이 작품은 과학의 국가 위원회에 의해 지원 되었다 고 기술 (CONACYT), 멕시코 연구의 설계에 참여 하지 않고 페이 CONACYT 2015 220333를 부여 합니다.

1. 미디어와 솔루션의 준비 <ol><li>문화 매체를 준비: RPMI-1640 10 %FBS, pH 7.4.</li>
	<li>준비 분석 결과 문화 매체: RPMI-1640 페 놀 레드 하지 않고 있지만 1 %FBS, pH 7.4.</li>
	<li>세포 세척 솔루션 준비: DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션 0.02 %EDTA, pH 7.4.</li>
	<li>세포 분리 솔루션 준비: 1 mm EDTA 0.125 %trypsin.
	<ol><li>녹여 100 mL의 트립 신-EDTA와 메 마른 500 mL 플라스 크에 0.25% 솔루션.</li>
		<li>믹스 셀의 100 mL와 함께 솔루션을 세척 하 고 15 mL 무 균 튜브에 15 mL aliquots 분배. -70-80 ° C까지 사용 하 게.</li>
		<li>0.22 μ m 멤브레인 통해 이러한 솔루션을 필터링 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C 까지의 따뜻한.</li>
	</ol></li> <li>Apoptosis 유도 재고 솔루션 TNFα 솔루션 3.3 µ g/mL에서 준비.
	<ol><li>500 µ L의 기본 컨테이너와 완전 한 해체까지 믹스에 필터 살 균 물과 TNFα의 분해 20 µ g.</li>
		<li>15 mL 무 균 튜브에 전송 하 고이 관에 DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션의 5.5 mL를 추가 합니다. 와 동 믹서를 사용 하 여 부드럽게 혼합.</li>
		<li>약 70 µ L 부분으로 수입니다. 0.5 mL microtubes-80에서 저장소에 각 약 수를 분배 ° c.</li>
	</ol></li> <li>준비 apoptosis 유도 솔루션: 40 ng/mL에서 TNFα 솔루션.
	<li>10 분에 대 한 25 ˚C에서 물 욕조에 그것을 잠복기 apoptosis 유도 재고 솔루션의 약 수를 해 동</li> <ol>
		<li>15 mL 무 균 튜브에 분석 결과 문화 매체의 4.939 mL을 3.3 µ g/mL TNFα 솔루션의 61 µ L을 추가 하 여 40 ng/mL을 apoptosis 유도 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>10 소용돌이 믹서로 혼합 s;이 솔루션은 사용 하기 전에 갓 준비 해야 합니다.</li>
		<li>회 eneutralization 분석 결과에서 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에 솔루션을 따뜻한.</li>
	</ol></li> <li>기판 솔루션 준비: caspase 3/7 저런 솔루션 7 , 8.
	<ol><li>녹여 caspase 버퍼 솔루션 (caspase 3/7 Glo 버퍼) 사용 하기 전에 12 h.</li>
		<li>Caspase 버퍼 솔루션 및 기판 (caspase 3/7 Glo 기판) 앉아 별도로 25 ± 5 ° C에서 혼합 전에 30 분 동안 하자.</li>
		<li>반전 하 여 기판 유리병 및 혼합 caspase 버퍼 솔루션의 10 mL 전송할.</li>
		<li>계속 25 ± 5 ° C, 사용까지 빛 보호. 
		참고:이 솔루션은 실 온에서 6 h에 대 한 안정적인.</li>
	</ol></li></ol> 2. 세포 Culturing 및 계산 <ol><li>셀 해빙 하 고 첫 번째 subculture.
	<ol><li>WEHI 164 셀 9 한 유리병-80 ˚C에 냉장고에서 제거 하 고 얼음 목욕에 그들을 전송.</li>
		<li>냉동된 세포는 완전히 해 동 때까지 미리 데워 진된 문화 매체의 1 mL와 함께 아래로 플라스틱.</li>
		<li>분배 15 mL 무 균 튜브에 미리 데워 진된 문화 매체의 9 mL.</li>
		<li>15 mL 무 균 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 반전 5 번 부드럽게 혼합.</li>
		<li>원심 125 x g 3 분 삭제에 세포 현 탁 액은 상쾌한 고 셀 펠 릿 세분화.</li>
		<li>튜브를 문화 매체의 5 mL을 추가합니다. 세포는 완전히 resuspended 때까지 혼합.</li>
		<li>셀 카운팅을 위한 500 µ L microtube 및 50 µ L 0.4 %trypan 파랑의 혼합 세포 현 탁 액의 50 µ L을 전송. 셀을 계산 하 고 10 6 셀/mL x 0.5를 조정 합니다. 아래 단계 2.2를 참조 하십시오.</li>
		<li>75 mL 세포 배양 플라스 크를 미리 데워 진된 문화 매체의 13 mL을 추가.</li>
		<li>단계 2.1.6 셀 문화 플라스 크에서 10 6 셀/mL x 0.5를 달성 하 고 37 ° C, 5% CO 2에서 밤새 품 어 충분 한 셀 서 스 펜 션 볼륨 분배.</li>
	</ol></li> <li>셀 세. 
	참고: 참조 참조 10.
	<ol><li>솔루션을 사용 하 여 단계의 2.1.6, 0.05 mL는 hemocytometer를 전송과 trypan 블루 제외를 사용 하 여 현미경으로 세포 밀도 결정.</li>
		<li>셀과 가능한 셀의 총 수를 계량.</li>
		<li>10 6 셀/mL x 0.5 셀 정지 조정. 
		방정식 1 
		V 문화 매체 (mL) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" /> V 문화 매체 (mL) = (5 mL-V 세포 현 탁 액) V 문화 매체 (mL) = 조정 된 양의 WEHI 164 현 탁 액 셀 NVC 가능한 WEHI 164 셀/mL의 수 = V 문화 매체 (mL) = 0.5 x 10 6 셀/mL를 달성 하기 위해 세포 현 탁 액에 추가 분석 결과 문화 매체 볼륨 0.5 x 10 6 = 대상 셀 밀도</li>
	</ol></li> <li>세포 분리 및 두 번째 및 세 번째 subculture. 
	참고:는 플라스 크에서 솔루션을 제거 하는 진공 시스템을 사용할 수 있습니다. 일회용 또는 유리 살 균 펫을 사용할 수 있습니다. 피펫으로 목화 덩어리 있으면 상단에, 그것은 사용 하기 전에 제거 해야 합니다.
	<ol><li>세포 배양 1 mL 균 피 펫 및 진공을 사용 하 여 T-플라스 크에서에서 문화 매체를 제거.</li>
		<li>셀 세척의 분배 5 mL 솔루션 T-플라스 크, 문화에 부드럽게, 혼합 하 고 솔루션을 삭제. 이 단계를 반복 하 여 두 번. 
		참고: 문화 매체의 완전 한 제거는 효율적인 전지 분리에 대 한 중요.</li>
		<li>T-플라스 크에 세포 분리 솔루션의 15 mL를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에서 3 분 서 보자.</li>
		<li>는 현미경 아래 플라스 크 내부 벽에 연결 된 셀의 부재를 확인합니다. 문화 20 mL의 멸 균 피 펫을 사용 하 여 T-플라스 크에서에서 셀을 제거 하 고 살 균 50 mL 튜브에 그들을 분배.</li>
		<li>원심 125 x g 3 분 삭제에 세포 현 탁 액은 상쾌한 고 문화 매체의 또 다른 5 mL와 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>셀을 계산 하 고 식 1에 따라 원하는 셀 농도 도달 충분 한 문화 매체를 추가.</li>
		<li>72 cm 2 T-플라스 크에이 정지를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2에서 밤새 품 어.</li>
		<li>Subculture 최소한 두 번 중립화에 그들을 사용 하기 전에 셀 시험. 다음 2 일에 대 한 단계 2.3.1-2.3.8 반복.</li>
	</ol></li> <li>세포 현 탁 액을 시험.
	적어도 3 개의 패스를 <ol><li>선택 WEHI 164 subculture 2.1 단계를 참조 하십시오.</li>
		<li>분리와 2.2와 2.3이이 프로토콜의 단계에 따라 셀.</li>
		<li>10 6 셀/mL x 0.5 식 1에 따라 세포 현 탁 액 희석.</li>
		<li>중화 분석 결과 대 한이 세포 현 탁 액을 사용합니다. 믹스와 동 믹서 사전 사용 하 여 모든 셀 정지.</li>
	</ol></li></ol> 3. 항 체 준비 및 희석 <ol><li>는 mAbs의 정량.
	그들의 대량 멸종의 계수 (1.39) 11를 사용 하 여 <ol><li>결정 참조 물질, 컨트롤 샘플 및 280에 UV 흡수를 통해 분석 샘플의 농도 nm. 
		참고: 원래 농도 약 제품 라벨에서 가져온 수 있습니다. 그러나,이 자외선 흡수 하 여 확인 해야 합니다.</li>
	</ol></li> <li>mAb 희석.
	DPBS 2 mL microtubes, 2 mg/mL까지 Mg 및 Ca 무료 솔루션 3 중에서 독립적으로 <ol><li>Dilute 모든 샘플. 빈으로 DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션을 사용 하 여 3 중에 UV 흡수이 농도 확인.</li>
		<li>5 재고 단백질 솔루션을 믹스와 동 믹서를 사용 하 여 s.</li>
		<li>분석 결과 문화 매체의 0.9 mL으로 각 2 mg/mL mAb 솔루션의 희석 100 µ L.</li>
		와 동 믹서에 의해 <li>믹스 5 s. 
		참고:이 솔루션 200 µ g/mL의 농도 있다. 각 3 중의 희석은 이루어져야 합니다.</li>
		<li>희석 10 & #181. L 각 200 µ g/mL mAb 솔루션의 분석 결과 문화 매체의 0.99 mL와 함께. 5에 대 한 믹스와 동 믹서를 사용 하 여 s. 이러한 솔루션 2 µ g/mL의 농도 있다. 각 3 중 직렬 희석 중화 분석 결과에서 그들을 사용 하기 전에 수행.</li>
		<li>는 MAb 희석 3 개의 독립적인 microplates에 안티 TNFα 확인합니다. 각 독립 3 중에서 중복을 확인 하 고 표 1에 표시 된 대로 한 microplate에 그들을 분배 한다. 물질 참조 < 테이블 fo:keep-together.within-페이지 "1" fo:keep =-와-next.within-페이지 "항상" fo:text =-정렬 = "센터" > <tbody><tr><td colspan="2"> 접시 1</td> <td colspan="2"> 접시 2</td>
					<td colspan="2"> 플레이트 3</td></tr>
				<tr><td>웰 스</td> <td>샘플</td> <td>웰 스</td> <td>샘플</td> <td>웰 스</td> <td>샘플</td></tr>
				<tr><td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> 참조 물질이</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> 컨트롤 샘플</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> 분석 샘플</td></tr>
				<tr><td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td></tr>
				<tr><td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> 분석 샘플</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> 참조 물질이</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> 컨트롤 샘플</td></tr>
				<tr><td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td></tr>
				<tr><td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> 컨트롤 샘플</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> 분석 샘플</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> 기준 물질</td></tr>
				<tr><td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td></tr></tbody>
		</table> 표 1: Microplate 샘플 배열. 완전 한 무력화 분석 결과 g 11을 좌표 B2 내 3 microplates에서 실행 되어야 합니다. 임의의 참조, 분석, 및 제어 샘플의 분배 수 연구원 분석 결과에 어떤 편견을 확인 하.</li>
		<li>각 참조의 수행 mAb 희석 샘플, 또는 제어, 표 2에서 같이. 
		참고:이 표에 설명 된 안티-TNFα mAb 농도 중립화 시험에서 최종 농도 되지 않습니다.
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>플레이트 열</td> <td>분석 결과 볼륨 문화 매체 (μ)</td> <td>볼륨의 참조 물질, 분석 샘플 또는 제어 샘플 (uL)</td> <td>농도 분석 결과 플레이트 (ng/mL)에서</td></tr> <tr><td>2</td> <td>0</td> <td>230</td> <td>2000</td></tr> <tr><td>3</td> <td>150</td> <td>선에서 2 150</td> <td>1000</td></tr>
				<tr><td>4</td> <td>75</td> <td>75 선 3에서에서</td> <td>500</td></tr> <tr><td>5</td> <td>100</td> <td>선 3에서에서 50</td> <td>333</td></tr> <tr><td>6</td> <td>75</td> <td>75 선 4에서에서</td> < td > 250</td></tr> <tr><td>7</td> <td>75</td> <td>75 선 5에서에서</td> <td>166</td></tr> <tr><td>8</td> <td>75</td> <td>선 6에서에서 75</td> <td>125</td></tr> <tr><td>9</td> <td>75</td> <td>75 이리저리 m 라인 7</td> <td>83</td></tr> <tr><td>10</td> <td>75</td> <td>75 선 9에서에서</td> <td>41</td></tr> <tr><td>11</td> <td>150</td> <td>선 10에서에서 75</td> <td>13</td></tr></tbody></table> T 수 2: 안티-TNFα mAb 희석. 안티 TNFα mAbs의 직렬 희석을이 테이블에서 보여 줍니다. 이 표에 설명 된 최종 농도 되지 않습니다 분석 결과, 농도 안티 TNFα mAbs (mAb 희석 + 배양 세포 현 탁 액) 3 배 희석 했다. 선은 굵게 나타냅니다 희석을 3, 5, 7, 9, 및 10; 라인에서 오는 굵은 비 줄 라인 3, 4 및 6에서 희석을 나타냅니다. 이러한 직렬 희석 중화 분석 결과 수행 하기 전에 그냥 할 수 있습니다. 주의 희석을 분배 하기 전에 세 번 아래로 pipetting으로 혼합 해야 합니다.</li>
		<li>사용까지 25 ± 5 ° C에서 번호판을 유지.</li>
	</ol></li></ol> 4. WEHI 164 세포 분석 결과 중화 <ol>vortexing 모든이 프로토콜의 모든 단계에서 분배 이전 정지 (0.5 x 10 6 셀/mL)를 셀에 의해 <li>믹스. 
	참고:이 섹션에서 따뜻하게 사용 하기 30 분 전에 대 한 37 ° C에 각 솔루션.</li>
	<li>열 2 11, 선 B g.를 이동 하는 microplates의 60 우물의 각 세포 현 탁 액의 전송 50 µ l</li>
	<li>MAb 참조, 샘플 및 컨트롤 전송 50 µ L 희석 microplates로. 그림 1에 표시 된 패턴을 따릅니다.</li>
	<li>각 잘 apoptosis 유도 솔루션의 추가 50 µ L.</li>
	<li>WEHI 164의 50 µ L의 셀룰러 컨트롤 사용 세포, 3 개의 우물에 적절. 분석 결과 문화 매체와 150 µ L의 최종 볼륨을 각 잘가지고.</li>
	<li>는 WEHI 164 셀의 50 µ L의 혼합물의 세포 독성 제어 플러스 apoptosis 유도 솔루션의 50 µ L을 사용합니다. 분석 결과 문화 매체와 150 µ L의 최종 볼륨을 각 잘가지고.</li>
	<li>TNFα에 대 한 제어, apoptosis 유도 솔루션의 50 µ L를 사용 하 고 분석 결과 문화 매체와 150 µ L에 가져다.</li>
	<li>빈, 혼자 분석 결과 문화 매체의 150 µ L 사용.</li>
	<li>접시 증발 효과 피하기 위해 문화 매체의 150 µ L을 채울 나머지 우물.</li>
	<li>반복 단계 4.1.1-4.1.9 2 개의 다른 microplates에 두 번. 
	참고: mAb 최종 농도에 미 판 있습니다: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014, 및 0.004 µ g/mL.</li>
	<li> 그림 1에 표시 된 대로 microplates에서 샘플 로드. 
	<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" /> 그림 1: 시험 접시에서 샘플의 처리. B1 G11 ~ 잘 좌표는 microplates에 있으며 샘플 희석 배치 됩니다 위치 설명. 누락 된 좌표는 웰 스 컨트롤 및 분석 결과 문화 매체 (A1-A12 및 H1 H12)으로 가득 합니다. 샘플 (는 microplates에서 앞으로 역 희석)의이 무작위 배포 매체 또는 다른 변수의 증발 때문에 결과에서 바이어스를 제거에 도움이 됩니다. 그것은 최고의 각 미 판 한 번에 한 애 널 리스트에 의해 수행 됩니다. R: 참조, s: 샘플, CS: 컨트롤 샘플, Dil: 희석. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a></li>
	<li>16 ± 37 ° C, 5% CO 2 세 접시를 품 어 2 헤</li>
	<li>Caspase 3/7 저런 형광 시 약 25 ± 5 ° C에서 사용 하기 전에 30 분 동안 서 보자.</li>
	<li>샘플 및 컨트롤을 포함 하 여 모든 웰 스에이 시 약의 추가 100 µ L.</li>
	<li>즉시 우물으로 분배 후 25 ± 5 ° C에서 3 분 microplate 소용돌이 믹서를 사용 하 여 번호판을 흔들.</li>
	<li>2.5 ± 0.5 h 25 ± 5 ° C, 빛 으로부터 보호에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>마이크 삽입roplates는 루미 노에 다음 섹션을 완료 하 고.</li>
</ol> 5. 분석 결과의 <ol><li>발광 모드 및 기능을 선택 발광 검출을 위한 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
	<li>선택 96 잘 클리어-하단 플레이트 및 열 1 및 12를 제외 하 고 그것의 80 내부 우물.</li>
	<li>1250 ms 및 10의 통합 시간 선택 읽기 전에 microplate 혼합에 대 한 s.</li>
	<li>우물 참조 물질, 분석 물질 및 컨트롤 샘플 배치 됩니다 및 그들의 대응 농도와 식별을 선택 합니다.</li>
	<li>는 루미 노와 microplates에 배치 샘플 읽기.</li>
	<li>결과의 분석에 대 한 네 번째 매개 변수 방정식을 사용합니다. 그림 2에서 같이 복용량 응답 곡선 그래프. 
	<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" /> 그림 2: 복용량 응답 곡선. 발광 (세포 생존 능력) 대 안티 TNFα mAb 농도 그려져 있습니다. 네 번째 매개 변수 방정식 mAbs의 안티 TNFα 보호를 설명 하는 모델으로 사용 되었다. EC50은 슬로프에 변화 그래프에서 궁 행 각 분석 결과에 50% 세포 죽음을 일으키는 원인이 되는 TNFα의 양을 중화 시킬 수 mAb의 농도 이다. 바 각 mAb 농도 대 한 발광의 표준 편차를 설명합니다. x 안티 TNFα Ab 농도 나타내고 y 나타내는 반면 ng/ml, 로그 기능으로 묘사 된다 임의의 발광 단위에서 발광 반응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
	참고: 네 번째 매개 변수 방정식에 C 효과적인 농도 50 (EC50) 이다. 이 값 effector 기능에 의하여 참조 물질, 분석 샘플, 및 제어 샘플을 비교 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>상대 potencies 계산, 기준 물질을 100%로 수정 하 고 샘플의 potencies 계산 하 고 적절 하 게 제어. 
	참고: 이러한 값 그림 3에서 묘사 된다. 
	<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" /> 그림 3: 사용 하는 EC50s 및 그들의 값을 계산 하는 수학 방정식. EC50 값, 또는 C 매개 변수를 표준 오류로 묘사 그들의 불확실성을가지고 있다. 상대적인 힘의 샘플 및 참조 결과 EC50s의 비교도 그려져 있습니다. α와 신뢰 구간 계산 = 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a></li>
</ol>

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li><li>Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WEHI+164+subclone+13+assay+for+TNF:+sensitivity,+specificity,+and+reliability.">WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability.</a> Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).</li><li>Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilized+formulations+of+recombinant+tumor+necrosis+factor.">Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor.</a> Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).</li><li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+immune+function:+molecular+mechanisms+to+interventions.">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li><li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes.">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li><li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark:+a+potential+therapeutic+use.">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li><li>M&#228;nnel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide.">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li><li>Lis, K., Kuzawi&#324;ska, O., Ba&#322;kowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge.">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

이 특성화 비싸고 시간이 많이 걸리는 임상 시험 실시 전에 선험적으로 개발 중인 분자의 생물 학적 행동 결정에 도움이 됩니다. 승인 된 약 제품의 일괄 처리를 일괄 처리 릴리스도 유용합니다. 이 분석 실험 분자는 그것의 행동의 메커니즘에 대 한 적절 한 생물학적 효과 여부를 확인 하는 데 유용은 언급 가치가 있다. 이 자습서에 바이오 분석 방법은 다른 안티-TNFα 분자의 비교에 매우 중...

생물 학적 힘 수량 (대량 표현)는 단백질 함량의 물리 화학적 측정 관련 생물 속성에 연결 된 분석 제품 특성에 따라 생물 학적 활동의 양적 척도 이다. 다른 분석 방법론을 함께 힘 테스트 제품 적합성, 안정성, 및 comparability 연구의 일부로 수행 됩니다. 이런이 의미에서 힘 측정 제품 배치에 맞는지 중요 한 품질 특성 (CQAs) 또는 승인 기준 및 시장 승인 후 임상 시험의 모든 단계를 설명 하는 데 사용 됩니다.
Apoptosis는 프로그램된 한 세포 죽음, 그 타협 세포 생존 능력 및 기능1,2요소 바이러스 또는 세포는 환경에 의해 스트레스 세포 감염 때 자연스럽 게 발생. 다른 가운데, apoptosis 억제, 또는 생물 학적 중화 면역 중재 염증 성 질환 등 만성 질환의 치료에 특히 mAbs의 주로 알려진된 치료 메커니즘 중 하나입니다. 안티 TNFα 분자는 p55 p75 세포 표면 수용 체3, 마지막으로 세포 apoptosis 이어질 신호 경로 방지와 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα)의 상호 작용을 차단 하 여 그들의 치료 속성을 발휘 한다.
TNFα 일부 만성 질환4에 염증을 일으킬 수 있다. TNFα 쓰레드가 extracellular 환경에 타고 난 면역 체계와 질병5의이 종류에 있는 주요 배우의 보초는 대 식 세포에 의해 은닉 된다. 일반적인 경로로 TNFα 규제 완화는 이러한 질병의 병 인 연결 됩니다. 제어 없이 및 지속적인 유도 및 세포 스트레스, TNFα 궁극적으로 류 마티스 관절염, Crohn의 질병, 그리고 다른 병 적인 프로필6로 이어지는 세포 죽음 및 조직 변성을 유도 합니다.
TNF와 그것의 수용 체 사이 상호 작용을 차단 하는 TNF 길 항 제는 점점 징후를 줄이고 이들이 질병의 진행을 방해 하는 효과적인 치료로 사용 되었습니다. 요즘, 안티 TNFα 약 제품 추가 참여 조직의 변성 방지이 cytokine의 조직 농도 제어를 널리 사용 됩니다. 이런이 의미에서 재현 하 고 강력한 생물의 생물 학적 효과 달성 하는 약물의 특정 능력을 설명 하기 위해 제공은 필수적입니다.
이 프로토콜, 중요 한 중화 분석 결과의 개발 단계 식별-생물 학적 힘의 성공적인 측정에 대 한 강조 표시 됩니다, 바이오 분석 메서드를 실행 하는 데 필요한 기술에 특히 강조와 함께. 이 바이오 분석 방법 마약 제품을 임상 시험된 기준 물질에 비해 다른 배치 또는 안티-TNFα 사이 유용한 comparability 정보를 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">WEHI 164</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">CRL-1751</td>
			<td style="width:463px;">Fibrosarcoma cells from Mus musculus</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">30-2001</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">11835-030</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">25200-056</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">14190-136</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Recombinant Human TNF-alpha Protein</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:127px;">210-TA-020</td>
			<td style="width:463px;">Store at -20 &#176;C to -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3089803</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3007103</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Caspase-Glo 3/7 Assay kit</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:127px;">G8093</td>
			<td style="width:463px;">Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at &#8211;20 &#186;C protected fromLight</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent</td>
			<td style="width:111px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:127px;">8993-01</td>
			<td style="width:463px;">--</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Sample mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Probiomed</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Reference and Control mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Abbvie</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">89429-536</td>
			<td style="width:463px;">SpectraMax M3 Multi-Mode</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate reader Software&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">--</td>
			<td style="width:463px;">SoftMax Pro 6.3 GxP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Revco&#160;</td>
			<td>30482</td>
			<td style="width:463px;">Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Laminar Flow Hood&#160;</td>
			<td style="width:111px;">The Baker Company&#160;&#160;</td>
			<td>200256</td>
			<td style="width:463px;">Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method

이 프로토콜 안티 TNFα mAb를 사용 하 여 마우스 fibroblast 세포 모델 (WEHI 164)에서 TNFα의 apoptotic 활동 중립화의 측정을 보여줍니다. 또한,이 프로토콜 융해 단백질 등 다른 안티 TNFα 분자를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기 고용 셀룰러 모델 TNFα 중재 된 apoptosis에 민감한 때 추가 스트레스 요소가 셀 문화 조건 (예: 혈 부족)에서 유도 된다. 이 절차 실행이 분석 분석 결과, 샘플 준비, 셀 희석, apoptosis 유도, 성공적인 결과 보장 하기 위해 중요 한 spectrophotometric 측정에 관련 된 주요 작업을 강조 표시 하는 방법을 예로 보여주. 이 프로토콜 apoptosis 유도 및 효율적인 신호 기록, 낮은 불확실성 값을 선도 하는 최고 성능 조건을 보여준다.

(컨트롤)와 복용량 응답 그래프 
그림 1 mAb 농도 대 발광 응답을 나타냅니다. 이 자형 기능 분석 결과 배양 세포 세포의 용 해 때문에 caspase 3 및 7 릴리스를 예로 보여주. 세포 죽음은 혈 청 기아 플러스 TNFα 유도 신호에 의해 향상 됩니다. 따라서, 안티-TNFα 분자 (mAb)는 TNF 세포 수용 체와의 상호 작용 (입체 방해)에 의해 억제 사이토카인 ...

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Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody mAb by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

determination-relative-potency-an-anti-tnf-monoclonal-antibody-mab

Research

JoVE Journal

Medicine

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

9.2K 조회수.  Probiomed. 프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

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Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

연구

의학

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운<em&gt; wnt5a</em&gt; Zebrafish의 신장의 낭종 원인

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

수술 용 나사를 이용한 마취, 수술 및 수확 방법<em&gt; In Vivo</em&gt; 돼지의 허리 척추 모델

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

쥐에서 혈액 샘플 컬렉션의 대체 방법으로 빵 꾸 하 정 맥

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening infections caused by P. vivax and ovale. However, PMQ has unwanted adverse effects that lead&#160;to acute hemolysis in patients with glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency. There is a need to develop simple and reliable methods for PMQ determination with the purpose of dosage monitoring. In early 2019, we have reported an UV-Vis and naked-eye based approach for PMQ colorimetric quantification. The detection was based on a Griess-like reaction between PMQ and anilines, which can generate colored azo products. The detection limit for direct measurement of PMQ in synthetic urine is in the nanomolar range. Moreover, this method has shown great potential for PMQ quantification from human serum samples at clinically relevant concentrations. In this protocol, we will describe the technical details regarding the syntheses and characterization of colored azo products, the reagent preparation, and the procedures for PMQ determination.

This protocol describes a novel colorimetric method for antimalarial primaquine (PMQ) detection in synthetic urines and human serums.

UV-Vis및 말라리아 방지 프리마퀸의 육안 측정을 위한 최적화된 Griess 반응

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

쥐의 심근 경색과 격리 된 작업 심장 시스템에 의한 심장 기능 평가를 유도하는 반 최소 침습 적 방법

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

Vessel-Sparing Microsurgical Longitudinal Intussusception Vasoepididymostomy to Treat Epididymal Obstructive Azoospermia

The epididymis is a common site of obstruction in obstructive azoospermia (OA). Vasoepididymostomy has become an important method for the treatment of epididymal OA since 2000. There are two challenges in classic microscopic vasoepididymostomy. First, anastomosis of the vas deferens and epididymis is performed with double-needle sutures. However, there is a lack of good-quality and cost-effective double-needle sutures in China, which leads to increased difficulty and poor success rates of anastomosis. Second, the separation of the vas deferens does not retain vasculature, although the vas deferens vasculature plays an important role in the blood supply to the vas deferens, epididymis, and testis. This affects the blood supply to the anastomotic area and epididymis.
Therefore, this team has made innovative improvements to address these problems. Good-quality, cost-effective, single-needle sutures, which are easy to purchase in China and other countries, were used in microsurgical longitudinal intussusception vasoepididymostomy. This can optimize the operation procedure and shorten the operation time while ensuring the success rate of the anastomosis. The surgical method of preserving the vas deferens vessels was innovatively proposed because the etiology of epididymal OA is mostly inflammatory in China. The protection of the blood supply to the vas deferens and epididymis is maximized using microsurgical forceps to separate and protect the vasculature. Patency reached 81.7% in the postoperative follow-up, indicating a better surgical treatment effect.

The present protocol describes a vessel-sparing, longitudinal intussusception vasoepididymostomy using readily available single-needle sutures in China, a safe and effective procedure, which may improve patients' patency and natural pregnancy rates.

혈관 절약 미세 외과 종방향 Intussusception 부고환 폐쇄성 Azoospermia 치료를위한 혈관 부고환 절제술

The epididymis is a common site of obstruction in obstructive azoospermia (OA). Vasoepididymostomy has become an important method for the treatment of ...

An In Vitro Dissolution Determination of Multi-Index Components in Tibetan Medicine Rhodiola Granules

The composition of the Tibetan medicine Rhodiola granules (RG) is complex, and the overall quality of RG is difficult to determine. Therefore, establishing a method to determine the multi-component in vitro dissolution of RG is of great significance for quality control. This study uses the second paddle method of the fourth general rule 0931 from the Chinese Pharmacopoeia (2020 edition), compliant with apparatus 2 of the United States Pharmacopeia (USP). The dissolution apparatus was set to a rotation speed of 100 rpm with ultrapure water as the dissolution medium. A sample volume of 1 mL was collected at each timepoint. Furthermore, the cumulative dissolution of gallic acid, salidroside, and ethyl gallic acid in RG at different time points was determined by high-performance liquid chromatography (HPLC). Finally, the dissolution curves were drawn, and the curves were fitted to the GompertzMod, the Gompertz, the Logistic, and the Weibull equations. The results showed that the cumulative dissolution of gallic acid in RG was over 80% at 1 min, the cumulative dissolution of salidroside and ethyl gallic acid was over 65% at 5 min, and the cumulative dissolution of each index component decreased after 30 min. The curve fitting demonstrated that the GompertzMod equation was the best-fitting model for each index component of RG. In conclusion, the dissolution test method described in this protocol is simple, accurate, and reliable. It can characterize the dissolution behavior of the index components in RG in vitro, which provides a methodological reference for quality control of RG and quality evaluation of other ethnic compounds.

An In Vitro Dissolution Determination of Multi-Index Components in Tibetan Medicine Rhodiola Granules

Here, we test the dissolution of Rhodiola granules (RG) in vitro, draw dissolution curves of salidroside, gallic acid, and ethyl gallate in ultrapure water, and fit the curves to different mathematical models. This protocol provides information and guidance for in vivo bioequivalence and in vivo-in vitro correlation studies of RG.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

요약

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