DD와 안산 지원은 ANR에서 인정 (프로젝트 IFNX, 아니. CE17001002)와 단일 클론 항 체를 제공 하기 위한 ImmunoQure AG. 우리 감사 브리 짓 베이더 Meunier, 나탈리 아 Bellon, 크리스틴 Bodemer, 알렉스 Belot, 이자벨 Melki, 그리고 피에르 Quartier 임상 샘플 제공. 유럽 연구 위원회를 인정 하는 안산 (GA 309449: 안산 교제), 베어링 참고 ANR-10-IAHU-01 "미래 위한 투자" 프로그램 국가 연구 기관 (프랑스)에 의해 관리 되는 국가 보조금.

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저자는 공개 없다.

여기, 우리 개발 및 인간의 샘플 ( 표 1에 요약 된 단계)에서 IFN-α 단백질의 직접 정량화에 대 한 높은 재현성, 磁 단일 분자 배열 디지털 ELISA의 유효성 검사를 설명 합니다. 분석 결과의 개발에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 쌍16, 속도 론 및 성공적인 분석 결과 핵심 되는 epitope 바인딩 특성의 선택입니다. 대상으로 동일한 epitope 또는 그 입체 장애를 일으킬 짝된 단일 클론 항 체의 사용을 피하기 위해 중요 하다. Polyclonal 항 체는 이러한 한계를 극복 하기 위해 탐지 항 체로 사용 될 수 있습니다. 어떤 주어진된 단계에서 원하는 감도 달성 되지 않은, 경우 추가 최적화 가능성 고려 되어야 한다. 이 대체 항 체 쌍, 매개 단백질 종류에에서 변화를 사용 하 여 포함 될 수 있습니다 (예: BSA < 카 제인), pH (6.0-8.5), 이온 강도, 버퍼링 용량 (예: NaCl 및 인산 염 농도), 캐리어 구슬, 또는 계면의 존재. 다양 한 매개 변수 절약 최적화 된 단일 분자 배열 분석 결과 개발할 때. 그러나, 전반적으로, 높은 신호: 배경 비율 및 최소한의 Lod를 주는 조건이 선호 하는 것 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3참조).
특이성에 관한 IFN-α 분석 결과 다른 IFNs에 대 한 교차 반응 없음 테스트 (β, γ, λ1, λ2, ω) 보였다 (그림 4a)와 모든 13 IFN-α 하위 (그림 4b) 탐지 가능 했다. 그러나, 분석 결과 IFN-α2 하위 형식, (그림 4b 및 보충 표 4)에 대 한 낮은 선호도 보였다. 흥미롭게도, IFN-α2 (a, b의 c)의 다른 클래스에 대 한 서로 다른 감도 또한 관찰 되었다, 고유 제조 절차 또는 다른 아미노산 시퀀스를 수 있는 IFN-α2 하위 했다 다른 상업적으로 공급 업체입니다. 이 유일한 예외와 함께 모든 IFN-α 종 매우 비슷한 응답 했다. 분석 결과의 특이성은 안티-IFN-α (그림 6 및 보충 표 6) 신호를 폐지 한 복제와 샘플의 전처리에 의해 입증 되었습니다.
이 기술의 주요 장점 중 하나입니다 관심의 모든 분석 대상된16수 잠재적으로. 또한, 다른 생물 표본 테스트할 수 있습니다, 혈 청, 플라스마, 중추 신 경계, 세포 lysates, 문화 supernatants31 심지어 숨을32등. 일반적으로, 플라즈마의 1:3 희석 잠재적인 단일 분자 배열 분석기의 막힘을 피하기 위해 수행 됩니다. 그러나, 관심의 분석 관련 생물학 견본에서 매우 낮은 농도에서 존재 될 수 있고 샘플의 높은 농도 (분석 감도)에 따라 필요한33수 있습니다. 좋은 감도34유지 하면서 멀티플렉싱 가능성이 있지만, 그것은 더 많은 도전 과정 6 단백질 같은 실험에서 아직 수35개발 보다 큰 측정 분석 실험.
감지 하 여 cytokines와 같은 낮은 농도에 다른 생물학 관련 단백질 계량 능력 응용 프로그램33,36의 완전히 새로운 범위를 연다. 그것은 잘 알려진 수많은 단백질 인 지금까지 최고의 ELISAs37의 검출 한계 이하로 매우 낮은 농도 에서도 그들의 효과 발휘. 다른 immunoassay 기술을 기존의 ELISA19이점을 제공, 제시 여기 단일 분자 배열 디지털 ELISA는 낮은 농도에서 cytokines의 磁 탐지에 대 한 재현 가능 하 고 강력한 플랫폼 인간의 샘플입니다. 따라서,이 기술은 바이오 마커 발견과 다양 한 질병의 향상 된 환자 관리에 대 한 엄청난 잠재력을 제공합니다.

유형 I IFNs는 항 바이러스 면역 응답을 꾸미고 있는 중앙 역할 cytokines의 가족. 그들은 처음 발견 되었다이 삭과 Lindenmann 60 여 년 전1,2 , 그것은 지금 polypeptides의이 다른 유형의 가족 14 다른 서브 클래스 (13 IFN-α 하위 및 1 IFN-β) 구성 알려져. 유형과 유형 I IFNs는 바이러스 성 감염의 허가에 필수적인 하지만 또한 다양 한 인간의 질병 상태, 자가 면역 질환 반성 루 푸 스 (SLE), 청소년 dermatomyositis (JDM)를 포함 하 여의 병 리에 연루 되어 내가 interferonopathies 구성 유형에서 IFN 유도 신호 나 병 리3,,45,,67에 결과.
공부 유형 I IFN 단백질 수준의 생물 학적 샘플에 도전 하고있다 그것의 초기 식별 이후는 "방해 물질"1,2. 현재, 샌드위치 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) IFN-α 단백질의 검출에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 이다. 불구 하 고 특정, 간단 하 고 빠른, 종류와 같은 중요 한 한계를 제시 나 IFN ELISAs 감도 제한. 또한, 모든 IFN-α의 측정 자신의 감지 능력 및 감도 여러 분석 실험의 사용을 해야합니다. 상업적인 ELISAs IFN-α의 다른 하위를 검색 하는 동안, 그들의 감도 제한 됩니다 (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL, 및 12.5 pg/mL, 각각)는 종종 생물학 견본에서 IFN-α 단백질을 검출 하기 충분 하지 않습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 분석 척도 개발 되었습니다 몇 가지 생물 학적 프록시 유형 I IFN 유도 유전자 발현 또는 기능 활동8,,910,11, 를 측정 하 여 12 , 13 , 14. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 분석 IFN-α 단백질의 직접 측정을 제공 하지 않습니다.
본이 연구에서는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 기술은 단일 IFN-α 단백질 분자의 검출에 대 한 분석 결과 개발에 사용 되었다. 그러나 디지털 ELISA 기존의 ELISA로 동일한 기본적인 화학, 반응 50000 개별 46 femtoliter 크기의 웰 스15,16으로 구성 된 배열에서 일어난다. 단일 단백질 분자는 항 체-코팅 된 상자성 구슬에 의해 점령 하 고는 biotinylated 탐지 항 체, 효소 공액, streptavidin-β-galactosidase (SBG)의 바인딩 다음으로 표시. 그 후, 구슬 fluorogenic 효소 기질, resorufin-β-D-galactopyranoside (까지), 단일 분자 배열에 함께 일시 중단 됩니다. 볼륨을 줄여 반응 2 십억 번17, 형광 신호의 높은 현지 농도 달성 하 고 단일 분자 수로 각 분자는 이제 안정적으로 될 수 있는 신호를 생성 가능 하 고, 될 측정18. 본질적으로 단일 분자 배열은 단일 immunocomplexes를 계산 하 고 구슬 (AEB) 당 효소의 평균 수를 결정 할 수 있다. 단백질 농도 immunocomplexed 구슬과 구슬에의 총 수 사이의 비율 사이 직접적인 상관으로 단백질 분자의 정량화/디지털화 허용 신호를 감지 하는 microwells를 계산 femtoliter 크기의 약 실입니다.
양 외. 9 다른 기술 및 4 개의 cytokine immunoassays19다른 플랫폼 걸쳐 분석 결과 정밀도, 감도, 그리고 데이터 상관 관계를 비교 하는 것을 목적으로 사용 하는 광범위 한 크로스-플랫폼 평가 연구를 수행 합니다. 연구의 주요 조사 결과 중 하나는 단일 분자 배열 및 단일 분자 immunoassay 계산 하위-pg/mL 농도 범위 내 인간의 혈 청에서 cytokines의 검출에 대 한 높은 감도 제시 했다. 단일 분자 배열 디지털 ELISA cytokine 분석 실험 Crohn의 질병20, IFN-α interferonopathy 및 자동-면역 환자 7, 일리노이-6와 TNF-α의 역할을 연구 하기 사용 되 고 다른 post-translationally C-X-C의 형태 수정 만성 간염 및 건강 한 기증자 sitagliptin21,22수신 모티브 chemokine 10 (CXCL10) 당뇨병 성 망막 증23; 환자에 rhodopsin의 측정을 포함 하는 다른 응용 프로그램 neurofilament의 혈 청/플라즈마 측정을 통해 뇌 병 리의 연구에 빛 다 발성 경화 증 및 알 츠 하이 머 병의 맥락에서24 및 아 밀 로이드 β 1-42 펩 티 드25, 각각. HIV 바이러스 성 저수지26의 특성 등 향상 된 병원 체 감지 하 고 또한 DNA27 마이크로 RNAs28의 검출에 대 한 단일 분자 배열 분석 실험도 사용할 수 있습니다. 특정 항 체 쌍을 사용할 수 경우 관심의 어떤 분석에 대 한 분석 결과 개발 될 수 있는 단일 분자 배열 기술의 주요 이점은이 다용도입니다. 또한, 사제 시험 장비는 상업적으로 사용할 수 있는 프로토콜 아래의 수정 된 형태로 상세한 새로운 분석의 개발을 허용.
여기, 단 하나 분자 배열 분석 결과 대 한 개발 및 유효성 검사 단계에 대 한 자세한 설명은 IFN-α 단백질 검출에 대 한 향상 된 감도에 그 결과 제공 됩니다. 단일 분자 배열 분석 실험에 대 한 항 체는 매우 구체적인, (와 함께 종 특이성 경우 관련) 관련 단백질 교차 반응성을 피하 해야 합니다. 이상적으로, KD 10-9 M 보다 작은 항 체는 선택 되어야 한다; 높은 선호도 높은 신호 생산 강한 바인딩을 확인합니다. 항 체-항 원 바인딩의 활동 또한 중요 하 고, 빠른 K에에 있으며 느린 K에서 항 원-항 체 복잡 한 어셈블리를 부탁 합니다. 항 체 쌍을 1-100 pg/ml, 탐지 (LOD)의 고전 ELISA에 좋은 성능을 시작 매우 민감한 단일 분자 배열 분석 결과 얻기의 가능성이 높아집니다. 장 및 동료 분석 감도18를 예측 하는 방정식의 세트를 제안 하 고 모든 단일 단계에서 발생 하는 바이오 상호 작용의 상세한 운동 연구 수행. 그들은 그 단일 분자 배열 디지털 ELISA 항 체 친 화력의 광범위 한 범위 내에서 효과적인 것 처럼 보였다 (KD ~ 10−11 -10−9 M), 뿐만 아니라 그 신호 발생은 더 많은 같은 항 체의에 속도에 의존.
높은 선호도 활용 하려면 우리 면역 polyendocrinopathy 증후군을 가진 환자에서 항 체 분리의 이용을 했다 항 체 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED)29를 입력 합니다. 이유로 아직 이해 되지 않는다, 아이 불충분 한 개인의 대다수는 모든 IFN-α 하위29에 대 한 높은 갈망 항 체의 코어 세트를 개발 하 고 우리는 상호 보완적인 바인딩 선호도의 두 안티-IFN-α 항 체 클론을 선택 다른 IFN-α 하위 유형에 대 한, IC50 값에 의해 추산 되. 단일 분자 배열 기술로 이러한 독특한 높은 친 화력 항 체의 조합 attomolar (fg/mL) 농도에서 IFN-α의 직접 정량화를 사용할 수 있습니다. 이러한 磁 IFN-α 단백질 검출 자연, 규칙 및 다른 질병에서 IFN 유도 응답의 생물 학적 영향의 더 나은 이해에 기여할 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

이 프로토콜의 주요 목표는 개발 및 유효성 검사는 인터페론 (IFN)의 설명-α 단일 분자 배열 디지털 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) 분석 결과. 이 시스템 수 있습니다 인간의 IFN-α 단백질의 정량화를 전례 없이 높은 감도, 그리고 아무 분 IFN의 다른 종족에 대 한.
프로토콜의 첫 번째 주요 단계 다음에 캡처 항 체의 활용 상자성 구슬과 biotinylation 탐지 항 체의 항 체 쌍의 선택입니다. 이 단계에 따라 최적의 감도 얻을 때까지 분석 결과 구성, 검출기 항 체 농도, 버퍼 구성 등의 다른 매개 변수를 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 특이성, 재현성 메서드의 결과에 신뢰를 보장 하기 위해 평가 됩니다. 여기, 우리는 0.69 fg/mL 높은 선호도 자가 면역 polyendocrinopathy를 일으키는 면역 레 귤 레이 터 (아이) 단백질 biallelic 돌연변이 가진 환자에서 격리를 사용 하 여의 검출도 IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과 개발 증후군 종류 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED). 중요 한 것은, 이러한 항 체는 모든 13 IFN-α의 감지를 사용할 수 있습니다.
이 새로운 방법론 수 있습니다 검출 및 정량화 IFN-α 단백질의 attomolar 농도에서 인간의 생물 학적 샘플에서 처음으로. 이러한 도구는 매우 인간의 건강 및 질병 상태,이 사이토카인의 수준을 모니터링 하는 데 유용 있을 것입니다 대부분 특히 감염, 자가 면역, 그리고 autoinflammation.

요약 하자면, 0.69 fg/mL, 2 단계 구성을 사용 하 여 캡처 구슬의 검출 한계는 팬-IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과와 코팅 0.3 mg/mL의 안티-IFN-α는 항 체 및 안티-IFN-α B 탐지 항 체 biotinylated의 비타민 b 복합체: 항 체 비에 30 개발 되었다. Biotinylated 탐지 항 체 및 SBG 사용 농도 했다 0.3 µ g/mL 및 150 오후, 각각. 이 매우 구체적인 분석 결과 모든 13 IFN-α 하위 감지 수 이며 IFNs의 다른 유형으로 교차 반응 하지 않습니다. 따라서, 그것은 식별 하 고 IFN-α의 각 개별 종 계량 가능, 모두 검출 될 수 있다 고 함께 13 다른 서브 클래스를 구성 하는 IFN-α에 대 한 총 농도 값을 주는 측정.
이 새로 개발된 된 분석 결과의 잠재적인 진단 가치 탐험, 플라즈마와 건강 한 개인에서 혈 청 IFN-α 단백질 측정 하 고 SLE와 JDM 고통 받아 환자에서 샘플과 비교 했다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 건강 한 통제에 비교 하 여 두 질환 동료에 IFN-α 단백질의 높은 수준은 발견 했다. 점선은 어떻게이 이렇게 것 이다 감지 하지 IFN-α 단백질이이 고기가이 cytokine의 알려진된 연결에도 불구 하 고 이러한 환자 그룹을 보여주는 기존의 상용 ELISA의 LOD를 나타냅니다. 또한, IFN-α는 분석 결과, 분석 결과의 매우 민감한 성격을 확인 1-10 fg/mL 사이 감지 레벨의 넓은 동적 범위를 보여주는 5 로그의 크기를 통해 측정할 수 수 있습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> 그림 7: 플라즈마와 동료 환자에서 혈 청 IFN-α 단백질의 정량화. 이 그림은 Rodero 외에서 수정 되었습니다. 2017. 건강 한 컨트롤에서 플라즈마 (n = 20)와 SLE 고통 받는 환자 (n = 72) 및 JDM (n = 43) 팬 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과 함께 테스트 했다. 분석 비교 사용 하 여 단방향 ANOVA 테스트 (Kruskal-월리스)와 던의 여러 그룹 간의 테스트를 수행 했습니다. 중간값은 그려져 있습니다. 점선 참조 인간의 안티-IFN-α ELISA의 LOD를 나타냅니다 (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>고려 사항</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. 항 체 쌍 선택</td>
			<td>대상 다른 epitopes</td>
			<td rowspan="3">표 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>높은 선호도</td>
		</tr>
<tr>
<td>K에에 빠른 / 느린 K에서
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. 항 체 쌍 방향</td>
			<td rowspan="3">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="3">그림 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. 항 체 농도 캡처</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: 검출기 항 체 비율</td>
		</tr>
<tr>
<td>5입니다. 2 대 3 단계 구성</td>
			<td>높은 신호: 배경 비율 조건 선택</td>
			<td>그림 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. 검출기 항 체 농도</td>
			<td rowspan="2">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="2">그림 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>8입니다. 특이성</td>
			<td>분을 평가</td>
			<td rowspan="2">그림 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9입니다. 감도</td>
			<td>(있는 경우)의 인식 평가</td>
		</tr>
<tr>
<td>10입니다. 재현성</td>
			<td>분석 결과 변화를 평가</td>
			<td>그림 5</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 개발 및 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화를 위한 단계의 요약. 이 표에서 개발 및 재현성 평가까지 항 체 쌍의 초기 선택에서 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화에 필요한 여러 단계를 요약 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 원</td>
			<td>8 H 1 (A)</td>
			<td>12 H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 팬-알파 항 체 선택. IC50 (ng/mL) 인터페론 자극 응답 요소 (ISRE)를 사용 하 여 결정-Luciferase 중화 분석 결과. 테이블의 모든 IFN-α 하위에 대 한 단일 분자 배열 분석 결과에 사용 되는 mAbs IC50 값을 보여 줍니다. 10000 HEK 293 MSR 셀 흰색 반 지역 96 잘 접시에 시드 되었고 50 ng 혼합 ISRE-반딧불 luciferase 기자와 Renilla luciferase 구문을 사용 하 여 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 리버스 페. Luciferase 표현 구문 내부 정규화 컨트롤로 제공 됩니다. 셀은 불필요 한 아미노산은 0.1 m m, 1mm 나트륨 pyruvate, 37 ° C에서 0.5% 태아 둔감 한 혈 청, 5% CO2 습도 분위기에서 보충 감소 혈 청 매체에 하룻밤 incubated 했다. 하룻밤 배양 한 후 세포 재조합 인간 IFN-α 또는 안티-IFN-α mAbs 또는 제어 1 h 37 ° c.에 대 한 preincubated 했다 IgG 없이 혼합물을 포함 하는 매체와 24 h에 대 한 자극 했다 자극의 24 h 후 듀얼 luciferase 기자 분석 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행 했다. «-» 결정 되지. Sifalimumab는 완전히 인간 면역 글로불린 g 1 κ 단일 클론 항 체에 바인딩하고; IFN-α의 대부분을 중화 하는 Rontalizumab은 IFN-α에 대 한 인간 답게 단일 클론 항 체 이다. 메이어 연구진이 2016 및 Rodero 그 외 여러분 에서 적응 2017입니다.
보충 표 1: 다양 한 항 체 방향, 구슬 및 biotinylation 비율에 항 체 농도 캡처. 서로 다른 두 가능한 구성을 테스트, 탐지 항 체 (A), 그리고로 캡처 항 체 및 안티-IFN-α B 안티-IFN-α A를 사용 하 여 반대 (B). IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 다른 캡처 항 체 농도 뿐만 아니라 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A) 비율 구성 모두에 대 한 테스트도 했다. 채도 (토). LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 2: 2 vs 3 단계 구성의 테스트. 2, 3-단계 구성으로 항 원 c IFNα-2를 사용 하 여 평가 됐다. AEB 값 뿐만 아니라 신호/배경 식량 (S/B) 표시 됩니다 두 조건에 대 한. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 3: 검출기와 SBG 농도 최적화. SBG의 3 개의 다른 농도 함께 biotinylated 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/mL)의 3 개의 다른 농도 (50, 150, 및 250 오후) 평가 했다. AEB 값 9 테스트 조건에 대 한 표시 됩니다. LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 4: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 감도 및 특이성. 구슬 값 당 평균 효소 IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, 그리고 IFN-γ 재조합 단백질은 시험 때 (A)의 IFN-α (B) 16 하위 함께 표시 됩니다. «-» 결정 되지. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 5: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 재현성. 모든 3 개의 독립적인 실행에 대 한 평균값 AEB 10.000 fg/mL의 농도를 표시 됩니다. «-» 결정 되지. 채도 (토). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 6: 단백질 경쟁 분석 결과. 구슬 값 당 평균 효소 테스트 하는 모든 조건에 대 한 표시 됩니다. 측정은 중복에서 수행 했다. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

development-validation-an-ultrasensitive-single-molecule-array

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K 조회수.  Institut Pasteur. 여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

비디오: Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...