다시 중단하여 밀리리터당 210만 개의 세포가 최종 농도인 10개의 미세몰라 암반 억제제로 1개의 배지를 제공합니다. 다음으로, 아가로즈 마이크로웰당 190마이크로리터의 제조된 세포 현탁액을 추가하고 2시간 동안 이산화탄소 5%에서 37°C의 아가로즈 마이크로 플레이트를 배양하여 세포를 저장한다.
인큐베이션 후, 각 우물에 암석 억제제와 신선하고 따뜻한 T-serve 1 개의 매체를 추가하십시오. 접시를 인큐베이터에 반환하고 24 시간 동안 거기에 둡니다. 다음 날, 형성의 구체를 검사합니다.
폴리 2개의 하이드록스테틸 메타크릴레이트 또는 폴리 헤마 코팅 웰을 100밀리리터에 95%에탄올로 용해하고 55도 핫 플레이트에서 밤새 용액을 교반하여 폴리-2 하이드록스테틸 메트하크레이트 또는 폴리 헤마 코팅 웰을 준비하십시오. 다음 날, 24웰 플레이트의 각 웰에 250 마이크로리터를 추가하고 60도 오븐에서 하룻밤 동안 접시를 건조시다. MT를 신중하게 제거하여 간세포 분화를 시작하였고, MT는 이전에 시드된 세포로부터 하나의 배지를 제공하고 신선한 엔도름 분화 배지의 1밀리리터로 대체한다.
인간 배아 줄기 세포를 위해, 3 일 동안 매 24 시간마다 매체를 새로 고칩니다. 자발적인 세포 분화를 피하기 위해 종자 후 24시간 간세포 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 결정적인 엔도름 유도 후 배지를 5일 동안 헤파토블라스트 분화 매체로 전환한다.
2일마다 배지를 교체하여 간세포 사양의 마지막 날에 마지막 변경 작업을 수행합니다. 간구체를 제조된 폴리 헤마 코팅 유정으로 옮기려면 간세포 성숙 배지로 세포를 세척한 다음 밀리리터 HGF당 10나노그램과 밀리리터 OSM당 20나노그램으로 보충된 배지의 1밀리리터를 추가합니다. 용액을 여러 번 위아래로 피펫하여 아가로즈 마이크로 플레이트에서 간구를 들어 올리고 잘 코팅된 폴리 헤마로 옮겨줍니다.
아가로즈 마이크로 플레이트를 보충된 간세포 성숙 배지의 1밀리리터로 세척하고 배지를 폴리 헤마코팅된 폴리헤마로 잘 옮겨줍니다. P-100 파이펫을 사용하여, 우물에 남아있는 중간 의 약 1 밀리리터가 있을 때까지 간구를 제거하지 않고 조심스럽게 과잉 매체를 흡인한다. 12일 동안 48시간마다 배지를 새로 고칩니다.
배아 줄기 세포와 함께 작동하는 경우, 성숙 배지를 제거하고 유지 보수 매체로 세포를 세척한 다음 보충 유지 보수 매체의 1 밀리리터를 추가하여 20 일째에 중간 세포 유지 보수 매체로 배지를 전환합니다. 그 후 48시간마다 배지를 새로 고칩니다. 즉각적인 변화는 이 스푸릭 구조의 심각한 스트레스와 왜곡을 피하기 위해 신중하게 수행해야 합니다.
중간 엽 마커에서 간구세포를 염색하는 것은 이 기술을 사용하여 형성된 간구가 중간엽 세포의 코어를 둘러싼 간세포와 같은 세포로 구성된다는 것을 즐춘다. 전형적으로 간세포에서 발현되는 그밖 단백질은 또한 구체의 외부 층에서 있습니다. 30일 간구 배양시 사이토크롬 P450 효소 또는 CYP의 기능적 분석은 3D 구체가 인간 1차 간세포에 비해 CYP 활성의 존경받는 수준을 나타낸다.
더욱이, 간구가 알부민 과 알파-태아단백질과 같은 간 단백질을 분비한다는 것을 입증할 수 있다. 이 프로토콜에 대해 기억해야 할 가장 중요한 것은 폴리 헤마 코팅 플레이트로 전송할 때 3D 간구를 포함하는 용액을 부드럽게 피펫하는 것입니다. 이렇게 하면 손상을 방지할 수 있습니다.
일단 마스터되면, 이 방법론은 de중단 모델링 및 약물 검열에 있는 다중 응용으로 시험관 내 1 년 동안 기능남아 있는 3D 간 구체의 생성을 허용합니다. 이 기술은 복잡한 아키텍처를 통해 더 많은 내피및 중간엽 조직을 개발하는 플랫폼으로 사용될 수 있습니다.
